Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol bằng phương pháp hóa miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ tt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN ĐỨC THỊNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG
KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MIỄN DỊCH
KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
Ngành:
Hóa phân tích
Mã số nghành: 62 44 29 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Tp. Hồ Chí Minh - 2017


Công trình được hoàn thành tại:
Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, ĐHQG Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học:
1.

HDC: GS.TS. CHU PHẠM NGỌC SƠN

2.

HDP: GS.TS. TRẦN LINH THƯỚC

Phản biện 1: PGS.TS. Hà Diệu Ly
Phản biện 2: TS. Đặng Chí Hiền
Phản biện 3: TS. Đặng Thanh Dũng
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Hà Diệu Ly
Phản biện độc lập 2: TS. Đặng Thanh Dũng
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà
nước họp tại
........................................................................................................
........................................................................................................
vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM
2. Thư viện trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM


MỞ ĐẦU
Chloramphenicol (CAP) là một kháng sinh thuộc nhóm 2A, có thể gây
bệnh suy tủy, là tác nhân có thể dẫn đến ung thư trên người. Hiện nay hầu
hết các quốc gia trên thế giới đều xếp CAP là loại kháng sinh không cho phép
có mặt trong thực phẩm ở bất kỳ hàm lượng nào.
Hiện nay CAP còn tồn dư trong các loại thực phẩm khác nhau như cá,
thịt, tôm, mật ong, thức ăn chăn nuôi…. Nó không những có trong các sản


phẩm sử dụng trong nước, mà còn hiện diện trong cả các sản phẩm xuất khẩu,
làm ảnh hưởng đến quá trình xuất khẩu các mặt hàng nông, lâm sản, đặc biệt
là các mặt hàng hải sản và mật ong.
Việc xác định CAP bằng kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ gặp nhiều khó
khăn và cho kết quả thiếu chính xác trên các nền mẫu có chứa nhiều tạp chất
như thức ăn chăn nuôi hay chứa hàm lượng đường cao như mật ong.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu
phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol bằng phương pháp hóa
miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ” nhằm mục tiêu sau: (1) Chế tạo
cột sắc ký ái lực miễn dịch chuyên biệt CAP (IAC-CAP) dùng cho bước
tách chiết CAP từ mẫu thử; (2) Đánh giá qui trình phân tích CAP bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ sử dụng cột IAC-CAP trong quá trình xử lý
mẫu. Kết quả thu được của luận án là tiền đề có thể sử dụng cột IAC-CAP
trong công tác giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm và kiểm tra chất lượng
thực phẩm xuất nhập khẩu.

1


Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chlorramphenicol (CAP)
1.1.1. Tổng quan về kháng sinh CAP
CAP được sinh từ vi khuẩn Streptomyces venezuelae. CAP có tác dụng
điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra như Mycoplasmas, Leptospira,
Spirochaetes, Rickettsiae, Chlamydiae, Treponema pallidum, Borrelia,
Pseudomonas

pseudomallei,

Actinomyces,

Haemophilus

influenza,

Streptococus pneumonia, Neisseria meningitides.
1.1.2. Độc tính của CAP
CAP có liên quan tới bệnh suy tủy xương và là tác nhân có thể gây ra một
số bệnh như ung thư (FAO, WHO, IARC). CAP được xếp loại tác nhân gây
ung thư với con người thuộc nhóm 2A.
1.2. Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm
1.2.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Tại Việt nam 100% các cơ sở chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản cho thấy
đều có sử dụng kháng sinh trong đó có nhiều kháng sinh cấm (CAP,
nitrofuran).
1.2.2. Tình hình tồn dư kháng sinh trong thực phẩm
Nhiều mẫu thực phẩm trong nước và xuất khẩu có chứa tồn dư kháng sinh
thuộc các nhóm tetracycline, sulfonamide, quinolone và các kháng sinh cấm
như nitrofuran CAP.
1.2.3. Ảnh hưởng đối với sức khỏe người sử dụng
Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có thể là tác nhân gây ung thư, gây
đột biến gen, gây ra các bệnh về máu trên người sử dụng. Gây hiện tượng
kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật gây bệnh và ô nhiễm môi trường.
2


1.2.4. Qui định về tồn dư kháng sinh trong thực phẩm
Kháng sinh tồn dư trong thực phẩm được các cơ quan kiểm tra thực phẩm
chia làm 02 nhóm A và B. Nhóm A là những kháng sinh không được phép
có mặt trong thực phẩm ở bất kỳ hàm lượng nào (zero tolerance), nhóm B là
những kháng sinh được phép có mặt trong thực phẩm nhưng không được quá
giới hạn qui định (MRL).
Chloraphenicol là kháng sinh không được phép có trong thực phẩm ở bất
kỳ hàm lượng nào.
1.2.5. Kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm
Kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, trong chăn nuôi bằng
các phương pháp phân tích có độ tin cậy cao.
1.3. Các phương pháp xác định tồn dư kháng sinh trong thực phẩm
1.3.1.

