Tải bản đầy đủ

Tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp huperzine a từ cây thạch tùng răng cưa phân bố ở sapa việt nam

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI NẤM NỘI SINH SINH CÓ KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HƠP HUPERZINE A TRONG CÂY THẠCH
TÙNG RĂNG CƢA PHÂN BỐ Ở SA PA – VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn : TS. Lê Thị Minh Thành
Sinh viên thực hiện

: Lƣu Thùy Linh

Lớp

: CNSH 13-02

Hà Nội – 2017



VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê
Thị Minh Thành – Ph Gi m đ c Trung tâm Gi ng và Bảo tồn nguồn gen Vi
sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, ngƣời đã truyền cho em phƣơng ph p học tập và nghiên cứu khoa
học, tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong su t qu trình nghiên
cứu vừa qua.
Em xin cảm ơn c c thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Viện đại
học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho em kiến thức và tạo mọi điều kiện thuân lợi
cho em hoàn thành kh a luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Mẫn Hồng Phƣớc và Ks. Hoàng Thị
Hồng Anh đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn cho em mọi kiến thức cơ bản khi
em mới bắt đầu làm quen với c c kỹ thuật liên quan đến kh a luận t t nghiệp
của mình.
Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới c c cô chú, c c anh chị, c c bạn
trong Trung tâm gi ng và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật đã giúp đỡ em rất
nhiều trong thời gian thực tập.
Cu i cùng, em xin gửi tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè lời cảm ơn sâu
sắc vì đã luôn giúp đỡ, động viên chúng em trong su t thời gian học tập.
Hà Nội, ngày

th ng

năm2017

Sinh viên

Lƣu Thùy Linh

Lưu Thùy Linh

1

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 7
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 10
1.1 Tổng quan cây Thạch tùng răng cƣa ......................................................... 10
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ................................................................................ 10
1.1.2 Phân loại khoa học................................................................................. 11
1.1.3 Mô tả cây ................................................................................................ 11
1.2 Tổng quan hoạt chất Huperzin A trong Thạch tùng răng cƣa. ................. 12
1.2.1 Cấu trúc .................................................................................................. 12
1.2.2 Cơ chế hoạt động ................................................................................... 12
1.3 Tổng quan về vi nấm nội sinh trong thực vật. .......................................... 14
1.3.1 Khái niệm về nấm nội sinh trong thực vật ............................................. 14
1.3.2. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật. ........................................... 14
1.3.3 Ứng dụng của vi nấm nội sinh ............................................................... 15
1.4 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cƣa sinh tổng hợp
hoạt chất Huperzine A trong nƣớc và trên Thế giới. ...................................... 19
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới....................................................... 19
1.4.2 C c nghiên cứu trong nƣớc .................................................................... 20
1.5 Nghiên cứu định danh vi nấm ................................................................... 20
1.5.1 Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống ................. 20
1.5.2 Định danh bằng phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử..................... 22
1.6. Phƣơng ph p đo quang phổ UV –VIS ..................................................... 28
1.6.1 Khái niệm ............................................................................................... 28
1.6.2 Nguyên tắc hoạt động............................................................................. 29
1.6.3 Ứng dụng ................................................................................................ 29
1.7 Phƣơng ph p sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC..................................... 30
1.7.1 Khái niệm ............................................................................................... 30
1.7.2 Nguyên tắc hoạt động............................................................................. 31
1.7.3 Ứng dụng của HPLC .............................................................................. 32
Lưu Thùy Linh

2

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

PHẦN 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................... 33
2.1 Thời gian, địa điểm và đ i tƣợng nghiên cứu ........................................... 33
2.1.1 Thời gian và địa điểm............................................................................. 33
2.1.2 Đ i tƣợng nghiên cứu............................................................................. 33
2.2 H a chất..................................................................................................... 33
2.2.1 H a chất và dung dịch ............................................................................ 33
2.2.2 Trang thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 33
2.2.3 Môi trƣờng và dung dịch........................................................................ 34
2.3 Phƣơng ph p nghiên cứu........................................................................... 35
2.3.1 Phương pháp hoạt hóa và thu sinh khối vi nấm .................................... 35
2.3.2 Phương pháp tách chiết ......................................................................... 35
2.3.3 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp Huperzine A trong vi
nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng cưa. ..................................................... 36
2.3.4 Định danh vi nấm nội sinh bằng phương pháp truyền thống ................ 40
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 41
3.1 Kết quả hoạt h a và nhân nuôi c c chủng vi nấm nghiên cứu .................. 41
3.2 Kết quả đ nh gi khả năng sinh tổng hợp Huperzine A từ nấm nội sinh
trong cây Thạch tùng răng cƣa phân b ở Sa Pa. ............................................ 47
3.2.1 Kết quả tách chiết nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng cưa phân bố ở
Sa Pa................................................................................................................ 47
3.4 Kết quả định danh chủng vi nấm sinh tổng hợp Huperzine A. ................. 55
3.4.1 Kết quả định danh theo phương pháp truyền thống .............................. 55
3.4.2 Kết quả định danh bằng phân tích trình tự vùng rADN – ITS. .............. 57
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 61

