Tải bản đầy đủ

Xác định tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục candida của các bệnh nhân tại bệnh viện sản nhi quảng ninh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM NẤM SINH DỤC CANDIDA
CỦA CÁC BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN
SẢN NHI QUẢNG NINH

Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Trung
ThS. Tạ Thị Thu Hợp
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Ngọc

Lớp

: 13.01

Hà Nội, 2017



VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Viện Đại học Mở
Hà Nội, đặc biệt các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học đã dạy dỗ em
trong suốt 4 năm học tại trường, trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học
và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm bài báo cáo tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị
Trung, công tác tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS
Tạ Thị Thu Hợp, Trưởng khoa Huyết học-Vi sinh-Sinh học Phân tử -Bệnh
viện Sản nhi Quảng Ninh đã truyền cho em phương pháp học tập và nghiên
cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá
trình nghiên cứu vừa qua.
Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú,anh chị trong khoa
Vi sinh-sinh học phân tử - Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh đã giúp đỡ em rất
nhiều trong thời gian thực tập.
Cuối cùng,em xin gửi tới gia đình, người thân,bạn bè lời cảm ơn sâu
sắc vì đã luôn giúp đỡ,động viên em trong suốt thời gian học tập.

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

Khóa luận tốt nghiệp


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 3
1.1. Tổng quan chung về nấm Candida sp. Y học ...................................... 3
1.1.1. Đại cương về nấm candidas ......................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm của nấm Candida .......................................................... 3
1.2. Các yếu tố thuận lợi dễ nhiễm nấm candida ........................................ 4
1.2.1. Yếu tố nội lai ............................................................................... 4


1.2.2. Yếu tố ngoại lai ............................................................................ 5
1.3. Triệu chứng lâm sàng.......................................................................... 5
1.3.1. Ở nữ giới ...................................................................................... 5
1.3.2. Ở nam giới ................................................................................... 6
1.4. Cơ chế gây bệnh ................................................................................. 6
1.5. Phòng và diệu trị bệnh do nhiễm nấm Candida ................................... 7
1.5.1. Nguyên tắc điều trị ....................................................................... 7
1.5.2. Phòng ngừa bệnh nhiễm nấm Candida ......................................... 8
1.6. Phương pháp phát hiện ....................................................................... 8
1.6.1. Phương pháp soi tươi ................................................................... 8
1.6.2. Phương pháp nuôi cấy .................................................................. 8
1.6.3. Phương pháp PCR ........................................................................ 9
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 10
2.1. Địa điểm thực hiện............................................................................ 10
2.2. Đối tương nghiên cứu ....................................................................... 10
2.2.1. Đối tượng ................................................................................... 10
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân ........................................................ 10
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ ..................................................................... 10
2.3. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................... 10

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

Khóa luận tốt nghiệp


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
2.3.1. Vật liệu ...................................................................................... 10
2.3.2. Trình tự mồi ............................................................................... 11
2.3.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ....................................... 11
2.3.3.1. Hóa chất .............................................................................. 11
2.3.3.2. Các dụng cụ nghiên cứu ...................................................... 12
2.3.3.3. Các thiết bị nghiên cứu........................................................ 12
2.3.4. Các loại môi trường sử dụng ...................................................... 12
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 12
2.4.1. Phương pháp soi vi sinh chẩn đoán trực tiếp .............................. 12
2.4.1.1. Phương pháp soi tươi trực tiếp ............................................ 12
2.4.1.2 Kỹ thuật nhuộm soi tiêu bản Gram ....................................... 13
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy ................................................................ 15
2.4.3. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen của nấm ........................... 16
2.4.3.1 Tách chiết DNA hệ gen của nấm .......................................... 16
2.4.3.2 Làm sạch DNA hệ gen của nấm sau tách chiết ..................... 17
2.4.4. Phương pháp khếch đại gen bằng cặp mồi đặc hiệu ................... 18
2.4.5 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế ........................ 19
2.4.6 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ................................ 20
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 22
3.1. Kết quả thu thập mẫu ........................................................................ 22
3.2. Danh sách mẫu đã thu thập ............................................................... 23
3.3 Đặc điểm hình thái nấm Candida quan sát được trong xét nghiệm ..... 25
3.1.1 Đặc điểm hình thái nấm nấm Candida quan sát được trong
nhuộm soi ........................................................................................... 25
3.3.2. Đặc điểm hình thái nấm Candida trong quá trình nuôi cấy ......... 27
3.4. Tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida trong mẫu nghiên cứu bằng phương
pháp soi trực tiếp ..................................................................................... 28

