Tải bản đầy đủ

Tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thạch tùng răng cưa tại đà lạt, việt nam có khả năng sinh tổng hợp huperzine a

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------o0o---------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài :
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI NẤM NỘI SINH PHÂN LẬP
TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA H N Ố TẠI ĐÀ LẠT –
VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPERZIN A

Giáo viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ MINH THÀNH
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ LAN ANH
Lớp

: KSCNSH 1301

HÀ NỘI – 2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

---------------o0o---------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài :
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI NẤM NỘI SINH PHÂN LẬP
TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA H N Ố TẠI ĐÀ LẠT –
VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPERZIN A

Giáo viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ MINH THÀNH
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ LAN ANH
Lớp

: KSCNSH 1301

HÀ NỘI – 2017


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ 4
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... 5
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 7
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 8
1. Tính cấp thiết ........................................................................................... 8
2. Mục tiêu đề tài: ........................................................................................ 9
3. Nội dung đề tài: ....................................................................................... 9
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN ........................................................................ 11
1.1

Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) ......... 11

1.1.1

Lịch sử nghiên cứu ....................................................................... 11

1.1.2



Mô tả cây ...................................................................................... 12

1.1.3

Phân bố......................................................................................... 12

1.2

Tổng quan hoạt chất Huperzine A .................................................. 13

1.2.1 Giới thiệu về Huperzine A .............................................................. 13
1.2.2 Cơ chế hoạt động của Huperzine A ............................................... 14
1.3

Tổng quan về vi nấm nội sinh trong thực vật ................................ 14

1.3.1

Khái niệm vi nấm nội sinh trong thực vật .................................... 14

1.3.2

Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật ................................... 15

1.3.3

Ứng dụng của vi nấm nội sinh ..................................................... 16

1.4

Tình hình nghiên cứu cây Thạch từng răng cưa sinh tổng hợp

Huperzine A trong nước và trên thế giới....................................................... 18
1.4.1

Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 18

1.4.2

Các nghiên cứu trong nước .......................................................... 20

1.5

Nghiên cứu định danh vi nấm ......................................................... 20

1.5.1

Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống ....... 21

1.5.2

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.......................... 23

1.6

hư ng ph p

Viện Đại học Mở Hà Nội

c định c c hoạt chất .............................................. 28
1

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

1.6.1. Phương pháp đo quang phổ UV- VIS .............................................. 28
1.6.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography) ....................................................................................... 32
PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ HƯƠNG HÁ NGHIÊN CỨU .................. 35
2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu................................... 35
2.1.1 Thời gian và địa điểm ..................................................................... 35
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 35
2.2 Hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm ............................................... 35
2.2.1 Hóa chất: ........................................................................................ 35
2.2.2 Môi trường nuôi cấy và dung dịch.................................................. 35
2.2.2.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi nấm nội sinh ........................ 35
2.2.2.2 Dung dịch .................................................................................... 36
2.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm ................................................................ 36
2.3

hư ng ph p nghiên cứu ................................................................... 37

2.3.1 Phương pháp hoạt hóa và thu sinh khối vi nấm ............................. 37
2.3.2 Phương pháp tách chiết .................................................................. 37
2.3.3 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp Huperzine A trong
vi nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng cưa ............................................ 38
2.3.4 Định danh vi nấm nội sinh bằng phương pháp sinh học phân tử ... 39
2.3.4 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS ...................... 40
2.3.5 Định danh vi nấm nội sinh bằng phương pháp truyền thống .......... 42
PHẦN 3: KẾT QUẢ ...................................................................................... 43
3.1

Kết quả hoạt hóa và nhân nuôi c c chủng vi nấm nghiên cứu .... 43

3.2

Kết quả

c định hả năng sinh tổng hợp Huperzine A của c c

chủng nấm nghiên cứu............................................................................... 46
3.2.1

Kết quả xác định ằng phương pháp UV – VIS ........................... 46

3.2.2 Kết quả xác định hoạt chất Huperzine A trong dịch chiết nấm bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC. ................................... 52
3.3 Kết quả định danh chủng vi nấm sinh tổng hợp Huperzine A ....... 54
Viện Đại học Mở Hà Nội

2

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

3.3.1 Kết quả định danh theo phương pháp truyền thống ....................... 54
3.3.2 Kết quả định danh các chủng nấm nội sinh bằng phân tích trình tự
vùng rADN – ITS ....................................................................................... 55
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 59
4.1 Kết luận ................................................................................................. 59
4.2 Kiến nghị .............................................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 60