Lưu Thùy Linh

3

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

AND

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

BlAST

Basic Local Alignment Search Tool

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ETS

External transcribed spacer

HTKL

Hình th i khuẩn lạc

ITS

Internal transcribed spacer

NCBI

National Center for Biotechnology Informatic

PDA

Potato Dextrose Agar

PCR

Polymerase chain reaction

rADN

ribosomal acid deoxyribonucleic

rARN

ribosomal acid ribonucleic

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Melting temperature

Lưu Thùy Linh

4

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây thạch tùng răng cƣa [43]. ......................................................... 11
Hình 1.2: Cấu trúc h a học chất Huperzine A [13] ........................................ 13
Hình 1.3: Sơ đồ vùng rADN – ITS của nấm ................................................... 26
Hình 3.1: Đặc điểm hình th i khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nh m HTKL 1 . 41
Hình 3.2: Đặc điểm hình th i khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nh m HTKL 2 . 41
Hình 3.3: Đặc điểm hình th i khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nh m HTKL 3 . 42
Hình 3.4: Đặc điểm hình th i khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nh m HTKL4 .. 42
Hình 3.5: Hình ảnh dịch chiết nấm của một s chủng vi nấm đƣợc phân lập từ
cây Thạch tùng răng cƣa phân b tại Sa Pa .................................................... 47
Hình 3.6: Hình ảnh sinh kh i nấm (bên tr i) và dịch chiết nấm (bên phải) ... 52
của chủng T44c ............................................................................................... 52
Hình 3.7: Hình ảnh kh i phổ của chất Huperzine A (bên tr i) và của dịch chiết
nấm chủng T44C (1: λ = 210nm 2: λ = 230 nm 3: λ = 310nm) .................... 52
Hình 3.8: Hình ảnh so s nh kh i phổ của chủng nấm T44c và mẫu chất chuẩn
Huperzine A (1: λ = 210nm 2: λ = 230 nm λ = 310 nm) ............................... 53
Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLV ( UV 310 nm ) ..................................................... 54
của chất chỉ thị Huperzine A (A) và T44C (B). .............................................. 54
Hình 3.10: Hình th i khuẩn lạc của chủng nấm nội sinh T44C ...................... 56
Hình 3.11: Vi hình th i của chủng nấm T44C ................................................ 56
Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm PCR chủng vi nấm T44C trên gel
agarose 1% (1: Chủng T44C, 2: Marker)........................................................ 57
Hình 3.13: Kết quả giả trình tự gen chủng nấm T44C.................................... 58

Lưu Thùy Linh

5

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả phân nh m hình th i khuẩn lạc nấm nội sinh hoạt h a ..... 42
đƣợc từ cây Thạch tùng răng cƣa ở Sa Pa....................................................... 42
Bảng 3.2: Kết quả hoạt h a c c chủng vi nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng
của phân b tại Sa Pa. ..................................................................................... 44
Bảng 3.3: Kết quả đo quang phổ UV – VIS của c c mẫu chiết nấm nghiên cứu 48
Bảng 3.4: Bảng thời gian lƣu và phân t ch c c peak trong sắc ký đồ của chất
chuẩn Huperzine A (A)và chủng vi nấm T44C (B) ........................................ 54
Bảng 3.5: Mức độ tƣơng đồng gen ITS1 của chủng nấm T44C khi so s nh
trên GenBank................................................................................................... 58

Lưu Thùy Linh

6

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết:
Bệnh Alzeimer là 1 chứng r i loạn thần kinh tho i h a, gây ảnh hƣởng
tới 20 triệu ngƣời trên Thế Giới trong đ c khoảng 4-5 triệu ngƣời Mỹ. Hiện
nay căn bệnh đ đƣợc coi là nguyên nhân thứ 3 gây ra c i chết ở c c nƣớc
ph t triển chỉ sau bệnh tim và ung thƣ. Tuy nhiên hiện nay vẫn chƣa c
phƣơng thức điều trị chính cho Alzeimer. Việc sử dụng c c chất ức chế
enzyme cholinesterase (AChEI) là một trong những chiến lƣợc đƣợc chấp
nhận để điều trị bệnh Alzeimer. Trong chƣơng trình nghiên cứu bảo tồn và
ph t triển nguồn gen quý hiếm về thực vật thì cây Thạch tùng răng cƣa
(Huperzia serrata) hiện nay đƣợc biết nhiều ở Trung Qu c dƣới tên là Qian
Ceng Ta. Ở Mỹ và Châu Âu, Huperzia serrata đƣợc sử dụng bổ sung trong
chế độ ăn u ng để tăng cƣờng trí nhớ và tăng cƣờng nhận thức cho hệ thần
kinh trung ƣơng. Hoạt chất chính c trong Thạch tùng răng cƣa là Huperzine.
Hầu hết c c Huperzine A đang đƣợc sủ dụng ở c c loại thu c thảo dƣợc hiện
nay đƣợc chiết xuất từ H.serrata và một s loài kh c trong họ Thạch sam
[13]. Tuy nhiên, H. serrata và c c cây kh c trong họ Thạch Sam yêu cầu điều
kiện canh t c ngặt nghèo và sinh trƣởng ph t triển rất chậm, phải mất rất
nhiều năm (c khi lên đến 15 năm) ph t triển trong tự nhiên mới c thể để sử
dụng làm thu c. Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất Huperzine A từ cây
Thạch tùng răng cƣa làm nguyên liệu cho sản xuất thu c là không cao
(khoảng 0,1%). Bởi vậy, c rất nhiều sự nỗ lực để thực hiện việc sản xuất
Huperzine A nhƣ nuôi cấy in vitro cây H. serrata và tổng hợp h a học[27].
Nấm nội sinh trong thực vật thƣờng sinh trƣởng, ph t triển nội sinh
hoàn toàn hoặc một phần trong mô của c c tế bào cây chủ, thƣờng không gây
triệu chứng rõ ràng của bệnh[25]. Một s nấm nội sinh kích thích tăng trƣởng
thực vật và sản xuất c c chất c hoạt tính sinh học với c c chức năng hoạt
Lưu Thùy Linh

7

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

động chuyển h a. Một s nấm nội sinh đã đƣợc tìm thấy nhƣ là nguồn tiềm
năng của thu c trị điều trị bệnh [26].Gần đây, nấm nội sinh đƣợc phân lập từ
c c loại cây trồng đã đƣợc chấp nhận nhƣ là một nguồn nguyên liệu quan
trọng của ngành công nghiệp dƣợc. Một lƣợng lớn c c hợp chất c cấu trúc
mới và hoạt tính sinh học kh c nhau đã đƣợc chiết xuất từ c c nấm nội sinh
này [16]. Việc nghiên cứu vi nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cƣa sản sinh
Huperzine A sẽ mang đến hiệu quả to lớn trong việc thu nhận hoạt chất
Huperzine A , tiết kiệm thời gian và chi phí hơn phƣơng ph p chiết xuất từ
cây. Hiện nay trên thế giới, c c nhà khoa học Trung Qu c - nơi đang sản xuất
nhiều Huperzine A làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp dƣợc điều chế
thu c hỗ trợ chữa trị bệnh Alzheimer nhất - đã tiến hành nghiên cứu và phân
lập đƣợc một s