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

Khóa luận tốt nghiệp


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
3.4.1 Các loại vi sinh vật phát hiện được ............................................. 28
3.4.2. Tỉ lệ nhiệm nấm sinh dục Candida xác định qua soi trực tiếp ..... 29
3.5. Một số đặc điểm sinh hóa của Candida ............................................. 30
3.6. Xác định loài nấm Candida bằng phương pháp PCR......................... 30
3.4.1 Đặc điểm của các mẫu được định loài bằng phương pháp PCR ... 30
3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen của các mẫu xác định là Candida........... 32
3.4.3. Kết quả khuếch đại DNA bằng cặp mồi ITS1-ITS4 ................... 34
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................ 39
1. Kết luận .............................................................................................. 39
2. Kiến nghị ............................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 40

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

Khóa luận tốt nghiệp


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh nấm Candida. ......................................................... 4
Hình 2.1: Quy trình nhuộm Gram ....................................................... 14
Hình 3.1: Phòng thí nghiệm xét nghiệm mẫu ....................................... 22
Hình 3.2. Dụng cụ lấy mẫu ................................................................ 23
Hình 3.3: Một số hình ảnh về mẫu bệnh phẩm được nhuộm soi dưới
kính hiển vi. ........................................................................ 26
Hình 3.4: Mẫu bệnh phẩm nấm được nuôi cấy trong môi trường
sabouraud ........................................................................... 27
Hình 3.5: Mẫu bệnh phẩm nấm được nuôi cấy trong môi trường
sabouraud thạch nghiêng ..................................................... 28
Hình 3.6. DNA hệ gen tách chiết từ 22 mẫu nấm được kiểm tra bằng
điện di trên gel agarose 0,8% ............................................... 33
Hình 3.7. Kết quả khuếch đại DNA bằng cặp mồi IST1 – ITS4 và
kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% .......................... 35
Hình 3.8. Sản phẩm phản ứng PCR đã cắt bởi enzyme Msp I và
kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,7% .......................... 37

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

Khóa luận tốt nghiệp


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR ................................................. 18
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR ............................. 19
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme Msp I ............. 20
Bảng 3.1. Danh sách mẫu bệnh phẩm của 40 bệnh nhân được chọn
để tiến hành xét nghiệm. ...................................................... 23
Bảng 3.2. Đặc điểm sinh hóa của một số loài Candida ......................... 30
Bảng 3.3. Đặc điểm của các mẫu trước khi xét nghiệm PCR ................ 30
Bảng 3.4 . Kích thước của sản phẩm PCR, sản phẩm cắt bằng Msp I
cuar các loài Candida tương ứng .......................................... 36
Bảng 3.5 . Kích thước của sản phẩm PCR ITS1-ITS4 trước và sau
khi cắt bằng Msp I ............................................................... 37
Bảng 3.6 . Sự đa dạng của các loài nấm trong số các mẫu khảo sát ....... 38

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

Khóa luận tốt nghiệp


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LỜI MỞ ĐẦU
Nhiễm nấm là một trong những bệnh khá phổ biến trên thế giới. Nấm
tồn tại ở khắp mọi nơi: môi trường đất, nước,không khí,ở thực vật,động vật
và trên cơ thể người. Khi gặp điều kiện thuận lợi như nóng ẩm ,sức đề kháng
suy giảm…nấm sẽ phát triển và gây bệnh. Bệnh do nấm gây ra gặp nhiều ở
các nước nhiệt đới và ôn đới [29].
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa có nhiệt độ và độ ẩm cao
là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển và dễ dàng gây nhiễm nấm ở
người. Bên cạnh đó, xu hướng ngày càng gia tăng các bệnh nhiễm khuẩn
đường sinh sản (Reproductive tract infection– RTI) và bệnh lây truyền qua
đường tình dục (Secxually transmitted infection - STI), đặc biệt trước sự
bùng nổ đại dịch HIV/AIDS. Vì vậy, tỷ lệ các bệnh do nhiễm nấm cơ hội
ngày càng gia tăng [3]. Trong đó, viêm âm đạo do nấm hiện đang là một vấn
đề quan trọng của chăm sóc sức khỏe sinh sản. Bệnh có thể gặp ở mọi lứa
tuổi nhưng thông thường nhất là phụ nữ trong thời kỳ sinh đẻ và có tỷ lệ mắc
bệnh cao trong cộng đồng [58]. Klein Catherine (2012) thấy khoảng 70-75%
phụ nữ nhiễm nấm âm đạo ít nhất một lần trong đời và hơn một nửa số hộ bị
tái phát hàng năm [53].
Biểu hiện lâm sang nhiễm nấm vùng niêm mạc âm hộ, âm đạo thường
không đặc hiệu như: Ngứa,đau rát, viêm trợt niêm mạc, tiết dịch, chảy
máu…Bệnh ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cuộc sống của người bệnh. Nếu
bệnh không được điều trị đúng và kịp thời có thể diễn biến dai dẳng, tiến
triển nặng nề gây nhiều biến chứng ảnh hưởng đến các cơ quan phủ tạng
thậm chí gây vô sinh hoặc tử vong [10]. Nguyên nhân điều trị thất bại liên
quan đến các yếu tố như cơ thể vật chủ sử dụng thuốc và vi nấm gây bệnh.
Trong đó các yêu tố liên quan đến vật chủ thường có vai trò quan trọng đưa
đến hiện tượng kháng thuốc [27]. Những năm gần đây,cùng với việc ứng
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