Viện Đại học Mở Hà Nội

3

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

BlAST

Basic Local Alignment Search Tool

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ETS

External transcribed spacer

HTKL

Hình thái khuẩn lạc

ITS

Internal transcribed spacer

LSU

Large subunit

NCBI

National Center for Biotechnology Informatic

PDA

Potato Dextrose Agar

PCR

Polymerase chain reaction

rADN

Ribosomal acid deoxyribonucleic

rARN

Ribosomal acid ribonucleic

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SSU

Small subunit

Viện Đại học Mở Hà Nội

4

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01
DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng cưa[6]........................................................... 12
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Huperzine A .................................................. 13
Hình 1.3 Một phần thuộc nhóm nấm VAM( Glomus sp), với các sợi nấm và
các túi khí trong rễ cây [12] ............................................................................ 15
Hình 1.4: sơ đồ cấu trúc vùng ITS – rADN. ................................................... 26
Hình 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 1 . 45
Hình 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 2 . 46
Hình 3.3: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 3 . 46
Hình 3.4: Hình ảnh một số dịch chiết nấm của một số chủng vi nấm nội sinh
từ cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt .............................................. 47
Hình 3.5: Hình ảnh sinh khối (bên trái) và dịch chiết (bên phải) thu được từ
M1.10 ....................................................................................................................... 50
Hình 3.6: Hình ảnh phổ khối phổ của chủng nấm M1.10(a) và chất chuẩn
Huperzine A trong dung môt methanol (b) ..................................................... 51
Hình 3.7: Hình ảnh so sánh khối phổ của chủng vi nấm nội sinh M1.10 và
mẫu chất chuẩn HupA trong dung môi methanol. ......................................... 51
Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLV ( UV 210, 230, 310 nm ) của chất chỉ thị
Huperzine A (A) và M1.10 (B). ...................................................................... 52
Hình 3.9: Khuẩn lạc của chủng vi nấm M1.10 ............................................... 54
Hình 3.10: Ảnh vi hình thái của chủng nấm nội sinh M1.10 .......................... 54
Hình 3.11: Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR chủng vi nấm M1.10 trên gel
agarose (1: Marker , 2: Chủng M1.10)............................................................ 56
Hình 3.12: Kết quả giải trình tự gen của chủng nấm M1.10 ......................... 56

Viện Đại học Mở Hà Nội

5

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả hoạt hóa các chủng vi nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng
cưa phân bố tại Đà Lạt, Việt Nam................................................................... 43
Bảng 3.2: Kết quả đo quang phổ UV – VIS của 109 chủng vi nấm nghi n c u ...48
Bảng 3.3: Bảng thời gian lưu và phân tách các peak trong sắc ký đồ của chất
chuẩn Huperzine A (A) và chủng vi nấm M1.10 (B) ..................................... 53
Bảng 3.4: M c độ tương đồng gen ITS1 của chủng nấm khi so sánh với trình
tự các chủng trên GenBank. ............................................................................ 57

Viện Đại học Mở Hà Nội

6

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01
LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Thị Minh
Thành - Phó giám đốc Trung tâm giống và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn Ths. Mẫn Hồng Phước, KS. Hoàng Thị Hồng
Anh cùng tập thể cán bộ Trung Tâm Giống và Bảo Tồn Nguồn Gen Vi Sinh
Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện khóa luận.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa
Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, hướng dẫn và
truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, ạn bè và những người
luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có
được kết quả như ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2017

Sinh viên
Nguyễn Thị Lan Anh

Viện Đại học Mở Hà Nội

7

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01
MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết
Bệnh Alzheimer là một ch ng mất trí phổ biến nhất. Đây là một loại
bệnh gây ra sự thoái hóa toàn bộ não bộ và không thể phục hồi. Hiện nay, các
thuốc điều trị bệnh Alzheimer chủ yếu dựa vào c chế hoạt động của của
enzyme cholinesterase góp phần bổ sung lượng acetylcholine thiếu hụt cho
bệnh nhân. Tuy nhiên, các thuốc này gây ra tác dụng phụ tr n đường tiêu hóa
như buồn nôn, tiêu chảy, chóng mặt, rối loạn giấc ngủ gây ảnh hưởng tới sinh
hoạt của họ. Huperzine A là một alkaloid thuộc nhóm serquiterpen có trong
thành phần của cây Thạch tùng răng cưa có khả năng xuy n qua hàng rào
mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính
bằng microgram. Huperzine

A có tác dụng

c chế việc sinh ra

acetylcholinesterase – là một enzyme phá hủy chất trung gian dẫn truyền thần
kinh acetylcholine. Khi enzym này bị bất hoạt, nồng độ acetylcholien trong
não tăng l n, giúp trí nhớ tốt và các ch c năng nhận th c được cải thiện. Vì
vậy, việc đưa hoạt chất Huperzine A có trong thạch tùng răng cưa được xem
là liệu pháp c u cánh đối với những người mắc Alzheimer và các bệnh sa sút
trí tuệ khác.
Hoạt chất Huperzine A này được tìm thấy chủ yếu từ một cây thảo
dược truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata Thunb. ex Murray)
Trev. Thạch tùng răng cưa). Các nghi n c u về hoạt chất Huperzine A trong
cây H. serrata và cách chiết xuất hợp chất này làm nguyên liệu trong sản xuất
thuốc chữa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ đã thu được các thành tựu rất đáng
quan tâm. Tuy nhiên, với đường hướng chiết xuất hoạt chất Huperzine A từ
cây H. serrata đòi hỏi phải mất nhiều thời gian, chi phí nhiều cho trồng trọt
để có thể thu được sản lượng cây đủ cho chiết xuất hoạt chất Huperzine A làm
nguyên liệu cho ngành công nghiệp sản xuất thuốc, từ đó dẫn đến hiệu quả
kinh tế không cao. Mặc dù các nghiên c u gần đây đã ch ng minh rằng nhân
Viện Đại học Mở Hà Nội