chủng nấm nội sinh c

khả năng sản sinh hoạt chất

Huperzine A , c c chủng này đã và đang đƣợc nghiên cứu c c điều kiện lên
men để c thể t ch chiết một lƣợng lớn Huperzine A phục vụ cho ngành công
nghiệp dƣợc trong hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer.
Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cƣa đƣợc ph t hiện tại Sa Pa, Lâm
Đồng ở độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dƣợc liệu quý hiếm, thuộc danh
s ch "đỏ" trong Chƣơng trình Nghiên cứu bảo tồn và ph t triển nguồn gen
bản địa quý hiếm về cây thu c, nhƣng chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu và
khai th c ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Mặt kh c, c c nghiên
cứu về nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cƣa Việt Nam là chƣa c
công b . Vì vậy, đề tài “ Tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả năng
sinh tổng hợp Huperzine A từ cây Thạch tùng răng cƣa phân bố ở Sa Pa
- Việt Nam” đƣợc thực hiện với hy vọng c thể mở ra hƣớng đi mới trong
việc nghiên cứu c c chủng nấm nội sinh c khả năng sản sinh hoạt chất
Huperzine A nhằm hƣớng tới một nguồn nguyên liệu lớn c hiệu quả kinh tế
cho ngành công nghiệp dƣợc trong nƣớc và trong điều trị bệnh r i loạn trí
nhớ tại Việt Nam.
Lưu Thùy Linh

8

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Mục tiêu đề tài:
Tuyển chọn

chủng vi nấm nội sinh c

khả năng sinh tổng hợp

Huperzine A đƣợc phân lập từ cây Thạch tùng răng cƣa phân b ở Sa Pa,
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:
- Hoạt h a c c chủng vi nấm nội sinh đƣợc phân lập từ cây Thạch
tùng răng cƣa tại Sa Pa, Việt Nam
- Sàng lọc c c chủng vi nấm nội sinh c

khả năng tổng hợp

Huperzine A từ c c chủng vi nấm nội sinh trên.
- Định danh c c chủng vi nấm nội sinh bằng phƣơng ph p truyền
th ng và sinh học phân tử.

Lưu Thùy Linh

9

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan cây Thạch tùng răng cƣa
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Cây Thạch tùng răng cƣa Huperzia serrata Thông đất –
Lycopodiceae là một loài thân cỏ mọc ở đất. Đây là một loài cây dƣợc liệu
quý hiếm. Loài cây này đƣợc biết nhiều ở Trung Qu c dƣới tên là Qian
Ceng Ta, trong c c bài thu c chữa bệnh bầm m u, s t, r ch cơ và tâm thần
phân liệt. Ngoài ra ở Vân Nam – Trung Qu c, trong bài thu c dân gian,
loài cây này còn đƣợc dùng để chữa trị viêm phổi, phế ung, lao thƣơng thổ
huyết, thũng độc. Ở c c nƣớc phƣơng Tây, đặc biệt là Mỹ, Thạch tùng răng
cƣa đƣợc ứng dụng trong nhiều loại thực phẩm chức năng và đƣợc b n
rộng rãi trên thị trƣờng[45].
Năm 1948, c c nhà khoa học Trung Qu c đã chiết xuất đƣợc một
loại alkaloid c tên là Huperzine từ cây Thạch tùng răng cƣa. Dựa vào c c
công trình nghiên cứu của c c nhà khoa học Trung Qu c đã đƣợc công b
về Huperzine c trong cây Thạch tùng răng cƣa, c c nhà nghiên cứu khoa
học phƣơng Tây đã kết luận rằng chất này c t c dụng trong việc chữa trị
c c bệnh về suy giảm trí nhớ, trong đ c bệnh Alzheimer của ngƣời già.
Từ đ , Thạch tùng răng cƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng điều
trị nhiều hơn.
Tuy nhiên, hiện nay cây Thạch tùng răng cƣa đƣợc xếp vào danh
s ch “ đỏ” trong chƣơng trình Nghiên cứu bảo tồn và duy trì nguồn gen
quý hiếm về cây thu c bởi gi trị sử dụng của cây dẫn đến tình trạng khai
th c qu mức, cây c nguy cơ tiệt chủng cao ở cả trên Việt Nam và Thế
giới. Vì vậy cần thiết phải đặt ra vấn đề bảo tồn nguồn gen quý hiếm này,
song song với việc tổ chức gây trồng và từng bƣớc nghiên cứu, sản xuất và
từng bƣớc biến n thành hàng h a cung cấp cho thị thƣờng trong nƣớc và
ngoài nƣớc[43].
Lưu Thùy Linh

10

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Việt Nam, cây Thạch tùng răng cƣa đƣợc nằm trong s ch đỏ về c c loài thực
vật quý hiếm cần bảo tồn[6].
Trên thế giới, cây Thạch tùng răng cƣa còn phân b nhiều ở Trung
Qu c, nhiều nƣớc Châu Á nhiệt đới và trung Mỹ [43].
1.2 Tổng quan hoạt chất Huperzin A trong Thạch tùng răng cƣa.
1.2.1 Cấu trúc
Hoạt chất chính của thạch tùng răng cƣa là một loại alkaloid c tên là
Huperzine A. Hoạt chất này đƣợc c c nhà khoa học Trung Qu c chiết xuất lần
đầu tiên vào năm 1948 và c c thí nghiệm lâm sàng cũng nhƣ c c ứng dụng
điều trị đều đã đƣợc tiến hành ở qu c gia này. Sau khi c c công trình nghiên
cứu của c c nhà khoa học Trung Qu c đƣợc chính thức công b , c c nhà
nghiên cứu khoa học tại c c nƣớc phƣơng Tây đã kết luận rằng c c chất này
c t c dụng trong việc chữa trị c c bệnh về suy giảm trí nhớ, trong đ c bệnh
Alzheimer của ngƣời già. Alkaloid Huperzine A c khả năng t c động trực
tiếp lên não bộ với liều lƣợng thấp, chỉ tính bằng microgram nhờ khả năng
xuyên qua hàng rào mạch m u não.
Huperzine A là một alkaloid ở cây Thạch tùng răng cƣa, chứa nguyên
t N ở cả vòng 6 cạnh và mạch nh nh. N c cấu trúc h a học là C 15H18N2O (
hình 1.2). Huperzine A là một chất ức chế Cholinesterase, c nghĩa n làm
tăng lƣợng acetylcholine trong não[27,52].
1.2.2 Cơ chế hoạt động
Trong cơ thể ngƣời, não sản sinh ra một chất dẫn truyền thần kinh là
acetylcholine c chức năng quan trọng trong chuyển động cơ bắp và trí nhớ,
acetylcholine bị ức chế, gây tho i h a bởi enzyme acetylcholinesterase. AChE
chủ yếu c mặt trong hệ thần kinh trung ƣơng, xúc t c thủy phân chất dẫn
truyền AChE. Qu

trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ

cholinergic từ trạng th i hoạt động sang tình trạng nghỉ . Ở bệnh nhân
Alzheimer thấy c sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh
AChE. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đ i với ngƣời bệnh.
Lưu Thùy Linh

12

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer đƣợc đƣa ra lần
đầu tiên vào năm 1982 bởi t c giả Whitehouse và cộng sự. Sau đ , giả thuyết
này nhanh ch ng trở thành động lực cho qu trình nghiên cứu theo hƣớng cải
thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả
thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và
thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đ cải thiện triệu chứng
bệnh [49] .

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học chất Huperzine A [13]

Cơ chế hoạt động: Hoạt chất Huperzine A c t c dụng ức chế việc
sản sinh acetylcholinesterase, giúp cho việc làm giảm lƣợng enzyme này,
và khi đ lƣợng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và c c
chức năng nhận thức đƣợc cải thiện. [42] Alkaloid này c thể dễ dàng
xuyên qua hàng rào m u não và t c động trực tiếp lên c c tế b o thần kinh
não bộ. Huperzine A c t c dụng tăng cƣờng dẫn truyền thần kinh, ngăn
chặn hình thành c c mảng b m, đ m r i trong não, nuôi dƣỡng tế bào não,
từ đ c đ p ứng rất t t với bệnh Alzheimer[52]. Huperzine A đƣợc sử
dụng nhƣ một bộ truyền quan trọng giữa c c nơ-ron, đƣợc ghi nhận để gửi
c c tín hiệu liên quan đến việc mã h a ký ức. Chất dẫn truyền thần kinh
acetylcholine bị ảnh hƣởng bởi Huperzine A, trên thực tế, Huperzine A làm
tăng mức acetylcholine trong não. Không chỉ làm tăng lƣu giữ thông tin và
hình thành trí nhớ, n cũng c thể tăng cƣờng tập trung, tinh thần rõ ràng
và khả năng tính to n dữ liệu[50].
Lưu Thùy Linh

13

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

1.3 Tổng quan về vi nấm nội sinh trong thực vật.
1.3.1 Khái niệm về nấm nội sinh trong thực vật
Vi nấm nội sinh- endophytic fungi là những vi nấm s ng ở mô sâu thực
vật, nhƣng không trực tiếp hoặc gi n tiếp gây bất lợi cho cây. Vi nấm nội sinh
là một thành phấn chiếm tỉ lệ cao trong hàng ngàn đông đảo vi sinh vật s ng
nội sinh thực vật hiện nay. Vi nấm nội sinh c quan hệ chặt chẽ với cây chủ,
chúng sử dụng c c chất dinh dƣỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi
ích cho cây nhƣ tạo ra nhiều sản phẩm trao đổi chất c hoạt tính sinh học nhƣ
c c hoormon sinh trƣởng, c c chất kh ng sinh c khả năng bảo vệ cây khỏi
c c vi sinh vật gây bệnh.
1.3.2. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật.
Vi nấm nội sinh và thực vật c m i quan hệ cộng sinh hoặc tƣơng sinh,
vi nấm nội sinh xuất ph t từ một s bệnh liên quan thực vật trong qua trình
tiến h a của cây. Sự tƣơng t c giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong su t
qu trình ph t triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ
những vi sinh vất gây bệnh để cho ra những chủng vi nấm nội sinh hữu ích.
Chúng đƣợc coi là một t c nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm
ngăn chặn những t c nhân vi sinh vật gây bệnh.
Vi nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh th i của vật chủ. Ở
một s loài cây cỏ c vi nấm nội sinh s ng, ngƣời ta nhận thấy chúng c khả
năng gia tăng sức chịu đựng vô hạn hoặc chịu đƣợc độc tính của nhôm trong
nguồn nƣớc, trong môi trƣờng s ng. Ngoài bảo vệ cây ch ng lại một s yếu t
bất lợi cho ký chủ nhƣ động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự
nhiên đƣợc sinh ra từ vi nấm nội sinh cũng đã đƣợc quan s t, theo dõi, và
đƣợc kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm và khả năng tiêu diệt nhiều
mầm bệnh kh c nhau xâm nhập mô thực vật. Trƣớc thực tế này, nhiều câu hỏi
đƣợc đặt ra rằng: c c hoạt chất quý gi này do chính cây sản xuất hay là kết
quả của m i quan hệ tƣơng sinh của c c vi nấm nội sinh c ích trong mô thực
vật và cây chủ sinh ra. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một s chất
Lưu Thùy Linh