1

Khóa luận tốt nghiệp


dụng những thành tựu mới của y học,việc sử dụng rộng rãi các thuốc kháng
nấm đang là vấn đề đáng lo ngại. Trên thực tế lâm sàng đã có nhiều trường
hợp không đáp ứng với kháng sinh kháng nấm [1], [2], [3]. Nhiều nghiên
cứu khác nhau chỉ ra rằng nhiễm nấm Candida âm đạo dai dẳng ,tái phát là
do chúng đã sinh ra kiểu gen kháng thuốc thông qua những biến đổi về hình
thái và tính chất ngay trong môi trường có thuốc kháng nấm [36].
Thực trang trên cho thấy, nếu thiếu điều kiện xét nghiệm có thể gặp
khó khăn trong việc tìm nguyên nhân để chuẩn đoán và điều trị bệnh một
cách hiểu quả [27]. Hiện nay có rất nhiều phương phát, nhiều kỹ thuật để
phát hiện nấm và các tác nhân gây bệnh đường sinh dục. Tùy thuộc và điều
kiện và cơ sở vật chất, trang thiết bị hiện có mà mỗi phòng xét nghiệm có thể
triển khai các kỹ thuật đơn giản hay hiện đại.
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn, chúng tôi đề xuất đề tài:
Xác định tỷ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida của bệnh nhân đến khám tại
Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (từ 10/2016 đến 02/2017).

Mục tiêu của đề tài:
1. Xác định tỷ lệ và một số yếu tố liên quan đến nấm Candida gây bệnh
đường sinh dục của bệnh nhân đến khám tại bệnh viện.
2. Khảo sát các chủng nấm Candida gây bệnh đường sinh dục.

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

2

Khóa luận tốt nghiệp


PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan chung về nấm Candida sp. Y học
1.1.1. Đại cương về nấm candidas
Bệnh do Candida sp được viết trong y văn từ thời Hypocrate và Galen
dưới những tên gọi khác nhau như: Monila, Candida…Năm 1792, Frank mô
tả lâm sàng căn bệnh này. Năm 1894, Wilkinson xác định các triệu chứng
lâm sàng của bệnh liên quan tới căn nguyên do nấm. Đến 1923 Berkhout mô
tả rất chi tiết nấm này dưới tên được thống nhất Candida [28].
C. albicans là một loại nấm men sinh sản bằng đơn bào nảy chồi. Bên
cạnh đó có thể có sợi nấm giả gồm các tế bào dài dính vào nhau bởi một điểm
nhỏ và dễ gẫy. Năm 1952, người ta đã phát hiện có khoảng 30 loài Candidas
liên quan đến y học trong số 300 giống đã được tìm thấy. Ngày nay có
khoảng 35 loài liên quan đến y học đã được xác định. Trong các loài đó thì C.
albicans có độc tính cao nhất và hay gây bệnh ở người. Ngoài ra còn có C.
tropicalis, C. pseudotropicalis, C. parakrusei, C. krusei, C. guillermondi mà
trên lâm sàng cũng hay gặp.
Những loài candida thường tạp sinh. Nhưng trong điều kiện thuận lợi
thì gây bệnh (gây bệnh cơ hội). Vị trí của canbicans trong phân loại dạng
nấm men. Theo Lodder có 2 loại nấm men là: Men có nang đảm: sinh sản
bằng nang đảm (ascus) trong đó điển hình là nấm men saccharomyces. Men
không có nang đảm: hợp thành họ lớn cryptococcacaae. Và nấm candida là
một trong những loài thuốc họ cryptococcacea. Tất cả các bệnh do nấm
candida gây ra thì gọi là bệnh candidose (ngày xưa gọi là bệnh levures,
1.1.2. Đặc điểm của nấm Candida
Candida là một nấm men tồn tại khá phổ biến trong thiên nhiên, kí sinh
chủ yếu trên người và súc vật. Ngày nay, nấm Candida là một trong những

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

3

Khóa luận tốt nghiệp


căn nguyên gây bệnh thường gặp nhất (Hình 1.1).