Xử lý mẫu

Quá trình xử lý mẫu có hai giai đoạn: chiết kháng sinh ra khỏi nền mẫu và
loại bỏ tạp chất nền.
1.3.2. Xác nhận sự hiện diện của kháng sinh
Kháng sinh được xác định bằng 02 nhóm phương pháp: phương pháp
sàng lọc như ức chế vi sinh vật, miễn dịch gắn enzyme (ELISA), sắc ký bản
mỏng (TLC), sắc ký khí, sắc ký lỏng; phương pháp xác nhận (phương pháp
tiêu chuẩn) là phương pháp sắc ký ghép khối phổ.
1.4. Phương pháp xác định tồn dư CAP trong thực phẩm
14.1. Tách chiết và làm sạch mẫu
Quá trình tách CAP từ mẫu thường được thực hiện với dung môi ethyl
acetate, hoặc dung dịch muối loãng và acetonitrile, chất béo được loại bỏ
bằng cách rửa với n-hexan và làm sạch bằng cột tách pha rắn. Các cột tách
pha rắn thường được sử dụng bao gồm cột pha ngược, hay sự kết hợp của các
cột pha đảo với các cột pha thường và trao đổi cation.
3


1.4.2. Xác nhận sự hiện diện của CAP
Phương pháp sàng lọc như: dựa trên sự ức chế vi khuẩn, hóa miễn dịch,
hoặc xác định trực tiếp CAP bằng phương pháp điện hóa, sắc ký khí hay sắc
ký lỏng hiệu năng cao.
Phương pháp xác nhận là phương pháp cung cấp rõ ràng tiêu chuẩn nhận
dạng và định lượng của chất phân tích. Để xác nhận CAP, phương pháp sắc
ký kết hợp với khối phổ (MS) là phù hợp. Phương pháp sắc ký lỏng ghép
khối phổ để xác định CAP thường sử dụng mảnh ion mẹ với m/z 321 và hai
mảnh ion con là mảnh m/z 257 và m/z 152.
1..4.3. Một số tồn tại của phương pháp phân tích CAP bằng sắc ký lỏng ghép
khối phổ
Các mẫu mật ong, thức ăn chăn nuôi khi xác định CAP gặp khó khăn khi
xác định CAP do hiệu ứng của nền mẫu. Các hiệu ứng nền này gây hiện
tượng suy giảm ion rất nhiều làm sai lệch kết quả phân tích xác định. Giới
hạn phát hiện trên các nền mẫu này thường cao, không đạt tiêu chuẩn qui
định. Vì vậy phải làm giàu nhiều lần do đó gia tăng hàm lượng tạp chất trong
dịch mẫu xử lý dẫn đến làm giảm khả năng hoạt động của thiết bị phân tích
(LC-MS/MS).
1.5. Chế tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch dùng cho bước làm sạch CAP
Để loại bỏ được hầu hết các tác nhân gây nhiễu được chiết cùng với CAP
từ mẫu, phải tăng tính chọn lọc của bước làm sạch CAP. Cột sắc ký ái lực
miễn dịch chuyên biệt (IAC – CAP) có thể giúp đạt được mục đích này.
Để chế tạo cột IAC - CAP việc đầu tiên là tạo kháng thể đặc hiệu với
CAP. Gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên có tính
sinh miễn dịch của CAP để tạo kháng thể kháng CAP. Sau đó thu kháng thể
và tinh chế. Kháng thể kháng CAP tinh chế được gắn lên pha rắn để tạo cột
4


Để chế tạo cột IAC - CAP việc đầu tiên là tạo kháng thể đặc hiệu với
CAP. Gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên có tính
sinh miễn dịch của CAP để tạo kháng thể kháng CAP. Sau đó thu kháng thể
và tinh chế. Kháng thể kháng CAP tinh chế được gắn lên pha rắn để tạo cột
sắc ký ái lực miễn dịch CAP (IAC – CAP).
1.5.1. Tạo kháng nguyên cộng hợp CAP - Protein có tính sinh miễn dịch
Chloramphenicl trọng lượng phân tử thấp (<1000 Da) không có khả năng
gây đáp ứng miễn dịch (hapten). Cộng hợp CAP succinate với BSA thành
cộng hợp CAP – BSA.
1.5.2. Tạo kháng thể kháng chuyên biệt CAP
Kháng thể kháng CAP được tạo bằng tiêm hỗn hợp cộng hợp CAP – BSA
và tá chất Freund với nhiều mũi tiêm trên lưng thỏ. Các mũi tiêm tiếp theo
được thực hiện cách nhau một tháng.
1.5.3. Tinh chế kháng thể
Kháng thể đa dòng kháng thu được từ huyết thanh có thể được tinh chế
bằng các phương pháp: tinh chế phân đoạn bằng cách tủa với amonium
sulfate, tinh chế ái lực bằng các protein vỏ vi khuẩn hay lectin,
1.5.4. Các bước trong qui trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch
Cột sắc ký ái lực (IAC) được chế tạo qua 02 bước: chọn lựa pha rắn
thường là các gel agaroseose, cellulose hay siliga; cố định kháng thể lên pha
rắn bằng các liên kết đồng trị.
1.5.5. Các thông số đánh giá chất lượng của cột sắc ký ái lực miễn dịch
Cột sắc ký ái lực (IAC) được đánh giá qua các thông số: mật độ gắn, dung
lượng cột, độ thu hồi, điều kiện dung ly, độ chọn lọc, khả năng chéo.
1.5.6. Các thông số đánh giá qui trình phân tích bằng sắc ký khối phổ