14

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

biến dƣỡng của vi nấm nội sinh không những t c động trên những mầm bệnh
thực vật mà còn c khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh
vật đơn bào gây bệnh cho ngƣời và động vật [46].
1.3.3 Ứng dụng của vi nấm nội sinh
Nhiều vi nấm nội sinh trong cây đã đƣợc ly trích, chúng c khả năng
sản sinh những chất biến dƣỡng c hoạt tính sinh học nhƣ kh ng khuẩn,
kh ng nấm, kiềm hãm kh i u, ch ng oxi h a và c c hoạt tính sinh học kh c
[46].
Vi nấm nội sinh c quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng c c
chất trong cây để tồn tại, nhƣng lại mang lại nhiều lợi ích cho cây nhƣ tạo
ra c c sản phẩm c hoạt tính sinh học cao nhƣ c c hormone sinh trƣởng,
c c chất kh ng sinh c khả năng bảo vệ cây khỏi c c vi sinh vật gây bệnh.
Nhiều tài liệu cho thấy, khi s ng cộng sinh trong mô thực vật, vi nấm nội
sinh đã sản sinh ra nhiều chất c hoạt tính sinh học nhƣ kh ng khuẩn và
kh ng nấm, ví dụ nhƣ Kennedia nigriscans – một loài cây leo ở Úc đã đƣợc
dân gian sử dụng s p nhựa để trị vết thƣơng, s t trùng, từ cây này đã ly
trích đƣợc chủng Streptomyces sp.NRRL 30562 mới sản xuất kh ng sinh
munumbicin phổ rộng.
Ở quy mô rộng, vi nấm nội sinh c t c động quan trọng trong nông
nghiệp, rừng và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu, đồng thời tiềm năng của
chúng c

ý nghĩa rất lớn trong c c lĩnh vực y học, nông nghiệp, công

nghiệp…. Nhiều vi nấm nội sinh đã đƣợc ly trích, chúng c khả năng sản sinh
ra những chất biến dƣỡng c hoạt tính sinh học nhƣ kh ng khuẩn, kh ng nấm,
kiềm hãm kh i u, ch ng oxi h a và c c hoạt tính sinh học kh c[46].
1.3.2.1 Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh
C rất nhiều nghiên cứu trên Thế Giới cho thấy: vi nấm nội sinh là một
nguồn sản xuất kh ng sinh lý tƣởng, đem lại nhiều lợi ích trong sản xuất
kh ng sinh.

Lưu Thùy Linh

15

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

- Fusarium sp. là vi nấm ly trích từ một loài dƣơng xỉ - Selaginella
pallescens, đƣợc thu nhập từ vùng bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa
Rica, sản xuất đƣợc một pentaketide mới là CR 337 c t c dụng mạnh trên
C.allbicans.
- Pestralotiopisis microspore thƣờng gặp ở rừng mƣa, sản xuất nhiều
chất c t c dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambumic c t c
dụng kh ng nấm. Chất này đƣợc ly trích nhiều từ chủng P.micospora và đƣợc
cho là chất lƣợng đặc trƣng đƣợc sản xuất bởi endophyte thực vật ở nhiều
rừng mƣa nhiệt đới.
- Ngoài ra nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã đƣợc ly trích
từ c c nguồn thực vất kh c, c c chủng nấm này c thế sản xuất c c kh ng sinh
kh ng nấm.
- Colletotrichum gloeosporioides là loại vi nấm nội sinh trong cây
Artemisia mongolica sản xuất acid colletotric c t c dụng kh ng khuẩn và
kh ng nấm Helminthosporium sativum.
- Colletotrichum sp đƣợc ly trích từ cây thanh hao hoa vàng Artemissia annua sản xuất những chất biến dƣỡng kh ng thể, kh ng vi nấm
gây bệnh cho ngƣời và vi nấm gây bệnh cho thực vật.
- Muscodor albus là vi nấm đƣợc ly trích từ cành của cây Quế (
Cinnamomum zeylanicum), vi nấm này sản xuất một s chất bay hơi c thể
ức chế vi khuẩn và nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã đƣợc
x c định cấu trúc h a học bằng GC – MS ( sắc ký khí ghép với kh i phổ), từ
đ đƣợc tổng hợp h a học. C c chất tổng hợp đƣợc c hiệu quả kh ng khuẩn,
kh ng nấm và không độc với ngƣời.
- Nodulisporium sp. Đƣợc ly trích từ cây Bontia daphnoides ( một loại
Ô-liu) sản xuất hợp chất nodulisporic c hiệu lực trừ sâu, ch ng lại ấu trùng
của ruồi xanh, nhặng….
- Muscodor vitigenus đƣợc ly trích từ cây dây leo Paullina
paullinioides sản sinh ra napthalen c t c dụng trừ rệp[48]
Lưu Thùy Linh

16

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

1.3.2.2 Vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác.
Từ môi trƣờng nuôi cấy vi nấm nội sinh, một s chất c t c động ch ng
oxi h a đã đƣợc ly trích.
Năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra đƣợc 500 chất kh ng sinh thì 20 năm
sau, năm 1975 đã tìm ra đƣợc 5.000 chất kh ng sinh. Theo Berdy, năm 1984
trên thế giới đã biết đƣợc hơn 13.000 chất kh ng sinh đƣợc sản xuất từ thiên
nhiên. Theo đ , từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên đƣợc
ly trích từ cây thông đỏ - Taxus brevifolia, vi nấm này sản xuất paclitaxel chất ức chế c c thoi phân bào trong qu trình phân chia tế bào, c phổ kh i
tƣơng tự nhƣ paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus). Một s nhà khoa
học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của c c cây thuộc chi Thông đỏ và
tìm thấy c c hoạt chất taxol (một hoạt chất đƣợc sử dụng hiệu quả nhất trong
điều trị bệnh ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi
thông đỏ (Taxus) luôn là 1 nguồn giàu nấm nội sinh.
Năm 1995 – 1996, c c nhà nghiên cứu đã phân lập đƣợc hàng trăm loài
nấm nội sinh từ c c cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. C thể n i
c c cây thông đỏ là một kho b u chứa nhiều vi sinh vật chƣa từng đƣợc ph t
hiện và rất đ ng chú ý, chúng tƣơng t c với nhau và với cây chủ. Những nấm
đã đƣợc biết là c tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis
microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, ngƣời ta
cũng đã ph t hiện đƣợc sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh kh c phân lập
từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp.,
Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp.
Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi nấm nội
sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 đƣợc ly trích từ một loài thực vật
họ đậu c

hoa

munumbicin,

- Kennedia nigriscans, sản xuất kh ng sinh phổ rộng

kh ng

vi

khuẩn

Gram

(+)

nhƣ

Bacillus

anthracis,

M.tuberculosis đa kh ng và một s vi khuẩn kh ng thu c kh c. Streptomyces
sp. chủng NRRL 30562 ph t triển trong l cây Grevilea pteridifolia ph t triển
Lưu Thùy Linh