Hình 1.1. Hình ảnh nấm Candida.
- Candida thuộc chi nấm men, họ Cryptococcaceae.
- Tồn tại trạng thái đơn bào có nhân chuẩn.
- Hình dạng: Là nấm không màu, vách ngăn rộng, hình tròn hoặc hình
bầu dục, đôi khi có dạng sợi hoặc vô định hình
- Kích thước dao động từ 3-10 µm , thông thường lớn hơn gấp 10 lần
so với vi khuẩn.
- Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi. Khi bào từ chồi được
sinh ra theo dạng tuyến tính không phân cắt thì hình thành nên cấu trúc gọi là
giả sợi nấm.
- Khả năng thích nghi với môi trường cao.
- Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoa
quả, rau dưa, mật mía.
1.2. Các yếu tố thuận lợi dễ nhiễm nấm candida
1.2.1. Yếu tố nội lai
Bệnh nhiễm trùng cấp tính hay mãn tính; Bệnh chuyển hoá: tiểu
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

4

Khóa luận tốt nghiệp


đường, mập phì; Thiếu các sinh tố B (B2, B6, PP và C); Sử dụng các kháng
sinh có phổ rộng kéo dài; Sử dụng cocticoid kéo dài; Sử dụng các thuốc
kháng tế bào (điều trị ung thư); Bệnh đái đường, bỏng, ung thư, nhiễm
HIV/AIDS, thai nghén; Sau phẫu thuật thay van tim; Bệnhnhân suy mòn, suy
kiệt; Viêm sau lậu;
1.2.2. Yếu tố ngoại lai
Người già, răng rụng hết; Loét do bỏng ở bệnh nhân bỏng; Người
hay tiếp xúc với nguồn nước, hoa trái, thực phẩm, công nhân sản xuất
bia, thợ giặt...;
1.3. Triệu chứng lâm sàng
1.3.1. Ở nữ giới
Triệu chứng cơ năng: thường không điển hình.
Ngứa, đau rát, khí hư màu trắng váng sữa, mùi hôi, bột dính, tiểu buốt.
Đau khi giao hợp, pH âm đạo thay đổi.
Triệu chứng thực thể: Khám từ ngoài vào trong thấy có các triệu chứng
như sau:
Âm hộ: Đỏ phủ toàn bộ hoặc từng đám, bờ giới hạn rõ. Môi lớn đỏ,
rãnh giữ môi lớn và môi bé phủ dịch tiết trắng đục. Làm kỹ thuật lau sạch
dịch tiết thấy niêm mạc màu đỏ sẫm, bóng và có bờ không đều nham nhở
kèm một lớp viền vảy đỏ bên ngoài.
Âm đạo: Thành niêm mạc âm đạo phù nề, xung huyết và có màu đỏ
tươi. Có dịch màu kem dính như phủ bột ở thành âm đạo, có khi không thấy
rõ do xuất hiện nhiều dịch, đôi khi lẫn mủ. Nhưng triệu chứng thường gặp
hơn là dịch âm đạo trắng đục và lổn nhổ như váng sữa. Cùng đồ sau thường
có nhiều dịch đọng lại giống như cặn sữa. pH âm đạo thường dưới 4,5. Mùi
dịch bình thường, nghiệm pháp Sniff không có mùi cá ươn.
Cổ tử cung: Phù nề, trơn loét, có thể viêm lộ tuyến. Cổ tử cung phủ
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

5

Khóa luận tốt nghiệp


một lớp màng trắng như màng giả, lấy ra dễ dàng.
Khi viêm âm đạo lây lan đến lớp tế bào tuyến cổ trong cổ tử cung, có
khả năng sẽ lây lan đến lớp niêm mạc tử cung và vòi trứng. Do đó, có khả
năng gây viêm nhiễm vùng chậu và tắc vòi trứng gây vô sinh [6].
1.3.2. Ở nam giới
Viêm qui đầu do candida:
Hay gặp ở người có vợ (bạn tình) bị viêm âm đao do nấm men hoặc bệnh
nhân mắc bệnh tiểu đường. Tổn thương bắt đầu bằng mụn nước, mụn mủ, khi
vỡ để lại các vết trợt tròn, ban đỏ rải rác hoặc liên kết thành đám màu đỏ tươi, có
viền biểu bì, có chất bự trắng, có khi có vảy khô, thường ngứa [11].
Viêm niệu đạo:
Viên niệu đạo cấp do nấm Candida ít gặp. Trên lâm sàng triệu chứng
gần giống viên niệu đạo do lậu. Niệu đạo viêm xuất tiết nhiều dịch mủ, đôi
khi có màu kèm đái buốt, đái rắt [6].
1.4. Cơ chế gây bệnh
Bình thường phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ luôn chế tiết nội tiết tố
Oestrogen đều đặn. Nó có tác dụng kích thích tăng sinh làm dày lớp tế bào
biểu mô âm đạo, tạo nhiều glycogen. Nhóm vi khuẩn chủ yếu Lactobacilli đã
biến đổi glycogen thành acid lactic và acid acetic tạo nên môi trường acetic
cân bằng, hằng định với pH = 3,5-4,1. Từ đó, giúp bảo vệ biểu mô âm đạo
trước sự tăng trưởng của các vi khuẩn gây bệnh nội sinh. Ngoài ra,chúng còn
ngăn cản các vi sinh vật ngoại lai xâm nhập từ ngoài vào âm đạo.
Candida thuộc vi hệ tuy nhiên có thể bền vững hoặc thoáng qua. Bình
thường có thể tìm thấy Candida ký sinh ở trên da, trong họng miệng, đường
tiêu hóa, âm đạo… mà không gây bệnh, chúng công sinh và cân bằng trong
vi hệ bình thường. Candida thực sự gây bệnh cho người khi cơ thể suy giảm
miễn dịch và gặp yếu tố thuận lợi [11], [40].
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