5


Qui trình phân tích CAP băng sắc ký lỏng khối phổ được đánh giá qua
các thông số: số lượng ion, độ chọn lọc, độ biến thiên thời gian lưu, hiệu suất
thu hồi, tỷ lệ ion, giới hạn phát hiện.
1.6. Tình hình nghiên cứu cột IAC – CAP trong và ngoài nước
Hiện nay trong nước cũng như thế giới chưa có nghiên cứu nào cho việc
kết hợp cột IAC với sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích kháng sinh CAP.
Chương 2- VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng thuộc Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Thực
phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế Công cộng Thành phố Hồ Chí Minh đều
có độ chính xác và tin cậy cao.
2.2. Vật liệu - Hóa chất
Các chất chuẩn, hóa chất, sinh phẩm được mua từ các hãng tin cậy (GE
Healthcare, Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu hóa
phân tích.
2. 3. Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu gồm 03 chủng loai là mẫu cá, mật ong và thức ăn chăn
nuôi. Mẫu cá mật ong được mua tại siêu thị, còn mẫu thức ăn chăn nuôi được
mua từ của hàng thức ăn chăn nuôi.
2.4. Dung dịch chuẩn – Thuốc thử
Dung dịch chuẩn, thuốc thử được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm.
2.5. Động vật thí nghiệm
Thỏ dùng gây miễn dịch với kháng nguyên CAP – BSA có trọng lượng
khoảng 2 kg, được theo dõi 1 tháng trước khi gây miễn dịch.

6


2.6. Chế tạo cột IAC - CAP
2.6.1. Chế tạo kháng nguyên CAP – BSA
Chế tạo kháng nguyên CAP- BAS từ CAP succinate và BSA với tác nhân
trung gian là EDC.
2.6.2. Kiểm tra sự hiện diện của CAP trong CAP – BSA
Sự hiện diện của CAP trong CAP- BSA được kiểm tra bằng kỹ thuật
ELISA gián tiếp.
2.6.3. Kiểm tra lượng BSA trong CAP – BSA
Hàm lượng BSA trong cộng hợp IAC - CAP được xác định bằng phương
pháp Bradford.
2.6.4. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ bằng CAP - BSA
Thỏ được gây miễn dịch bằng kháng nguyên CAP- BSA kết hợp với tá
chất Freund.
2.6.5. Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng BSA
Kháng thể thỏ kháng BSA được xác định bằng kỹ thuật khuếch tán kép
trên thạch.
2.6.6. Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng CAP
Kháng thể kháng CAP được xác định bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp.
2.6.7. Tinh chế kháng thể trong huyết thanh thỏ bằng muối ammonium
sulfate bão hòa
Huyết thanh thỏ thu được từ quá trình gây miễn dịch với CAP- BSA được
tinh chế bằng ammonium sulfate để loại bỏ các protein không đặc hiệu.
2.6.8. Loại muối khỏi hỗn hợp kháng thể bằng màng thẩm tích
Kháng thể sau khi tủa bằng amonium sulfate được loại bỏ muối amonium
sulfate bằng màng thẩm tích.
2.6.9. Kiểm tra độ sạch của hỗn hợp kháng thể
7