8

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

giống in vitro có thể sản xuất HupA cao hơn cây trồng tự nhi n nhưng nó
cũng chưa đáp ng được nhu cầu của ngành công nghiệp dược phẩm, bởi thời
gian nhân được giống cây để thu làm nguyên liệu sản xuất thuốc cũng kéo dài
hàng năm. Gần đây, nấm nội sinh được phân lập từ các loại cây trồng đã được
chấp nhận như là một nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp
dược. Một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác
nhau đã được chiết xuất từ các nấm nội sinh này. Do đó, việc nghiên c u phân
lập các chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata có khả năng sản sinh hoạt
chất HupA đã được các nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường
lượng HupA cho ngành công nghiệp dược. Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa
được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng ở độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược
liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghi n c u bảo tồn
và phát triển nguồn gen bản địa quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được
quan tâm nghiên c u và khai thác ng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam.
Mặt khác, các nghi n c u về nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa Việt
Nam là chưa có công bố. Vì vậy, đề tài “Tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh
phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa ph n

tại Đà Lạt – Việt Nam có

khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A” được thực hiện với hy vọng
xác định được những chủng nấm nội sinh có khả năng sản xuất hoạt chất
HupA nhằm hướng tới một nguồn nguyên liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho
ngành công nghiệp dược trong nước và trong điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại
Việt Nam.
2. Mục tiêu đề tài:
Tuyển chọn được chủng vi nấm nội sinh có khả năng tổng hợp
Huperzine A từ các chủng vi nấm phân lập được từ cây Thạch tùng
răng cưa phân bố tại Đà Lạt, Việt Nam.
3. Nội dung đề tài:
 Hoạt hóa các chủng vi nấm nội sinh được phân lập từ cây Thạch
tùng răng cưa tại Đà Lạt, Việt Nam
Viện Đại học Mở Hà Nội

9

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

 Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tổng hợp
Huperzine A từ các chủng vi nấm nội sinh trên.
 Định danh các chủng vi nấm nội sinh bằng phương pháp truyền
thống và sinh học phân tử.

Viện Đại học Mở Hà Nội

10

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1.1

Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata)

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata) là một loài thân thảo, thuộc họ
Lycopodiaceae , ở Trung Quốc còn được biết đến dưới tên Qian Ceng Ta.
Một số thành phần hoá học đã được phân lập từ thực vật thuộc nhóm
alkaloids, flavones, Triterpenes và acid phenolic.
Cây thuốc này đã được sử dụng từ gần 1000 năm trong y học cổ truyền
Trung Quốc, nó thường được sử dụng trong trường hợp sốt, cảm lạnh, sưng
phù, bầm tím, kinh nguyệt, viêm khớp dạng thấp, tâm thần phân liệt, nhiễm
trùng da, nhiễm trùng dưới da, suy nhược cơ tim và suy nhược cơ[41]. Các
bản ghi chép sớm nhất về cây này được tìm thấy trong quyển dược điển có
t n “ Ben cao shi yi” từ thời Trung Quốc cổ đại năm 739). Trong ghi chép,
Thạch tùng răng cưa là một loại dược liệu được dùng trong điều trị bệnh thấp
khớp, cảm lạnh, giúp thư giãn cơ và thúc đẩy lưu thông tuần hoàn máu[41].
Vào những năm 1980, các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện ra Huperzine
A từ cây này, thì nó đã được nổi tiếng ra toàn thế giới, như là một chất c chế
AchE có thể đảo ngược, mạnh mẽ và chọn lọc thuốc bằng in vitro và invivo và
tạo ra những hiệu quả nhất định trọng việc điều trị bệnh Alzheimer [27].
Hiện nay tại Việt Nam cũng như tr n thế giới, do số lượng người mắc
bệnh Alzeimer ngày càng gia tăng n n nhu cầu sử dụng Thạch tùng răng cưa
để sản xuất thuốc cũng dần lớn theo, trong khi đó, Thạch tùng răng cưa lại là
dược liệu quý hiếm cần đến sự canh tác ngặt nghèo cũng như phát triển rất
chậm (trung bình khoảng 15 năm cho một chu kỳ sinh trưởng) và đã được đưa
vào danh sách những loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng [15]. Vì vậy, kỹ
thuật nhân giống cây nhanh bằng phương pháp in vitro đã được các nhà khoa
học nghiên c u và thực hiện để giải quyết được vấn đề trên.