17

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

ở Úc, sản xuất kh ng sinh kakadumicin và echinomycin đều cho t c động
kh ng P.falciparum với LD50=7-10ng/ml.
Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng vi nấm nội sinh
Cryptospriopsis quercina đƣợc ly trích từ cây Lôi công thằng (Tripterigeum
wilfordii) – là một loài thực vật c hoa trong họ Dây g i, vi nấm này c thể
sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đ , cryptocandin kh ng một s vi
nấm gây bệnh cho ngƣời nhƣ Candida albicans, Trichophyton spp. và ch ng
một s

nấm gây bệnh thực vật nhƣ Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis

cinerea. Cryptocin c t c dụng kh ng Pryriaria oryzae và một s vi nấm gây
bệnh thực vật. Cùng năm 2003, T. Taechowisan và S.lumyong đã nghiên cứu
về endophyte c hoạt tính kh ng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia
galanga.
Năm 2006, N.S.H.Raviraja và cộng sự nghiên cứu về khả năng kh ng
nấm của c c vi nấm nội sinh từ c c cây dƣợc liệu miền Tây Ấn Độ…
Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập đƣợc Fusarium solani từ
Camptotheca acuminate c khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất
(9-methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) c khả năng ch ng
ung thƣ.
Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về
endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa). C c chất dinh dƣỡng trong thân
rễ của cây nghệ là môi trƣờng s ng đa dạng cho c c nh m vi khuẩn kh c
nhau. Một s vi khuẩn nội sinh liên quan c thể thúc đẩy tăng trƣởng. Trong
nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. đƣợc phân lập từ thân
rễ củ nghệ và cả hai chủng đã đƣợc tìm thấy c khả năng để sản xuất IAA qua
phân tích HPLC.
Năm 2012, Cui và cộng sự đã ph t hiện vi nấm nội sinh Fusarium
oxysporum phân lập từ cây Bạch quả - Ginkgo biloba c khả năng sản xuất
ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch [48].
Lưu Thùy Linh

18

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cƣa sinh
tổng hợp hoạt chất Huperzine A trong nƣớc và trên Thế giới.
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới.
Hầu hết hoạt chất Huperzine A hiện đang sử dung đƣợc t ch chiết từ
cây Thạch tùng răng cƣa và c c cây thuộc họ Thạch tùng. Tuy nghiên, trong
cây Thạch tùng răng cƣa chứa rất ít lƣợng Huperzine A. Bên cạnh đ , loài cây
này phải mất nhiều thời gian để ph t triển (phải mất ít nhất 15 năm từ khi bào
tử nảy mầm cho đến giai đoạn trƣơng thành), đòi hỏi điều kiện ph t triển ngặt
nghèo và chi phí cao trong trồng trọt. Với thực trạng này, việc sản xuất hoạt
chất Huperzine A từ cây Thạch tùng kh c thể đƣa vào quy mô công nghiệp
đƣợc. Mặc dù c c nghiên cứu gần đây đã chỉ ra nhân gi ng in vitro c thể
cung cấp lƣợng Huperzine A cao hơn cây trồng tự nhiên [37, 27]; tuy nhiên,
n vẫn chƣa thể đ p ứng đƣợc hết nhu cầu của ngành công nghiệp dƣợc.
Gần đây, nấm nội sinh thực vật đƣợc phân lập từ c c loại cây đƣợc
chấp nhận nhƣ là nguồn nguyên liệu quan trọng cung cấp cho ngành công
nghiệp dƣợc. Một lƣợng lớn c c chất c cấu trúc mới và hoạt tính sinh học đa
dạng đã đƣợc chiết xuất từ nấm nội sinh [15]. Do vậy, c c nhà khoa học đã
quan tâm đến việc nghiên cứu c c chủng nấm nội sinh trong cây Thạch tùng
răng cƣa c khả năng sản sinh hoạt chất Huperzine A nhằm thay thế cho
phƣơng ph p chiết xuất hoạt chất từ cây trồng tự nhiên, giúp tăng cƣờng
lƣợng Huperzine A phục vụ ngành công nghiệp dƣợc. Cho đến này, c nhiều
công b về việc nghiên cứu phân lập c c chủng nấm nội sinh c khả năng sản
sinh hoạt chất Huperzine A từ nhiều loại cây họ Thạch tùng. Năm 2007, tại
Trung Qu c, Li và cộng sự đã phân lập đƣợc chủng Acremonium sp.
2F09P03B từ cây Thạch tùng răng cƣa [25]. Sau đ , vào năm 2009, Ju và
cộng sự đã phân lập đƣợc hai chủng Blastomyces sp. và Botrytis sp. từ cây
Phleg – mariurus cryptomerianus (một loài cây trong họ Thạch tùng). C c nhà
khoa học Trung Qu c tiến hành khai th c thu nhập c c mẫu cây Thạch tùng
tại Vƣờn B ch Lộc Sơn (Giang Tây, Trung Qu c) để cung cấp nguồn cây cho
Lưu Thùy Linh