Độ sạch của kháng thể sau khi tinh chế được đánh giá bằng phương pháp
điện di trên gel polyacrylamide kết hợp với sodium dodecyl sulfate (SDSPAGE).
2.6.10. Loại bỏ kháng thể kháng BSA trong hỗn hợp kháng thể
Kháng thể kháng BSA trong hỗn hợp kháng thể được loại bỏ bằng cột sắc
ký ái lực miễn dịch gắn BSA.
2.6.11. Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể kháng BSA
Hỗn hợp kháng thể sau khi đã được loại bỏ kháng thể kháng BSA được
kiểm tra bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch.
2.6.12. Kiểm tra khả năng tương tác CAP của kháng thể
Khả năng tương tác với CAP của kháng thể thỏ sau tinh chế được xác
định bằng kỹ thuật LC MS/MS.
2.6.13. Cộng hợp kháng thể kháng CAP vào gel Sepharose CL-4B-CNBr
Kháng thể thỏ kháng CAP được gắn vào gel Sepharose-CNBr qua nhóm
amin bậc một trên phân tử kháng thể.
2.6.14. Tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch chuyên biệt CAP (IAC-CAP)
Cột IAC – CAP được tạo bằng cách nén gel Sepharose đã gắn kháng thể
kháng CAP vào cột sắc ký rỗng.
2.7. Đánh giá chất lượng cột IAC – CAP
2.7.1. Đánh giá khả năng tương tác CAP
Cột IAC – CAP được đánh giá khả năng tương tác với CAP qua các thông
số: hiệu suất thu hồi, dung lượng cột và khả năng tương tác với các kháng
sinh nhóm amphenicol khác.
2.7.2. Đánh giá hiệu quả loại bỏ hiệu ứng nền
Hiệu quả loại bỏ hiệu ứng nền (matrix effect) được đánh giá trên dịch nền
mẫu sau khi qua cột IAC - CAP bổ sung thêm chuẩn CAP. Các thông số đánh
8


giá bao gồm: độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ biến thiên tỷ lệ ion, hệ số thu
hồi, độ biến thiên thời gian lưu và giới hạn phát hiện.
2.8. Đánh giá qui trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP
Qui trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP trong xử lý mẫu được
đánh giá bằng các mẩu thử bổ sung chuẩn CAP. Các mẫu này được xử lý
bằng cột IAC – CAP. Các thông số đánh giá: khoảng tuyến tính, độ chọn lọc,
biến thiên tỷ lệ ion, hệ số thu hồi, độ biến thiên thời gian lưu, giới hạn phát
hiện.
2.9. So sánh qua trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP với MIP
– CAP
So sánh giữa cột IAC – CAP với cột MIP – CAP trong việc xử lý mẫu
phân tích CAP bằng LC MS/MS. Các thông số so sánh: biến thiên tỷ lệ ion,
hệ số thu hồi, độ biến thiên thời gian lưu.
2.10. Qui trình xử lý mẫu
2.10.1. Qui trình xử lý mẫu bằng cột IAC – CAP
2.10.2. Qui trình xử lý mẫu bằng cột MIP – CAP
2.11. Phương pháp phân tích CAP bằng khối phổ
2.11.1. Phân tích bằng khối phổ một lần LC/MS
2.11.2. Phân tích bằng khối phổ hai lần LC-MS/MS
2.12. Sơ đồ nghiên cứu
2.13. Nơi thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại Viện Y tế Công cộng Tp.HCM

9


Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Chế tạo cột IAC - CAP
3.1.1. Tạo cộng hợp CAP – BSA
Trong quá trình tạo cộng hợp chúng tôi nhận thấy không xảy ra phản ứng
kết tụ (aggregate) giữa các protein (BSA).

Hình 3.1. Sự hiện diện của CAP trong CAP - BSA trên ELISA
Kết quả kiểm tra trên ELISA cho thấy cộng hợp CAP - BSA có mật độ
quang giảm dần theo độ pha loãng của cộng hợp từ 101 đến 104. Như vậy có
sự hiện diện của CAP trong sản phẩm cộng hợp CAP - BSA (Hình 3.1).
Kết quả kiểm tra lượng hàm lượng BSA trong cộng hợp cho thấy hiệu
suất của quá trình cộng hợp từ 74,1% - 84,0 % (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Hiệu suất cộng hợp của BSA với CAP
Loạt

Lượng BSA

Tổng lượng

ban đầu

BSA trong

(mg)

cộng hợp (mg)

(%)

CAP-BSA1

10

8,36

83,6

CAP-BSA2

10

7,41

74,1

CAP-BSA3

10

8,40

84,0

10

Hiệu suất


Sau khi kiểm tra sử dụng cộng hợp CAP- BSA3 để gây đáp ứng miễn
dịch trên thỏ thí nghiệm.
3.1.2. Tạo kháng huyết thanh thỏ kháng CAP

Hình 3.3. Phản ứng khuếch tán kép trên thạch giữa BSA và huyết thanh thỏ
Thỏ sau khi được gây miễn dịch bằng CAP – BSA, đầu tiên được kiểm
tra khả năng đáp ứng miễn dịch với BSA bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên
thạch. Kết quả kiểm tra cho thất toàn bộ các thỏ đều có đáp ứng miễn dịch
(Hình 3.3).