Viện Đại học Mở Hà Nội

11

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

Phân loại khoa học
Giới : Plante
Ngành : Lycopodiophyta
Lớp : Lycopodiopsida
Bộ : Thông Đất (Lycopodiales)
Họ : Thông Đất (Lycopodiaceae)
Chi : Huperzia
Loài : Huperzia Serrata
Tên gọi khác : Chân sói
Tên khoa học : Huperzia Serrata (Thunb.) Trevis, (Lycopodium
serratum thunb.)
1.1.2 Mô tả cây

Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng cưa[6]

Huperzia serrata là cây mọc ở đất, thường mọc ở dưới tán rừng quanh
năm ẩm ướt, thân đ ng cao 15-40cm, đơn hay lưỡng phân 1-2 lần, đường kính
khoảng 2mm, hình trụ. Lá hình bầu dục mũi mác, dài khoảng 15mm rộng 3mm,
tương đối mỏng, gân giữa rõ, mép có răng. Túi bào tử ở nách nhánh lá giống lá
thường, túi bào tử hình thận, màu vàng tươi. Sinh sản bằng bào tử trong môi
trường có nước mưa, có khả năng mọc trồi sau khi bị cắt hoặc gãy.
1.1.3 Phân b
Thạch từng răng cưa chủ yếu được tìm thấy ở các khu rừng ôn đới với
độ cao 900- 3500m ở khu vực đông bắc Ấn Độ như Tây Bengal Darjeeling),

Viện Đại học Mở Hà Nội

12

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

Sikkim, Arunachal Pradesh, Assam, Meghalaya và Manipur, và ở các ngọn
đồi Nilgiri Tamilnadu. Ngoài Ấn Độ, nó còn được tìm tấy ở Trung Quốc,
Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn Quốc, Indonesia, Fiji, Samoa,
Mexico, Mỹ Hawaii), Thái Lan, bán đảo Malaysia Paham), Nga Đông
Siberia / Amur / Ussuri), Đài Loan, Úc và Cuba .
Ở nước ta, chỉ gặp ở những vùng có độ cao từ 1000m trở l n như Cao
Bằng, Lào Cai, Quảng Trị, Quảng Nam- Đà Nẵng, Khánh Hòa, Lâm Đồng.
1.2

Tổng quan hoạt chất Huperzine A

1.2.1 Giới thiệu về Huperzine A
Huperzine A, đôi khi được gọi là Selagin, là một alkaloid được tách
chiết từ thảo mộc Lycopodium serratum , có cấu trúc hóa học C15H18N2O
(hình 1.2). Nó được xác định lần đầu tiên vào những năm 1980, nhưng những
chiết xuất của cây đã được sử dụng ở Trung Quốc hàng thế kỷ như một loại
thảo dược để điều trị chấn thương, căng thẳng, sưng tấy, tâm thần phân liệt,
vv. Herbs là một chất

c chế mạnh mẽ, có thể đảo ngược và chọn lọc

acetylcholinesterase, hoạt động này thậm chí mạnh hơn galantamine, một loại
thuốc được FDA chấp thuận để điều trị bệnh AD và các rối loạn về trí nhớ khác
từ nhẹ đến trung bình. Khi sự suy giảm ch c năng cholinergic trong não là một
yếu tố chính ảnh hưởng đến sự thiếu hụt trí nhớ trong AD, Huperzine A đã nổi
l n như một ng cử vi n đầy h a hẹn cho việc điều trị bệnh nhân AD.

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Huperzine A

Huperzine A thường được sử dụng để điều trị bệnh Alzheimer và các
bệnh thoái hóa thần kinh khác như Parkinson vì khả năng của nó để cải thiện
trí nhớ và khả năng nhận th c trong khi hoạt động như một chất bảo vệ thần
Viện Đại học Mở Hà Nội

13

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

kinh. Huperzine A thường được coi như là một chất bổ sung tự nhiên trong
các cá nhân khỏe mạnh vì các hiệu ng nootropic của nó.
1.2.2 Cơ chế hoạt động của Huperzine A
Huperzine A làm tăng lượng acetylcholine trong não bằng cách ngăn
chặn hoạt động của cholinesterase. Huperzine A cũng có một số hoạt động
như một chất đối kháng thụ thể NMDA. Nó là bảo vệ thần kinh, cho thấy để
bảo vệ nơ-ron từ thiệt hại do glutamate, peroxides, và beta-amyloids. Trong
các nghiên c u chuột, nó đã được hiển thị để thúc đẩy neurogenesis.
Bốn trong số năm loại thuốc được FDA chấp thuận để điều trị bệnh
Alzheimer là chất c chế cholinesterase. Acetylcholine đã được ch ng minh
là đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành những kỷ niệm
mới. M c acetylcholine cao làm tăng cường độ truyền dẫn thần kinh đến vỏ
não. Nó cũng c chế sự phóng thích glutamate, do đó ngăn chặn kích thích
phản hồi của vỏ não. Hiệu quả ròng là làm cho mạch vỏ não có thể phản ng
nhanh với đầu vào cảm giác có li n quan, đồng thời giảm phản hồi kích thích
có thể cản trở việc thu hồi bộ nhớ.
Các chất c chế cholinesterase hiện đang có mặt trên thị trường để
điều trị bệnh Alzheimer khá hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ ở những
bệnh nhân này. Những loại thuốc này cũng có thể làm chậm sự tiến triển của
bệnh thông qua các hiệu ng bảo vệ thần kinh của chúng . Tuy nhiên, việc sử
dụng bốn loại thuốc được FDA chấp thuận hạn chế bởi những tác dụng phụ
nghiêm trọng của chúng đối với đường tiêu hóa, phổi và cơ. Acetylcholine
được sử dụng trong nhiều bộ phận của cơ thể khác với não và tăng
acetylcholine trong cơ thể gây ra nhiều rối loạn. Huperzine A không có giới
hạn này bởi vì nó có vẻ có ái lực rất mạnh đối với cholinesterase trong não.
1.3