6

Khóa luận tốt nghiệp


Có nhiều loại Candida, mỗi loại khác nhau có độc tính khác nhau nên khả
năng gây bệnh và độ nhảy cảm kháng sinh chống nấm cũng khác nhau [5].
Các loại Candida tồn tại được trong môi trường niêm mạc âm đạo, đầu
tiên chúng phải bám dính được vào tế bào biểu mô niêm mạc. Sau đó sâm
nhập vào tế bào biểu mô âm đạo nhờ men phân hủy protein đặc hiệu do
Candida tiết ra. Đối với C.albicans có khả năng bám dính và sâm nhập vào tế
bào biểu mô niêm mạc cao hơn các loài Candida khác. Điều này lý giải vì sao
nhiễm Candida âm đạo chủ yếu do loài C. albican gây ra [8], [28].
Khi vi nấm xâm nhập – thích nghi – nhân lên - phá hủy - gây bệnh.
Khả năng đề kháng của cơ thể đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sự
xâm nhập trước các tác nhân gây bệnh của nấm. Có 2 cơ chế bảo vệ [1], [58].
- Miễn dịch không đặc hiệu: sự tham gia lớp da, niêm mạc, hệ vi sinh vật
hội sinh, các tế bào thực bào… Ngoài ra,có sự tham gia các globulin miễm dịch
và bổ thể. Những cơ chế này vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống
lại những bệnh do nhiễm nấm cơ hội và những chủng đọc lực yếu.
- Miễn dịch đặc hiệu: sự tham giá đám ứng miễn dịch trung gian tế bào
và dịch thể. Trong đó, miễn dịch trung gian tế bào có vai trò quan trọng hơn.
Các tế bào lympho T mẫm cẩm sản sinh các lymphokine hoạt hóa đại thực
bào. Các đại thực bào được hoạt hóa đóng vai trò quyết định trong việc chống
lại nấm gây bệnh. Nhiều nghiên cứu miễn dịch học về nấm cho thấy những
người có hệ miễn dịch hoạt động tốt bệnh khỏi nhanh,còn người thiếu hụt
miễn dịch tế bào thường dai dẳng,dễ tái phát [16].
1.5. Phòng và diệu trị bệnh do nhiễm nấm Candida
1.5.1. Nguyên tắc điều trị
- Loại bỏ các yếu tố thuận lợi.
- Điều trị cả bạn tình nếu có quan hệ tinh dục trước đó.
- Dùng thuốc kháng nấm,liệu trình điều trị từ 3-7 ngày hoặc liều duy
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

7

Khóa luận tốt nghiệp


nhất tùy theo loại thuốc hoặc theo chỉ định cụ thể của bác sĩ điều trị.
- Điều trị tái phát(nếu có) hoặc điều trị dự phòng tái phát.
1.5.2. Phòng ngừa bệnh nhiễm nấm Candida
Khi đi vệ sinh, nên dùng giấy lau từ trước ra sau để tránh mang các vi
khuẩn từ hậu môn lên âm đạo.
Không thụt rửa âm đạo nếu chưa có sự đồng ý của bác sĩ vì sẽ làm mất
cân bằng môi trường âm đạo - nơi có những vi khuẩn có lợi), mất cân bằng
độ pH của âm đạo, gây nên tình trạng viêm nhiễm.
Mặc quần áo rộng rãi, thoải mái, nhất là quần áo lót, không nên mặc
quần áo quá dày, quá chật hay ẩm ướt.Thay quần lót thường xuyên, giặt phơi
ngoài nắng và ủi cả mặt trong - ngoài trước khi mặc, nên sử dụng đồ lót chất
vải cotton, giữ cho môi trường vùng kín được khô, thoáng.
Trong thời gian bị bệnh nên tránh giao hợp, nếu có thì cần sử dụng bao
cao su để tránh lây bệnh.
Giữ trọng lượng cơ thể ổn định tránh béo phì.
1.6. Phương pháp phát hiện
1.6.1. Phương pháp soi tươi
Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo, niệu đạo phát hiện nấm men và trùng
roi là phương pháp thường quy, được tiến hành ở hầu hết các cơ sở khám
chữa bệnh. Nấm men và trùng roi là một trong nhiếu nguyên nhân gây tiết
dịch âm đạo, âm hộ ở phụ nữ. Ở Nam giới có thể gặp trong các trường hợp
viêm niệu đạo tái phát và tồn lưu sau điều trị lậu và chlamydia.
1.6.2. Phương pháp nuôi cấy
Kết quả soi tươi nhận định nấm men Candida khi hình ảnh soi tươi
nhìn thấy sự hiện diện của tế bào nấm men và sợi tơ giả. Có nhiều loài
Candida có khả năng gây bệnh nhưng có trên 90% trường hợp là do C.
albicans. Nên nhiều phương pháp nuôi cấy nhằm phát hiện C. albicans đã