Hình 3.4. Đáp ứng miễn dịch đối với CAP qua các lần tiêm
11


Sau các mũi tiêm nhắc lại tiếp tục kiểm tra đáp ứng miễn dịch với CAP
bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kết quả cho thấy khả năng bắt kháng nguyên
CAP của kháng thể đạt cực đại sau mũi tiêm thứ 5 và bắt đầu giảm dần ở mũi
tiêm thứ 6 (Hình 3.4).
Sau mũi tiêm thứ 6 toàn bộ các thỏ được lấy máu và tách huyết thanh
3.1.3. Tinh chế kháng huyết thanh thỏ kháng CAP
Huyết thanh được loại bỏ các protein không đặc hiệu bằng tủa phân đoạn
với dung dịch muối amoni sulphat bão hòa, sau đó tiếp tục loại kháng thể
kháng BSA bằng cột sắc lý ái lực miễn dịch gắn BSA.
Kết quả điện di SDS - PAGE cho thấy so với huyết thanh ban đầu (cột 1)
huyết thanh sau tủa phân đoạn với dung dịch muối amoni sulphat bão hòa
(cột 2) đã loại bỏ hầu hết albumin và các protein tạp chỉ còn lại kháng thể
(IgG) (Hình 3.5).

Hình 3.5. Kiểm tra độ sạch bằng SDS-PAGE
Sau khi loại bỏ các protein tạp, hỗn hợp kháng thể (kháng thể kháng CAP
và kháng thể kháng BSA) tiếp tục được loại bỏ kháng thể kháng BSA bằng
cột sắc ký ái lực gắn BSA. Kết quả loại kháng thể kháng BSA được kiểm tra
bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch. Kết quả kiểm tra cho thấy đã loại
bỏ hoàn toàn kháng thể kháng BSA (Hình 3.7).
12


1, Dịch trước cột
2, Dịch sau cột
3, Kháng nguyên BSA

Hình 3.7. Kiểm tra kháng thể kháng BSA bằng khuếch tán kép
Sau khi loại bỏ kháng thể kháng BSA, chỉ còn lại kháng thể kháng CAP.
Kháng thể này được kiểm tra khả năng gắn kết với CAP. Kết quả kiểm tra
bằng LC MS/MS cho thấy kháng thể sau tinh chế có khả năng tương tác tốt
với CAP (Hình 3.8).

Chuẩn CAP

Dịch tương tác của kháng thể với CAP

Hình 3.8. Khả năng tương tác CAP của kháng thể sau tinh chế
3.1.4. Tạo cột IAC - CAP
Lượng kháng thể gắn cộng hóa trị lên gel Sepharose là một thông số quan
trọng có ý nghĩa quyết định đến khả năng gắn với kháng nguyên sau này của
gel ái lực. Kháng thể và gel ái lực đều là những vật liệu đắt tiền nên ta cần
được tối ưu hóa lượng kháng thể và lượng gel Sepharose sử dụng. Khảo sát
cộng hợp kháng thể kháng CAP lên gel với 3 nồng độ 5, 10 và 15 mg kháng
thể / ml gel. Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ tối ưu để gắn kháng thể kháng
CAP lên gel Sepharose-CL4B CNBr là 10 mg kháng thể / ml gel.

13


Hình 3.10. Cột sắc ký ái lực miễn dịch IAC – CAP
Sau khi tối ưu được hàm lượng gắn giữa kháng thể kháng CAP và gel ái
lực (10 mg kháng thể kháng CAP / ml gel), chúng tôi tiến hành cộng hợp
kháng thể kháng CAP vào gel Sepharose CL – 4B CNBr để tạo gel ái lực gắn
kháng thể kháng CAP.
Sau khi có được gel Sepharose đã gắn kháng thể kháng CAP, chúng tôi
tiến hành rửa gel loại bỏ các hóa chất tồn dư của quá trình cộng hợp. Gel
Sepharose gắn kháng thể sẽ được nén vào cột sắc ký rỗng tạo cột IAC – CAP
(Hình 3.10).
3.2. Đánh giá chất lượng cột IAC-CAP
3.2.1. Đánh giá khả năng gắn CAP của cột IAC - CAP
a. Hiệu suất thu hồi
Qua khảo sát cho thấy cột IAC - CAP có khả năng bắt giữ tốt CAP, kể cả
ở hàm lượng CAP thấp (1ng); khả năng thu hồi CAP của các cột là 92,4%
(hàm lượng CAP nạp cột là 10 ng) và 86,6% (hàm lượng CAP nạp cột là 1
ng), tương ứng với CV% là 1,98% và 5,18% (<10%). Khả năng gắn CAP
của IAC - CAP (>85%), đáp ứng yêu cầu về hiệu suất thu hồi cho phương
pháp phân tích xác định dư lượng kháng sinh, nhất là các dư lượng ở hàm
lượng thấp của tiêu chuẩn Châu Âu (từ 70% đến 120%).
b. Dung lượng cột
Dung lượng liên kết của cột IAC - CAP được xác định bằng cách cho qua
14