19

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

việc nghiên cứu nấm nội sinh [20]. Kết quả cho thấy, dựa vào việc phân tích
trên trình tự rADN, năm chủng: Slf14, Slf5, Slf22, Ssf5 trong s 69 chủng đã
phân lập đƣợc phân loại vào chi Shiraia; trong đ , hai chủng Slf14 và Slf15
c khả năng sản sinh hoạt chất HupA. Chủng Slf14 cho sản lƣợng Huperzine
A là 327,8 µg/l cao hơn hẳn so với chủng Slf15. Với phƣơng ph p phân loại
bằng đặc điểm hình th i và bằng phân tích trình tự ITS – rDNA, Shi và cộng
sự (2005) đã phân lập đƣợc 4 chủng là Cephalosporium sp., Plasmoparad sp.,
Saccharomyces sp., Penicillium sp. nội sinh trong cây H. Serrata trồng tại
tỉnh An Huy [33]; Huang và cộng sự (2009) cũng đã phân loại đƣợc 4 chủng
nấm nội sinh trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh Hồ Nam (Cladosporium sp.,
Penicillium sp., Fusarium sp., và Coniothyrium sp.) [18].
1.4.2 Các nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cƣa đƣợc tìm thấy ở Sa Pa, Đà Lạt ở độ
cao từ 1.000 m trở lên. Đây là một loại thảo dƣợc quý, nhƣng chƣa đƣợc quan
tâm nghiên cứu và khai th c ứng dụng trong điều trị. C c nghiên cứu về nấm
nội sinh trong cây Thạch tùng răng cƣa ở Việt Nam là chƣa c .
Ngày càng c nhiều ca mắc bệnh Alzheimer hơn nữa, vì vậy việc
nghiên cứu phân lập c c chủng nấm nội sung c khả sản sinh hoạt chất HupA
sẽ là một hƣớng đi mới c triển vọng trong việc sản xuất thu c điều trị bệnh,
giúp giảm tỉ lệ ngƣời mắc bệnh[52].
1.5 Nghiên cứu định danh vi nấm
1.5.1 Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống
Kỹ thuật quan s t những đặc điểm và hình th i của vi nấm nội sinh trên
môi trƣờng nuôi cấy đƣợc xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì n xuất
hiện sớm và đƣợc sử dụng rộng rãi trong qu trình phân lập. Định danh bằng
phƣơng ph p truyền th ng là những kỹ thuật quan s t đặc điểm hình th i
khuẩn lạc, đặc điểm vi học…từ đ định dạng sơ bộ vi sinh vật.
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch
- Hình d ng
Lưu Thùy Linh

20

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

- Kích thƣớc ( đƣờng kính, chiều dày)
- Dạng mặt ( nhung mƣợt, mịn, len x p, dạng hạt, lồi lõm, c khía hay
không..)
- Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dƣới
- Dạng mép khuẩn lạc ( mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo..)
- Giọt tiết nếu c ( nhiều, ít, màu sắc)
- Mùi khuẩn lạc ( c , không mùi)
- Sắc t hòa tan ( màu của môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc) nếu c
- C c cấu trúc kh c: b sợi, b gi
Quan sát đặc điểm vi học
- Sợi nấm : c v ch ngăn, không c v ch ngăn, c mấu.
- Bào tử trần: kiểu ph t sinh bào tử trần, hình dạng, kích thƣớc, màu
sắc, bề mặt, c ch sắp xếp đơn độc chuỗi g c non, chuỗi g c già, kh i cầu.
- Bộ m y mang bào tử: nang bào tử và nang bào tử nhỏ, hình d ng,
kích thƣớc, màu sắc, bề mặt của nang, cu ng nang, không hoặc c nh nh, bào
tử nang ở nấm tiếp hợp.
- Bộ m y mang bào tử trần: gi bào tử trần – kích thƣớc, đƣờng kính,
chiều dài, bề mặt, màu sắc.
- Tế bào sinh bào tử trần: Kiểu tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng
c khuyên ở đỉnh, dạng sinh bào tử trần đồng thời, nhƣ dạng (dạng bình, dạng
phân đ t). Dạng sinh bào tử trần không đồng thời , bào tử đính kiểu nảy chồi,
dạng sinh bào tử trần qua lỗ để lại sẹo ... hình dạng, kích thƣớc, màu sắc, c ch
sắp xếp (đơn độc hoặc thành cụm, thành vòng), vị trí (trên sợi nấm, dọc theo
gi bào tử trần, c c nh nh hoặc ở đính gi ).
- Thể quả túi cần khảo s t vị trí, s lƣợng, hình dạng, kích thƣớc, màu
sắc, bề mặt của thể quả, quan s t túi bào tử bào tử túi về hình dạng, kích
thƣớc bề mặt.
Khi nuôi cấy ở môi trƣờng thích hợp, mẫu vi nấm nuôi cấy sẽ c những
biểu hiện hình th i đặc trƣng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng t n nấm
Lưu Thùy Linh

21

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính nhƣ túi bào tử, bào tử v ch dày trên
bề mặt môi trƣờng nuôi cấy.
Tiến hành định loại:
Căn cứ vào kết quả quan s t đầy đủ, chính x c c c đặc điểm của khuẩn
lạc và c c đặc điểm vi học tiến hành x c định tên loài (hoặc thứ nếu c ) chủng
nấm m c nhƣ sau:
Dùng kho phân loại của c c nh m phân loại bậc cao (ngành, ngành
phụ, lớp, bộ, họ, chi) để x c định lần lƣợt xem những nấm m c thuộc chi nấm
m c nào. Tiếp theo dùng kho phân loại của chi đ để x c định đến loài (thứ)
bằng c ch so s nh tất cả c c đặc điểm đã quan s t đƣợc của chủng nấm m c
đ với c c đặc điểm tƣơng ứng của loài nào đ trong kho phân loại. Nếu c c
đặc điểm so s nh phù hợp với đặc điểm của loài mô tả trong kho , ta x c định
đƣợc tên loài của chủng nấm m c cần định loại.
Nếu c chủng nấm mẫu của loài (hoặc thứ) vừa x c định thì tiến hành
so s nh c c đặc điểm hình th i khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với
c c đặc điểm tƣơng ứng của chủng cần định loại. Nếu c c đặc điểm của 2
chủng phù hợp với nhau thì c thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của
chủng nấm m c cần định loại.
Nếu c chủng nấm mẫu của loài (hoặc thứ) vừa x c định thì tiến hành
so s nh c c đặc điểm hình th i khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với
c c đặc điểm tƣơng ứng của chủng cần định loại. Nếu c c đặc điểm của 2
chủng phù hợp với nhau thì c thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của
chủng nấm m c cần định loại.
1.5.2 Định danh bằng phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử
1.5.2.1 Phương pháp PCR
Khái niệm
Phƣơng ph p PCR ( Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi
trùng hợp) là phƣơng ph p invitro để nhân bản nhanh một đoạn AND nào đ ,
chúng ta c thể tạo ra một s lƣợng lớn c c bản sao của một đoạn ADN mong
Lưu Thùy Linh