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

8

Khóa luận tốt nghiệp


được phát triển. Nuôi cấy bệnh phẩm trong môi trường Sabouroaud có
Chloramphenicol thường được sử dụng nhiều.
1.6.3. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR thường được sử dụng để phát hiện nhanh một tác
nhân gây bệnh. Phương pháp này có thể phát hiện được tác nhân gây bệnh từ
các mẫu tươi, mẫu làm giàu và không tốn thời gian. Bằng cách sử dụng cặp
mồi đặc hiệu loài, chúng ta có thể phát hiện được Candida. Sản phẩm PCR
nếu tiếp tục được cắt bởi enzyme Msp I thì chúng ta có thể phân biệt được
một số loài trong chi Candida [aa].

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

9

Khóa luận tốt nghiệp


PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm thực hiện
Phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh
Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Đối tương nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng
Bệnh nhân viêm âm đạo do nấm Candida đến khám và diều trị tại
Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (Phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, bệnh viện
Sản nhi Quảng Ninh). Đồng thời, có chỉ định xét nghiệm trực tiếp tìm nấm
dương tính, nuôi cấy, phân lập nấm.
Thời gian: tháng 10/2016- tháng 2/2017
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
Bệnh nhân biểu hiện viêm âm đạo và xét nghiệm trực tiếp tìm nấm
dương tính.
Bệnh nhân nữ, tuổi từ 15 đến 49.
Không dùng thuốc kháng nấm trước đó 05 ngày.
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ
Bệnh nhân biểu hiện viêm niêm mạc âm đạo nhưng xét nghệm nấm âm tính.
Bệnh nhân đang trong thời kì kinh nguyệt hoặc ra máu.
Bệnh nhân không hợp tác.
2.3. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu
Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân biểu hiện viêm âm đạo và xét nghiệm trực
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

10

Khóa luận tốt nghiệp


tiếp tìm nấm dương tính tại khoa Vi sinh- Sinh học phân tử- Bệnh viện Sản
nhi Quảng Ninh. Mẫu được thu trong khoảng thời gian từ tháng 10/2016 đến
tháng 2/2017.
2.3.2. Trình tự mồi
STT

Tên mồi

Trình tự mồi

1.

ITS1

5’ tcc gta ggt gaa cct gcg g 3’

2.

ITS4

5’ tcc tcc gct tat tga tat gc 3’

2.3.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
2.3.3.1. Hóa chất
- Hóa chất được dung trong vi sinh chuẩn đoán trực tiếp: Dung dịch
Tím kết tinh (Crystal violet); Dung dịch Iod (dung dịch Lugol); Dung dịch
tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton;
Dung dịch nhuộm bổ sung: Safranin hay Fuchsin Ziehl; Nước muối sinh lý;
Dung dịch KOH 10- 20%; Dung dịch xanh Lacto- phenol.
- Hóa chất được dùng trong nuôi cấy nấm Candida:
- Hóa chất được dùng trong tách chiết DNA và phát hiện nấm Candida
bằng kỹ thuật PCR: Các loại hóa chất: Tris.HCl, NaCl, EDTA, agarose; Các
loại dung dịch gốc: 100 mg/ml lysozyme, RNase, 100 bp DNA marker, 1 kb
DNA marker,Taq PCR polymerase 5U/µl, 2.5 mM dNTP hỗn hợp, phenol,
chloroform, isoamylalcohol; Các loại dung dịch sử dụng: 1 M Tris.HCl pH8;
1 M sodium EDTA pH8; 1M sodium phosphate buffer pH8; 3M NaCl; Lysis
buffer; TE; 1% RNase; 20 mg/ml proteinase K; Chloroform:isoamylalcohol
24:1; Phenol:Chloroform:isoamylalcohol 25: 24:1; 10% SDS; Gel agarose
0,8% và 1,7%, Ethanol 70% và ethanol 96%.