cột một lượng dư CAP (1000 ng). Sau đó tiến hành dung ly phần CAP lưu
giữ trên cột. Dịch dung ly được xác định và phân tích bằng LC-MS/MS.
Kết quả thực nghiệm với 10 cột IAC-CAP cho thấy dung lượng cột IAC
- CAP là khoảng 153,37 ± 10,32 ng
c. Khả năng tương tác với các kháng sinh nhóm amphenicol khác
Kháng thể gắn cột là kháng thể đa dòng, do đó cột IAC - CAP ngoài khả
năng tương tác với CAP (CAP) còn có thể tương tác với florfenicol (FF) và
thiamphenicol (TAP). Kết quả khảo sát cho thấy cột IAC – CAP có khả năng
tương tác với cả hai kháng sinh khác thuộc họ amphenicol là florfenicol và
thiamphenicol. Khả năng tương tác với florfenicol có hiệu suất thu hồi là
90,73 ± 1,65 % và với thiamphenicol là 84,29 ± 1,72 %.
3.2.2. Đánh giá khả năng loại hiệu ứng nền của cột IAC - CAP
Để thực hiện đánh giá khả năng loại hiệu ứng nền, chúng tôi tiến hành xử
lý các mẫu cá, mật ong và thức ăn chăn nuôi bằng cột IAC – CAP. Dịch nền
mẫu sau khi xử lý bằng cột IAC – CAP được bổ sung thêm chuẩn CAP để
có nồng độ 0,5; 1; 2;5 là 10 ng/ml. Sau khi bổ sung chuẩn dịch nền mẫu được
phân tích bằng LC-MS/MS.
a. Độ chọn lọc
Chloramphenicol

Chloramphenicol

m/z 152

m/z 257





m/z 152

m/z 257

Hình 3.12. Sắc ký đồ dịch nền mẫu cá sau khi qua cột IAC - CAP
15


Chloramphenicol

Chloramphenicol

m/z 152

m/z 257

Mật ong

Mật ong

m/z 257

m/z 152

Hình 3.13. Sắc ký đồ dịch nền mẫu mật ong
sau khi qua cột IAC - CAP

Chloramphenicol

Chloramphenicol

m/z 152

m/z 257

Thức ăn

Thức ăn

chăn nuôi

chăn nuôi

m/z 152

m/z 257

Hình 3.14. Sắc ký đồ dịch nền mẫu thức ăn chăn nuôi
sau khi qua cột IAC - CAP
Kết quả khảo sát độ chọn lọc trên 03 nền mẫu cho thấy: tại thời gian lưu
của tín hiệu chuẩn CAP trên các dịch nền mẫu sau khi qua cột IAC – CAP
hoàn toàn không có tín hiệu nhiễu (Hình 3.12, 3.13, 3.14).
16


b. Độ tuyến tính
Kết quả khảo sát qua bổ sung lượng CAP từ 0,5 - 10 ng cho thấy: có sự
tương quan tuyến tính với hệ số tương quan cao (R20,99). Hệ số tương quan
cao không chỉ cho phép xác định chính xác hàm lượng CAP trong mẫu mà
còn có thể xây dựng đường chuẩn trên dịch nền mẫu khi cần.
c. Tỷ lệ ion
Qua khảo sát cho thấy, tỷ lệ ion của mẫu cá từ 0,63 đến 0,76, mật ong từ
0,64 đến 0,71 và thức ăn chăn nuôi từ 0,63 đến 0,70 đều nằm trong khoảng
tỷ lệ ion của dung dịch chuẩn CAP (0,55 – 0,82). Độ biến thiên tỷ lệ ion của
mẫu cá từ 0,81% đến 10,86 %, mật ong từ 0,65% đến 6,65 % và thức ăn chăn
nuôi từ 0,65% đến 8,11 %, độ biến thiên tỷ lệ ion này hoàn toàn phù hợp theo
qui định châu Âu (<20%).
d. Hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi tín hiệu CAP trên dung dịch nền mẫu của hai ion m/z
257 và m/z 152 cho thấy quá trình xử lý mẫu bằng cột IAC – CAP đã loại bỏ
tốt các tạp chất gây hiệu ứng nền. Hiệu suất thu hồi tín hiệu CAP trong các
dung dịch nền mẫu sau khi xử lý đều lớn hơn 80% (chỉ có 01 mẫu thức ăn
chăn nuôi là nhỏ hơn 80 %).
Kết quả khảo sát trên ion định lượng (m/z 152) cho thấy nền mẫu cá sau
khi qua cột IAC - CAP đã loại bỏ tốt các tạp chất, hiệu suất thu hồi trên nền
mẫu này dao động trong khoảng từ 90% đến 100%. Đối với dịch nền mẫu
mật ong sau khi xử lý bằng cột IAC - CAP không thấy chứa các tạp chất gây
suy giảm ion nhưng có hiện tượng khuếch đại ion nhẹ. Hiệu suất thu hồi tín
hiệu trên nền mật ong ở 4 nồng độ (từ 105,00% đến 125,67%). Riêng đối với
nền mẫu thức ăn chăn nuôi thì hiệu suất thu hồi giảm hẳn chỉ còn từ 71,71%
đến 90,19%. Như vậy đối với nền mẫu thức ăn chăn nuôi cột IAC - CAP tuy
đã loại bỏ được nhiều yếu tố gây hiệu ứng nền, nhưng vẫn còn một số yếu tố
sau khi xử lý gây hiện tượng suy giảm ion. Hiệu suất thu hồi sau khi qua cột
17