Tổng quan về vi nấm nội sinh trong thực vật

1.3.1 Khái niệm vi nấm nội sinh trong thực vật
Vi nấm nội sinh là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng
không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [4,44]. Vi nấm nội sinh là
Viện Đại học Mở Hà Nội

14

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

thành phần chiếm tỉ lệ cao trong hàng ngũ đông đảo endophyte thực vật hiện
nay. Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các
chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra
các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng,
các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

Hình 1.3 Một phần thuộc nhóm nấm VAM( Glomus sp), với các sợi nấm và các
túi khí trong rễ cây [12]

1.3.2 Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật
Hầu như tất cả các loài thực vật trong các hệ sinh thái tự nhi n đều có
tính cộng sinh với các loài vi nấm nội sinh. Các vi nấm nội sinh này có thể có
lợi cho cây chủ bằng cách ngăn ngừa sinh vật gây bệnh hoặc các sinh vật ký
sinh tr n chúng, cũng có thể sản xuất các chất c chế sự phát triển của các đối
thủ cạnh tranh, bao gồm các vi sinh vật gây bệnh. Vi nấm nội sinh còn làm
tăng biểu hiện của gen li n quan đến khả năng phòng bệnh, làm cho cây có
khả năng chống lại nhiều mầm bệnh tiềm ẩn. Ví dụ, gliotoxin và gliovirin:
được sản xuát bởi T.virens và chúng kiềm hãm sự phát triển của các loài
Rhizotonia và Pythium. Một số nghiên c u đã chỉ ra rằng, các cây trồng có vi
nấm nội sinh sẽ phát triển nhanh hơn, có tính kháng và c ng hơn so với cây
không ch a vi nấm nội sinh. Ngoài ra nấm giúp cây hấp thụ chất dinh dưỡng
từ đất, đồng thời cây là nhà máy cung cấp các loại thông qua quang hợp cho
nấm – ch c năng mà chúng không có.

Viện Đại học Mở Hà Nội

15

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

Ngoài những tác dụng có lợi, các loại vi nấm nội sinh còn có thể là
những tác nhân gây bệnh không rõ ràng cho cây. Một số loài nấm nội sinh
thể hiện như loài hoại sinh tiềm ẩn, chúng có thể không gây triệu ch ng và
phát triển cùng với các giai đoạn của cây chủ, nhưng các vi nấm này có thể
phát triển không hạn chế và tái sản sinh khi mà cây chủ già hoặc chết đi. Sự
cạnh tranh dịch tiết của cây: dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm những
túi bào tử nấm Phytium (nấm gây bệnh cho cây), từ đó hình thành n n sợi
nấm và lây nhiễm vào cây. Nấm Trydoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm
Phytium bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium không
thể nảy mầm.
Vi nấm nội sinh có thể được truyền từ phần này sang phần khác của cây
chủ theo chiều dọc( di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác) hoặc ngang
(giữa các cá thể). Một số vi nấm nội sinh thương xuy n truyền theo chiều dọc
cũng có thể tạo ra các bào tử tr n cây được truyền theo chiều ngang.
1.3.3 Ứng dụng của vi nấm nội sinh
1.3.3.1

Trong nông nghiệp

Các chất có hoạt tính sinh học được sản xuất trực tiếp từ vi nấm nội
sinh, hay là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực
vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ng tốt hơn và thực hiện một số ch c năng
bảo vệ, cung cấp các chất có lợi cho cây chủ [44]. Bên cạnh đó, vi nấm nội
sinh cũng có thể là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chủ
chống lại được với điều kiện sống bất lợi.
Năm 1999, Pereira và cộng sự đã cấy nhiễm nấm nội sinh vào cây
chuối không chỉ giúp cây có khả năng kháng lại thuốc diệt nấm mà nó còn đột
biến để duy trì sự đối kháng [4]. Beauveria Bassiana là loại nấm diệt côn
trùng bằng cách gây bệnh lên côn trùng ở giai đoạn ấu trùng và thành trùng.
Nấm này được cấy nhiễm vào một số hạt ngũ cốc để chống lại các côn trùng
tấn công cây chủ trong một số giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên,
trong số một số cây đã tìm thấy sự có mặt của loài này, ch ng tỏ nấm này có
Viện Đại học Mở Hà Nội