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

11

Khóa luận tốt nghiệp


2.3.3.2. Các dụng cụ nghiên cứu
Lam kính, lamen sạch, Pipet nhỏ giọt. Que cấy đầu tròn, đèn cồn,
diêm. Bút chì kính, phiến kính. Kính hiển vi. Đồng hồ bấm giờ. Chậu rửa,
bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết khác.
Eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml và 2 ml), đầu côn các loại (10 µl,
100 µl, 200 µl, 1000 µl), khay để eppendorf.
2.3.3.3. Các thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài: Máy lắc 37°C – Gyromax
737R (Amerex), Máy ly tâm ống Eppendorf (Thermoscientific), Máy điện di
DNA (Bio-Rad), Máy soi tia UV (Vilber Laurmat), Máy ổn nhiệt (Implen
GmbH), Bộ Pipetman gồm các loại 10, 200, 1000 µl (Gilson).
2.3.4. Các loại môi trường sử dụng
Môi trường Sabouraud có đường: Pepton: 10 g, Glucose hoặc maltose:
40 g, thạch sợi: 20 g, nước 1000 mL.
Môi trường Sabouraud để bảo quản: Pepton: 30 g, thạch sợi: 20 g,
nước cất: 1000 mL.
Môi trường Sabouraud có kháng sinh: Pepton: 10 g, Glucose: 20 g,
Chloramphenicol: 50 mg, thạch sợi: 20 g, nước cất: 1000 mL.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp soi vi sinh chẩn đoán trực tiếp
2.4.1.1. Phương pháp soi tươi trực tiếp
Nguyên lý:
Nhận định sơ bộ vi nấm dựa vào hình thể, kích thước, cấu tạo
Các bước tiến hành:
Bước 1: Nhận bệnh phẩm. So sánh thông tin trên bệnh phẩm và phiếu
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

12

Khóa luận tốt nghiệp


chỉ định xét nghiệm (barcode, tên, tuổi, địa chỉ, khoa, phòng…)
Bước 2: Nhỏ Nacl 0,9 % lên lam kính, hòa bệnh phẩm vào giọt dung
dịch đến khi đục.
Bước 3: Dùng lá kính sạch đậy trên giọt dung dịch.
Bước 4: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10X-40X.
Nhận định kết quả:
Dương tính:
- Tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục kích thước 3- 5µm nảy chồi
hoặc không.
- Tế bào nấm men có quầng sáng bao quanh khi làm tiêu bản mực tàu.
- Sợi nấm giả (Sợi nhánh được tạo thành từ các chỗ thắt).
- Nấm sợi có vách ngăn (sợi nhánh được tách ra cách vách ngăn).
Âm tính:
- Không quan sát thấy nấm.
2.4.1.2 Kỹ thuật nhuộm soi tiêu bản Gram
Nguyên lý:
Đánh giá hình thể, kích thước, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi
khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) bằng kỹ thuật nhuộm và soi dưới kính
hiển vi quang học.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Nhận bệnh phẩm. So sánh thông tin trên bệnh phẩm và phiếu
chỉ định xét nghiệm (barcode, tên, tuổi, địa chỉ, khoa, phòng…)
Bước 2: Phết bệnh phẩm lên lam kính, cố định bằng ngọn lửa đèn cồn.
Bước 3: Nhỏ dung dịch tím gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, duy trì 1

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

13

Khóa luận tốt nghiệp


- 2 phút, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
Bước 4: Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây. Đổ dung dịch lugol, rửa
nước.
Bước 5: Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 95% lên tiêu bản, nghiêng đi
nghiêng lại để cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia. Khi thấy màu tím trên
lam kính vừa phai hết thì rửa nước ngay.
Bước 6: Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin, để 1 - 2 phút. Rửa nước kỹ, để khô
tiêu bản.
Bước 7: Soi và quan sát kính hiển vi vật kính 100X.
Nhận định kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím sẫm của gentian.
Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ của fuchsin.

Hình 2.1: Quy trình nhuộm Gram

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

14

Khóa luận tốt nghiệp


2.4.2. Phương pháp nuôi cấy
Nguyên lý:
Vi nấm được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất
chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và có thể kết hợp với tính chất
kháng nguyên.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Nuôi cấy nấm trên môi trường Sabouraud ủ ấm ở nhiệt độ
30°C. Hút 3 - 5 giọt dịch cấy dàn trên đĩa Sabouraud.
Bước 2: Soi tươi tìm nấm, đánh giá sơ bộ hình thái khuẩn lạc, dạng
khuẩn lạc.
Bước 3: Đọc kết quả hàng ngày.
Nhận định kết quả:
- Quan sát hình thể cấu tạo, tính chất, màu sắc khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc nấm men:
Khuẩn lạc Candida có dạng trơn, nhẵn màu kem thường mọc nhanh
sau 24 giờ.
Khuẩn lạc Cryptococcus trơn nhẵn màu be (khô hơn so với nấm
Candida) mọc chậm thường sau 48 giờ.
+ Khuẩn lạc nấm mốc:
Aspergillus màu sắc khuẩn lạc khác nhau.
P. marneffei: sinh sắc tố màu đỏ nâu đến đỏ rượu vang khuếch tán vào
môi trường khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.
- Quan sát kính hiển vi sau cấy: Tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu
dục (đối với nấm Candida), nẩy chồi hoặc không; Cryptococcus thường hình
tròn, kích thước lớn.
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