IAC - CAP trên các nền mẫu cá, mật ong, thức ăn chăn nuôi mặc dù có nền
mẫu cao, nền mẫu thấp nhưng đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn quy định Châu
Âu (70% - 120%). Độ biến thiên (CV%) của các mẫu khảo sát đều nhỏ hơn
10%, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn
quy định (< 20%).
e. Độ biến thiên thời gian lưu
Độ biến thiên thời gian lưu trong các mẫu kiểm tra dao động từ 0,22 %
đến 1,86 % ; đều đạt tiêu chuẩn qui định (< 2,5 %).
g. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Dựa theo đường chuẩn khảo sát trên nền mẫu bổ sung chuẩn với các nồng
độ 0,5; 1; 2; 5 và 10 ng và độ lặp lại của 5 mẫu ở nồng độ thấp nhất (0,5 ng),
chúng tôi tính được giới hạn phát hiện trong các nền mẫu.
Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) cho thấy: trên nền mẫu cá
LOD của ion m/z 257 là 0,05 ng/g và ion m/z 152 là 0,03 ng/g; trên nền mẫu
mật ong LOD của ion m/z 257 là 0,03 ng/g và ion m/z 152 là 0,01 ng/g; trên
nền mẫu thức ăn chăn nuôi LOD của ion m/z 257 là 0,05 ng/g và ion m/z 152
là 0,06 ng/g.
3.2.3. Độ ổn định của cột
Theo dõi độ ổn định

Hiệu suất thu hồi (%)

120
90
60
30
0
0

3

6

9

12 15
Tháng

18

21

24

Hình 3.18. Độ ổn định của cột IAC - CAP theo thời gian
18


Độ ổn định của cột được khảo sát thông qua hiệu suất thu hồi CAP của
cột IAC-CAP vào các thời điểm cách nhau 3 tháng trong vòng 2 năm.. Sau
thời gian bảo quản 2 năm, hiệu suất thu hồi của cột IAC-CAP với 100 ng
CAP vẫn ≥ 90% (Hình 3.18).
3.3. Đánh giá qui trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP trong xử
lý mẫu
3.3.1. Độ chọn lọc
Kết quả khảo sát cho thấy không xuất hiện các pic tạp tại thời gian lưu
của chuẩn CAP. Như vậy quá trình xử lý mẫu đã loại bỏ hoàn toàn các yếu
tố gây nhiễu trong nền mẫu.
3.3.2. Khoảng tuyến tính

Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng nồng
độ chuẩn CAP và diện tích pic
19


Khoảng tuyến tính của dung dịch chuẩn CAP được khảo sát với các nồng
độ chuẩn ( 0,5; 1; 2; 5; 10 và 20 ng CAP /ml). Kết quả khảo sát ở cho thấy
có mối tương quan tuyến tính cao (R > 0,99) giữa tín hiệu ion khảo sát và
nồng độ CAP (Hình 3.19).
3.3.3. Độ biến thiên thời gian lưu
Kết quả khảo sát độ biến thiên thời gian lưu trên nền mẫu cho thấy: trên
nền mẫu cá thời gian lưu của CAP từ 1,79 đến 1,87 phút với độ biến thiên
thời gian lưu từ 0,00% đến 2,19 %; trên nền mẫu mật ong thời gian lưu từ
1,80 đến 1,88 phút với độ biến thiên thời gian lưu từ 0,00% đến 2,17 và trên
nền mẫu thức ăn chăn nuôi thời gian lưu từ 1,76 đến 1,83 phút với độ biến
thiên thời gian lưu từ 0,00% đến 2,22 %. Độ biến thiên thời gian lưu hoàn
toàn đáp ứng các qui định của châu Âu đặt ra (< 2,5 %).
3.3.4. Hiệu suất thu hồi và độ biến thiên
Kết quả khảo cho thấy: với lượng CAP bổ sung 1, 5 và 10 ng/g mẫu cá
cho hiệu suất thu hồi từ 89,76% đến 95,43 % và có độ biến thiên trong
khoảng 1,90% đến 3.37 %. Trên nền mẫu mật ong trong cùng khoảng nồng
độ khảo sát, cho hiệu suất thu hồi từ 88,39% đến 99,54% và độ biến thiên
trong khoảng 2,04 đến 4,81%. Trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi hiệu suất thu
hồi từ 65,63 đến 71,08 % và độ biến thiên từ 5,42 đến 9,58 %.
3.3.5. Tỷ lệ ion
Tỷ lệ ion của các nồng độ bổ sung trên 03 nền mẫu đều nằm trong khoảng
tỷ lệ ion của chuẩn. Độ biến thiên tỷ lệ ion của CAP trên nền mẫu cá từ 0,19
– 6,47 %, mật ong từ 0,13 – 13,79 % và thức ăn chăn nuôi từ 0,67 – 15,25 %
đều nhỏ hơn mức qui định cho phép (< 20 %)

20


3.3.6. Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện được xác định khi bổ sung chuẩn trên mẫu cá và mật
ong với hàm lượng 0,2 ng CAP / gram mẫu; mẫu thức ăn chăn nuôi bổ sung
chuẩn với hàm lượng 1 ng CAP/g mẫu.