16

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

dạng nội sinh tự nhiên không liên quan tới quá trình nấm xâm nhập vào cây.
Ngoài ra, một số nấm gây bệnh tr n côn trùng cũng đã được phân lập trên một
số cây trồng khác [4]. Nấm Trichoderma sp. được sử dụng để bảo vệ cây
trồng chống các bệnh trong công trình nghiên c u của Well và cộng sự (1972)
thông báo: ở điều kiện ngoài đồng, nấm Trichoderma hazianum đã ngăn chặn
được bệnh ở thân, rễ cây gây ra bởi Clerotium rolfsii. Koga và cộng sự đã
thực hiện cấy nhiễm nấm chi Acremonium vào các cây để chúng có thể truyền
cho cây chủ khả năng kháng lại sự cạnh tranh với các loài gây hại cho cây.
Kết quả nghiên c u công bố đã cấy nhiễm thành công vào cây cỏ đuôi trâu
(Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch (Lolium perenne), các cây này đã
kháng lại được sâu kéo màng cỏ Poa P. teterrella [4,20].
1.3.3.2

Trong y dược

Các chất có hoạt tính sinh học được sản sinh bởi các vi nấm nội sinh
được đánh giá là có tiềm năng phát triển trong lĩnh vực y dược. Theo các
nghiên c u đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa
th

cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid,

benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid,
terpenoid, tetralon,… [26]. Các chất này được đánh giá là có tiềm năng phát
triển trong lĩnh vực y dược, được

ng dụng rộng rãi như hóa chất nông

nghiệp, thuốc kháng sinh, c chế miễn dịch, chất chống oxy hóa và chất
chống ung thư [7].
Taxol (biệt dược của paclitaxel) là hợp chất được chiết xuất từ cây
thông đỏ, có khả năng làm gián đoạn sự phân chia và sự phát triển của tế bào,
ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư. Kết hợp với đặc tính không gây độc
taxol trở thành chất hàng đầu trong điều trị ung thư từ những thập ni n 90 và
được chỉ định cho bệnh nhân ung thư vú di căn hoặc bệnh nhân ung thư
buồng tr ng giai đoạn muộn. Nhu cầu về taxol rất lớn mà hàm lượng Taxol
trong thiên nhiên có giới hạn. Bởi vậy, Taxomyces andreanae là nấm nội sinh
thực vật có khả năng sinh tổng hợp taxol được phân lập từ mạch libe bên
Viện Đại học Mở Hà Nội

17

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

trong vỏ cây thông đỏ Pacific bởi Stierle, A., Strobel, G., and Stierle, D.
(1993) [39] đã góp phần làm tăng tỷ lệ chữa bệnh l n cao hơn.
1.4

Tình hình nghiên cứu cây Thạch từng răng cưa sinh tổng hợp
Huperzine A trong nước và trên thế giới

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Trước thực trạng các bệnh lý về thần kinh như Alzheimer hay
Parkinson ngày càng gia tăng và vẫn chưa có thuốc điều trị cụ thể, việc tìm
kiếm phương pháp điều trị mới bao gồm các thuốc thảo dược, HupA được cho
là có công nhiều tiềm năng và được quảng bá rộng rãi như một tác nhân giúp
tăng cường trí nhớ. Tr n cơ sở đó, Ohba và cộng sự, 2015 đã nghi n c u và
ch ng minh được nguồn HupA có trong Thạch tùng răng cưa đã được sử
dụng như một chất c chết tiềm năng của AchE và hoạt tính của nó đối với
các ch c năng nhận th c đã được ch ng minh ở chuột. Hơn nữa, phân tích
meta chi tiết của các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên cho thấy một tác động
có lợi của huperzine A đối với các ch c năng nhận th c của bệnh Alzhzeimer.
Hầu hết Huperzine A dùng trong sản xuất thuốc đều được tách chiết từ
cây Thạch tùng răng cưa, nhưng chỉ cho số lượng rất nhỏ (0.007%). Nhưng
cây này lại có nhược điểm là phát triển rất chậm cũng như khu vực phân bố
hạn chế, phải mất ít nhất 15 năm cho quá trình sinh trưởng của cây [28]. Nuôi
cấy mô cho cây này ít khi thành công (dựa vào kinh nghiệm nghiên c u trước
đó của các nhà khoa học). Do vậy, không thể khai thác được một lượng lớn
hóa chất từ cây này để sư dụng làm thuốc [28], [30]. Đã có nhiều phương
pháp sản xuất HupA từ thực vật được khám phá [28],[22],[31]. Mặc dù một
số loài khác trong Huperziaceae tạo ra lượng HupA lớn hơn, nhưng những
loài này thậm chí còn hiếm hơn trong tự nhiên, thậm chí làm cho chúng trở
thành những ng cử viên ít mong muốn hơn làm nguồn tự nhiên cho sản xuất
HupA. Chính vì vậy mà đã có rất nhiều công trình nghiên c u khoa học nhằm
thu được nguồn HupA cao hơn. Những nỗ lực đầu tiên về nuôi cấy in vitro
của Freeberg và cộng sự đã giúp Xiaoqiang Ma và David R.Gang
Viện Đại học Mở Hà Nội

18

2005)