22

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

mu n. Phản ứng dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme ADN – polymerase –
do Karry Mullis cùng cộng sự ph t minh vào năm 1985. Đây là một kỹ thuật
c độ nhạy rất cao mà chỉ cần một kh i lƣợng mẫu ban đầu hạn chế.
Nguyên tắc của phương pháp PCR
Nguyên tắc của phƣơng ph p là tạo lƣợng lớn c c đoạn ADN đặc thù từ
DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của ADN – polymerase để tổng hợp sợi
mới bổ sung.
C c yếu t cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:
1. Sợi khuôn ADN chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm
cạnh đoạn cần nhân để thiết kế 2 mồi oligonucleotide.
2. Hai đoạn mồi ngắn để x c định c c điểm bắt đầu tổng hợp ADN. Là
tín hiệu chỉ hƣớng đi ( 5’ -> 3’) của enzyme ADN – polymerase. Mồi dài
khoảng 20 nucleotide và c c nucleotide ở hai đầu mồi không tƣơng tự kết hợp
với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
3. C đầy đủ c c loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
4. Môi trƣờng đệm cung cấp ion Mg và nƣớc tinh khiết không c
enzyme ARNase và ADNase.
5. Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus ( Taq)
Các giai đoạn của phản ứng PCR
Bƣớc 1: Thực hiện qu trình biến tính ADN bằng nhiệt
Đƣa AND vào dung dịch phản ứng ( gồm c c thành phần cần thiết
cho sự sao chép), tăng nhiệt độ của dung dịch lên tới 90 – 98oC, thời gian lƣu
tƣơng ứng khoảng từ 30s – 1 phút. Tại nhiệt độ này, c c phân tử ADN mạch
kép bị t ch ra ( do liên kết hidro bị đứt), tạo nên c c sợi đơn dùng để làm
khuôn tổng hợp mới.
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng lai
Sau bƣớc 1, ngay lập tức nhiệt độ đƣợc hạ xu ng từ từ và nhỏ hơn
nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37oC – 68oC và thời gian lƣu là 30s – 1
phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn. Mồi đƣợc tổng hợp h a học,
Lưu Thùy Linh

23

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

c mồi ngƣợc và mồi xuôi. Nguời ta còn c thể dựa vào trình tự nucleotide ở
đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đ bổ sung ADN – polymerase để kéo
dài mồi.
Bƣớc 3: Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là tổng hợp kéo dài (
extension).
Nâng nhiệt phản ứng lên 72oC trong vài chục giây đên 1 phút để ADN
– polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng
phụ thuộc vào sợi ADN cần khuếch đại.
Kết thúc một chu kỳ từ một ADN kép mẹ tổng hợp 2 sợi ADN kép con.
Cứ nhƣ vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ . Sau chu kỳ cu i, nhiệt độ
đƣợc duy trì ở 72oC trong khoảng từ 5 – 10 phút sao cho tất cả sợi đơn xoắn lại
và tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đ hạ xu ng 4oC để bảo quản sản phẩm.
Phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng c ch chạy điện gi trên gel agarose
nồng độ từ 0,8% - 2% để ph t hiện sự đa hình của c c đoạn ADN đặc thù,
hoặc c c đoạn ADN bị thay đổi do c c t c nhân nào đ ( đột biến, t i tổ hợp).
( s ch cơ sở di truyền).
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
a) DNA mẫu làm khuôn
Phản ứng PCR t i ƣu xảy ra khi mẫu ADN phải tinh sạch, không đƣợc
dài qu , thƣờng khuếch đại t t đ i với đoạn ADN dài khoảng 1- 1,5kb.
b) Enzyme DNA – polymerase
Chất lƣợng của phƣơng ph p phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của
enzyme polymerase ( do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ kh c nhau).
c) Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng và
c hiệu quả cao. Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:
- Trình tự mồi đƣợc chọn không c sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi
ngƣợc và cũng không tạo những cấu trúc kẹp t c.
- Mồi phải chọn đặc trƣng cho ADN cần khuếch đại và không trùng
với c c trình tự lặp lại trên gen.
Lưu Thùy Linh

24

CNSH 1302


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

- Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc không qu lớn.
- Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 – 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10
nucleotide, mồi b m không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh
hƣởng đến cơ chế tổng ở bƣớc 3.
- Tm mồi xuôi và mồi ngƣợc không c ch nhau qu xa, thông thƣờng
trong khoảng từ 4 – 5oC, và nhiệt độ n ng chảy của mồi khoảng 72oC.
d) Ảnh hưởng của các nucleotide
Cần phải c b n loại nucleotide dạng triphosphate nhƣ: dATP, dTTP,
dGTP, dCTP. Nồng độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với
khoảng 20 – 200 µM cho mỗi loại nucleotide. Nếu mất trạng th i cân bằng thì
sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ c c nucleotide cao hay thấp hơn sẽ
dẫn đến hiện tƣợng sao chép giả.
e) Môi trường phản ứng
Ion Mg +2 là thành phần không thể thiếu đƣợc của phản ứng PCR, nồng
độ Mg

+2

t i ƣu để thực hiện PCR từ 150 - 200µM. Nồng độ chuẩn cho từng

khoản tƣơng ứng, phải đƣợc x c định trong điều kiện thì nghiệm nhất định.
Nƣớc sử dụng cho phản ứng PCR phải là nƣớc tinh khiết, không chứa
bất kỳ ion kim loại nào. Không đƣợc chứa c c enzyme cắt hạn chế và c c
enzyme phân hủy acid nucleic.
Môi trƣờng dung dịch đệm phải ổn định.
f) Thời gian và số lượng chu kỳ
Qua nghiên cứu cho thấy: tổng thời gian cho mỗi bƣớc của một chu kỳ
và của chu kỳ đầu với c c chu kỳ tiếp theo là kh c nhau. Ngoài ra, thời gian
cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài của đoạn ADN cần nhân dòng.
g) Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị cần đ p ứng yêu cầu thay đổi đƣợc nhiệt độ nhanh và chính
x c. Tr nh t i đã sự b c hơi nƣớc trong qu trình phản ứng. Tuy nhiên, ứng
với mỗi phản ứng cụ thể c c c thiết bị và dụng cụ khuếch đại riêng.
Lưu Thùy Linh

25

CNSH 1302


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×