Hình 3.20. Tín hiệu CAP bổ sung trên nền mẫu
Qua kiểm tra cho thấy đối với ion xác định m/z 257 có khả năng phát hiện
lượng CAP nhỏ hơn 0,1 ng/g trên nền mẫu cá, mật ong và nhỏ hơn 0,2 ng/g
trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi. Với ion m/z 152 có khả năng phát hiện lượng

21


CAP nhỏ hơn 0,03 ng/g trên mẫu cá, mật ong và 0,1 ng/g trên mẫu thức ăn
chăn nuôi (Hình 3.20).
3.4. So sánh qui trình phân tích CAP bằng phương pháp LC-MS/MS sử
dụng cột IAC - CAP với cột MIP - CAP
So sánh việc sử dụng cột IAC-CAP và một cột tách chiết pha rắn chọn
lọc khác là cột MIP – CAP để xử lý mẫu. Việc chọn cột in dấu phân tử (MIP
- CAP) làm cột so sánh, vì đây là cột có tính chọn lọc cao tương tự như cột
IAC. Thử nghiệm so sánh các giá trị phân tích gồm hệ số thu hồi, độ biến
thiên, tỷ lệ ion trên 03 loại mẫu bao gồm mẫu cá, mẫu mật ong và mẫu thức
ăn chăn nuôi. Các mẫu này được bổ sung CAP với hàm lượng 1 ng/g và 10
ng/g.
Kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt lớn khi sử dụng cột IACCAP hay cột MIP - CAP trong xử lý những nền mẫu thông thường, đơn giản
như nền mẫu cá. Cả hai loại cột đều cho khả năng loại bỏ các tạp chất trong
nền mẫu cũng như giữ lại phần lớn CAP trong mẫu (hiệu suất thu hồi khoảng
90%-95%).
Ở nền mẫu mật ong, hiệu suất thu hồi của cột IAC - CAP cao hơn nhiều
so với cột MIP – CAP (90% – 95% và 70% – 75%).
Đối với nền mẫu chứa nhiều thành phần phức tạp như mẫu thức ăn chăn
nuôi cột IAC – CAP vẫn cho khả năng gắn CAP vượt trội so với cột MIP –
CAP. Hiệu suất thu hồi của 02 cột (65% – 70% và 55%).
Độ biến thiên, tỷ lệ ion của hai nền mẫu cũng không có sự khác biệt nhiều
và đều dưới 20%. Các thông số so sánh trên hai nền mẫu của cột IAC - CAP
với MIP - CAP qua thử nghiệm đều đáp ứng các tiêu chuẩn quy định của
Châu Âu .
22


Chương 4- KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
- Đã tạo được cộng hợp CAP - BSA có tính sinh miễn dịch tốt trên thỏ thí
nghiệm.
- Đã chế tạo được kháng thể thỏ kháng CAP có độ tinh sạch cao và khả
năng tương tác tốt với CAP.
- Cột IAC - CAP chế tạo từ kháng thể thỏ kháng CAP có khả năng tương
tác tốt với CAP. Qua khảo sát cho thấy cột IAC - CAP có khả năng loại bỏ
tốt các hiệu ứng của nền mẫu cá, mật ong và thức ăn chăn nuôi. Cột IAC CAP vẫn giữ được tính ổn định sau 2 năm.
- Quy trình phân tích CAP với việc sử dụng cột IAC - CAP để xử lý các
mẫu cá, mật ong, thức ăn chăn nuôi có khoảng tuyến tính, hiệu suất thu hồi,
độ biến thiên thời gian lưu, độ biến thiên tỷ lệ ion, giới hạn phát hiện đạt yêu
cầu quy định theo tiêu chuẩn của Châu Âu.
- Kết quả so sánh việc sử dụng cột IAC - CAP và cột MIP - CAP trong
giai đoạn xử lý mẫu phân tích CAP cho kết quả tương đương.
4.1. Đề nghị
- Sử dụng cột IAC - CAP đễ phân tích CAP trên một số nền mẫu thực
phẩm khác như thịt, sữa, tôm và các thực phẩm đã qua chế biến.
- Ứng dụng cột IAC - CAP phân tích đồng thời cả 03 loại kháng sinh
thuộc nhóm amphenicol (chloramphenicol, florfenicol và thiamphenicol)

23


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×