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

nghiên c u ra khả năng sinh tổng hợp HupA cao hơn so với phương pháp
truyền thống [42].
Do những xu hướng này, việc khai thác sử dụng HupA từ nguồn vi nấm
nội sinh thay cho việc chiết xuất từ cây dược liệu quý H.serrata áp dụng trong
chữa bệnh Alzheimer đã và đang rất được chú trọng nghiên c u và phát triển.
Đã có nhiều công bố về việc nghiên c u phân lập các chủng nấm nội sinh có
khả năng sinh tổng hợp Huperzine A. Vì các loài vi nấm nội sinh sản xuất
taxol đã được phân lập thành công từ loài Thái Bình Dương vào năm 1993,
một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác nhau
liên tục được phát hiện là được tạo ra bởi vi khuẩn nội tạng.[40], [41] .Do đó,
để tìm nguồn HupA đx thu hút sự quan tâm rộng rãi trong những năm gần
đây, một số báo cáo về sự cô lập các nấm endophytic sản xuất HupA từ các
cây Huperiaceae khác nhau đã được báo cáo, như Acremonium sp. 2F09P03B,
Blastomyces

sp.,

Botrytis

sp.,

Shiraia

sp.

Slf14,

Cladosporium

cladosporioides LF70 và Aspergillus flavus LF40.[25], [46] .Việc sử dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC) để định lượng các m c
Huperzine A (HupA) trong các mẫu của Huperzia serrata thu được từ một
quần thể vào những thời điểm khác nhau trong năm, trong các cơ quan khác
nhau của cùng một cây và từ các vị trí địa lý khác nhau của Huperziaceae và
đã xác nhận được Phlegmariurus carinatus có ch a hàm lượng HupA cao
nhất. Các thành viên chi này có hàm lượng HupA cao hơn so với các loài
Huperzia [30] đã tạo được một hướng đi mới cho ngành công nghiệp dược
liệu. Năm 2009, Ju, Wang và cộng sự đã tiến hành phân lập được hai chủng
Blastomyces sp. và Botrytis sp. từ cây Phleg –mariurus cryptomerianus (một
loài cây trong họ Thạch tùng) và tiến hành định danh thành công chủng vi
nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp HupA từ 4 loài trong chi
Huperziaceae bằng phương pháp HPLC [21]. Các nhà khoa học Trung Quốc
tiến hành khai thác thu nhập các mẫu cây Thạch tùng tại Vườn Bách Lộc Sơn
(Giang Tây, Trung Quốc) để cung cấp nguồn cây cho việc nghiên c u nấm
Viện Đại học Mở Hà Nội

19

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

nội sinh [19]. Kết quả cho thấy, dựa vào việc phân tích trên trình tự rADN,
năm chủng: Slf14, Slf5, Slf22, Ssf5 trong số 69 chủng đã phân lập được phân
loại vào chi Shiraia; trong đó, hai chủng Slf14 và Slf15 có khả năng sản sinh
hoạt chất HupA. Chủng Slf14 cho sản lượng HupA là 327,8 µg/l cao hơn hẳn
so với chủng Slf15. Với phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái và
bằng phân tích trình tự ITS – rDNA, Shi và cộng sự 2005) đã phân lập được
4 chủng là Cephalosporium sp., Plasmoparad sp., Saccharomyces sp.,
Penicillium sp. nội sinh trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh An Huy [36];
Huang và cộng sự 2009) cũng đã phân loại được 4 chủng nấm nội sinh trong
cây H. Serrata trồng tại tỉnh Hồ Nam (Cladosporium sp., Penicillium sp., ,
Fusarium sp., và Coniothyrium sp.) [17].
1.4.2 Các nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa được coi là một cây dược liệu quý,
chúng thường sinh trưởng và phát triển tại Đà Lạt và Sa Pa ở khu vực có độ
cao từ 1000m trở l n. Tuy nhi n, cho đến hiện nay thì loại thảo dược này vẫn
chưa thực sự được quan tâm, chú trọng nghiên c u trong điều trị bệnh và các
công trình nghiên c u về vi nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa tại
Việt Nam là được công bố. Với tỉ lệ người mắc bệnh Alzheimer ngày càng
gia tăng tại Việt Nam như hiện nay thì vấn đề này càng trở nên cấp thiết hơn.
Mặt khác, các nghi n c u về nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa
cũng chưa có công bố. Vì vậy, việc tuyển chọn được chủng vi nấm nội sinh
có khả năng tổng hợp được Huperzine A được phân lập từ cây Thạch tùng
răng cưa sẽ tạo ra được một hy vọng mới cho việc nghiên c u và điều trị bệnh
Alzheimer và có thể góp phần làm giảm tỉ lệ người mắc bệnh.
1.5

Nghiên cứu định danh vi nấm

Từ lâu, việc định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái
và các đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật. Đồng thời, phương pháp sinh
học phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến
hành để cho kết quả nhanh chóng và chính xác.
Viện Đại học Mở Hà Nội