15

Khóa luận tốt nghiệp


- Kết quả:
+ Đọc kết quả loài nấm theo kết quả định danh.
+ Không thấy khuẩn lạc mọc sau 4 ngày trả kết quả sơ bộ: Âm tính.
- Các đĩa cấy được bỏ sau 7 ngày nuôi cấy.
2.4.3. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen của nấm
2.4.3.1 Tách chiết DNA hệ gen của nấm
Nguyên lý:
Vỏ tế bào cần được phá hủy để bộc lộ DNA hệ gen. Các phần DNA hệ
gen, protein, xác tế bào và các chất khác được kết tủa và phân ly vào các pha
dung dịch nhờ ly tâm. Dung dịch chứa DNA hệ gen được thu lại và DNA hệ
gen của nấm được thu lại bằng cách tủa với ethanol.
Các bước tiến hành:
Dùng que cấy gạt lớp tế bào nấm cho vào eppendorf 2 ml chứa 0,5 ml
lysis buffer, nhúng que cấy vài lần trong dung dịch để tế bào nấm men rơi
vào trong dung dịch.
Bổ sung 25 µl 100 mg/ml lysozyme và 10 µl 1% RNase vào mỗi mẫu,
ủ hỗn hợp dung dịch tế bào ở 37oC trong thời gian 60 phút.
Thêm 10 µl 20 mg/ml proteinase K và 55 µl 10% SDS (nồng độ cuối đạt
1%) vào mỗi mẫu, ủ hỗn hợp dung dịch tế bào ở 37oC trong thời gian 30 phút.
Thêm 500 µl TE vào mỗi mẫu, ủ hỗn hợp dung dịch tế bào ở 65oC
trong thời gian 120 phút.
Li tâm hỗn hợp dung dịch tế bào 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu 1000
µl pha trên, bổ sung 1000 µl Phenol:Chloroform:isoamylalcohol (25:24:1),
lắc đều hỗn hợp.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu 900 µl pha trên, bổ sung 900 µl

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

16

Khóa luận tốt nghiệp


Chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc đều hỗn hợp.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu 800 µl pha trên, bổ sung 1400 µl
96% ethanol, lắc đều hỗn hợp, để yên ở nhiệt độ phòng 20 phút.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu cặn, bổ sung 1000 µl 70%
ethanol, lắc đều.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu cặn, để khô ở nhiệt độ phòng
trong thời gian 10 phút.
Hòa tủa vào 100 µl TE.
Điện di kiểm tra 2 µl sản phẩm tách chiết trên gel agarose 0,8%.
2.4.3.2 Làm sạch DNA hệ gen của nấm sau tách chiết
Nguyên lý:
Trong quá trình chiết DNA một số chất tạp nhiễm chưa được loại bỏ
hoàn toàn có thể ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp the như phản ứng khuếch
đại gen PCR. Vì thế lặp lại bước chiết bằng Phenol: hloroform:
soamylalcohol để loại bỏ thêm các chất tạp nhiễm. DNA hệ gen trong mẫu sẽ
được thu lại bằng cách tủa với ethanol và ly tâm thu tủa.
Các bước tiến hành:
Thực hiện lại từ bước chiết bằng Phenol:Chloroform:isoamylalcohol
(25: 24:1) trong quy trình tách DNA hệ gen để loại bỏ hoàn toàn những chất
bẩn còn dính vào DNA hệ gen.
Bổ sung 1000 µl Phenol:Chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), lắc đều
hỗn hợp.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu 900 µl pha trên, bổ sung 900 µl
Chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc đều hỗn hợp.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu 800 µl pha trên, bổ sung 1400 µl
96% ethanol, lắc đều hỗn hợp, để yên ở nhiệt độ phòng 20 phút.
Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

17

Khóa luận tốt nghiệp


Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu cặn, bổ sung 1000 µl 70%
ethanol, lắc đều.
Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Thu cặn, để khô ở nhiệt độ phòng
trong thời gian 10 phút.
Hòa tủa vào 100 µl TE.
Điện di kiểm tra 2 µl sản phẩm tách chiết trên gel agarose 0,8%.
2.4.4. Phương pháp khếch đại gen bằng cặp mồi đặc hiệu
Nguyên lý:
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro
do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và
nguyên liệu dNTPs. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình
nhiệt lặp lại (25-40 lần) gồm đun nóng khoảng 95oC (tháo xoắn chuỗi DNA),
làm nguội xuống 37-65oC (bắt cặp mồi với mạch đơn tương ứng) và ủ ở
khoảng 72oC (tổng hợp chuỗi). Nhờ vậy, 1 đoạn mạch kép DNA, sau n chu
kỳ phản ứng, sẽ thành 2n mạch DNA kép.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR: tổng thể phản ứng là 100 µl gồm các
thành phần như sau (Bảng 2.1):
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT

Thành phần phản ứng

Nồng độ cuối

1. DNA khuôn

Không xác định

2. 20 µM ITS1 primer

0.2 µM

3. 20 µM ITS4 primer

0.2 µM

Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01

18

Khóa luận tốt nghiệp


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×