20

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

1.5.1 Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền th ng
Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện lần đầu ti n năm 1987, khi
Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng của tế bào. Mặc dù
phương pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả
trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò
quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các
chủng mới [].
Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các
tiêu chí phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý và đặc điểm biến dưỡng
năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh
hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất []
Quan s t đặc điểm khuẩn lạc trên thạch
 Hình dáng, kích thước đường kính, chiều dày)
 Dạng mặt nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay
không…)
 Màu sắc mặt tr n và dưới của khuẩn lạc
 Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng hay nhăn nheo…)
 Giọt tiết (nếu có): nhiều, ít, màu sắc
 Cấu trúc khác: bó sợi, bó giả
Quan s t đặc điểm vi học
 Sợi nấm: có vách ngăn, có mấu hay không có vách ngăn
 Bào tử trần: kiểu phát sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, màu sắc,
bề mặt, cách sắp xếp…
 Bộ máy nang bào tử: nang bào tử và nang bào tử nhỏ, hình dáng, kích
thước, màu sắc, bề mặt của nang, cuống nang, có nhánh hoặc không,…
 Bộ máy nang bào tử trần: giá bào tử trần – kích thước, đường kính,
chiều dài, bề mặt, màu sắc

Viện Đại học Mở Hà Nội

21

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

 Thể quả túi cần khảo sát vị trí, số lượng, hình dạng , kích thước, màu
sắc , bề mặt của thế quả, quan sát túi bào tử về hình dạng, kích thước bề
mặt.
Khi nuôi cấy ở môi trường thích hợp, mẫu vi nấm nuôi cấy sẽ có những
biểu hiện hình thái đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tán nấm
hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày trên
bề mặt môi trường nuôi cấy
Tiến hành định loại: Căn c vào kết quả quan sát đầy đủ, chính xác các đặc
điểm của khuẩn lạc và các đặc điểm vi học tiến hành xác định tên loài (hoặc
th nếu có) chủng nấm mốc như sau:
 Dùng khoá phân loại của các nhóm phân loại bậc cao ngành, ngành
phụ, lớp, bộ, họ, chi) để xác định lần lượt xem những nấm mốc thuộc
chi nấm mốc nào. Tiếp theo dùng khoá phân loại của chi đó để xác định
đến loài th ) bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã quan sát được
của chủng nấm mốc đó với các đặc điểm tương ng của loài nào đó
trong khoá phân loại. Nếu các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm
của loài mô tả trong khoá, ta xác định được t n loài của chủng nấm
mốc cần định loại.
 Nếu có chủng nấm mẫu của loài hoặc th ) vừa xác định thì tiến hành
so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng
mẫu với các đặc điểm tương ng của chủng cần định loại. Nếu các đặc
điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn
loài hoặc th ) của chủng nấm mốc cần định loại.


Nếu có chủng nấm mẫu của loài hoặc th ) vừa xác định thì tiến hành
so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng
mẫu với các đặc điểm tương ng của chủng cần định loại. Nếu các đặc
điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn
loài hoặc th ) của chủng nấm mốc cần định loại.

Viện Đại học Mở Hà Nội

22

Khoa CNSH


Nguyễn Thị Lan Anh

Lớp: 13-01

1.5.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
1.4.1.1. Kỹ thuật PCR.
 Khái niệm.
PCR (Polymerase Chanin Reaction) là một kĩ thuật phổ biến trong sinh học
phân tử nhằm khuếch đại một đoạn ADN ban đầu mà không cần sử dụng
thông qua các vi sinh vật sống. Được phát minh bởi Karry Mullis cùng các
cộng sự vào năm 1985 và được hoàn thiên bởi Saiki vào năm 1988. PCR được
sử dụng nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các bệnh
di truyền, giải mã, nhận dạng, chuẩn đoán những căn bệnh nhiễm trùng, tách
dòng gen, và xác định huyết thống...
 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR.
Nguyên tắc của phương pháp PCR là tổng hợp ra một lượng lớn các đoạn
ADN sao chép từ một đoạn ADN tổng số ban đầu trong ống nghiệm, dựa trên
hoạt động của enzyme ADN-polymerase. Phản ng PCR đưcợ thực hiện nhờ
bằng máy tuần hoàn nhiệt trong nhiều chu kỳ.
Mỗi chu kỳ của PCR gồm 3 quá trình:
- Quá trình biến tính ADN.
ADN mạch khuôn được đưa vào phản ng trong môi trường có nhiệt độ từ
90÷950C đã bao gồm các thành phần khác của PCR) kéo dài trong khoảng
30÷60 giây. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép bị tách ra (do liên
kết hydrô bị đ t), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
- Quá trình gắn mồi.
Hạ nhiệt độ xuống và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 50÷65°C.
Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn. kéo dài quá trình trong khoảng
30÷60 giây. Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi. Người ta còn
có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi.
- Quá trình kéo dài chuỗi.
Nâng nhiệt độ lên 720C, để ADN-polymerase tổng hợp sợi mới. Kết thúc một
chu kỳ từ một ADN kép mẹ tổng hợp 2 sợi ADN kép con. C như vậy, phản
Viện Đại học Mở Hà Nội

23

Khoa CNSH


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×