Tải bản đầy đủ

Tách dòng gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển quảng trị

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI
TÁCH DÒNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN TỪ VI SINH
VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG TRỊ

Giáo viên hướng dẫn 1: PGS.TS Phạm Việt Cường
Giáo viên hướng dẫn 2: NCS. Trần Thị Hồng
Sinh viên thực hiện

: Đỗ Thị Thương

Lớp

: 13-01

Hà Nội- 2017



VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ
NGH SINH HỌC

KHÓA LUẬN
LU
TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI
TÁCH DÒNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN
NT
TỪ VI SINH
VẬT
T LIÊN K
KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG
NG TR
TRỊ

Giáo viên hướng dẫn
n 1: PGS.TS Ph
Phạm Việt Cường
Giáo viên hướng dẫn
n 2: NCS. Tr
Trần Thị Hồng
Sinh viên thực hiện
n

: Đỗ Thị Thương

Lớp

: 13-01

Hà Nội- 2017


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trường Viện Đại Học


Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã dạy
dỗ em trong suốt 4 năm học tại trường, và trang bị cho em nền tảng kiến thức
khoa học và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm báo cáo tốt nghiệp này.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS. Phạm
Việt Cường- Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung- Viện Hàn
Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam và NCS. Trần Thị Hồng, người đã
trực tiếp hướng dẫn em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận
tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua.

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, các anh chị, cán
bộ Trung tâm công nghệ sinh học Phân tử Nghĩa Đô- Viện Nghiên cứu Khoa
học miền Trung đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian em thực tập.

Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những
người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học
tập để em hoàn thành bài luận văn này!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Đỗ Thị Thương


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1. Khái quát về hải miên

4

1.2. Khái quát về vi sinh vật liên kết hải miên

5

1.3. Protease và chất ức chế protease.

7

1.3.1. Protease

7

1.3.1.1. Giới thiệu chung

7

1.3.1.2. Phân loại protease

9

1.3.2

Chất ức chế protease (protease inhibitor- PI)

11

1.3.2.1 Khái niệm và phân loại

11

1.3.2.2 Cấu trúc và tính chất của chất ức chế protease

13

1.3.2.3 Cơ chế tác động của chất ức chế protease

14

1.4

Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước 15

1.4.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

16

1.4.2

Tình hình nghiên cứu trong nước

18

1.5. Vector tách dòng pCR® 2.1 invitrogen

19

PHẦN II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1.Đối tượng nghiên cứu

22

2.2. Vật liệu, hóa chất và môi trường nghiên cứu

22

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu

22

2.2.2. Hóa chất

22

2.2.3. Môi trường nghiên cứu

23

2.2.4. Trang thiết bị và máy móc

25

2.3. Phương pháp nghiên cứu

26

2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ vi sinh vật liên kết hải
miên biển Quảng Trị
26


2.3.2. Phương pháp điện di trên gel agarose

28

2.3.3. Thiết kế mồi

29

2.3.4. Phương pháp PCR

29

2.3.5. Phương pháp thôi gel

30

2.3.6. Phương pháp biến nạp sản phẩm PCR vào tế bào khả biến E. Coli
Top 10F’
32
2.3.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E. Coli

34

2.3.8. Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn

35

2.3.9. Xác định trình tự gen bằng máy tự động.

36

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

38

3.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị
38
3.2. Khuyếch đại gen ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên biển
Quảng Trị bằng phản ứng PCR.
39
3.3. Tách dòng gen ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên biển
Quảng Trị bằng phản ứng PCR.
40
3.3.1. Kết quả thôi gel

40

3.3.2.Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR®2.1

41

3.3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng Top
10F’
41
3.3.4. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli.

43

3.3.5. Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI.

44

3.3.6. Trình tự nucleotid gen ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải
miên biển Quảng Trị.
45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

48


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

mg

Miligram

ml

Mililitre

g

Gram

µl

Microlitre

bp

Base pair

kb

Kilobase

DNA

Deoxyribonucleotit Acid

aa

Acid amin

Agar

Agarose

E

Enzyme

I

Inhibitor

E.coli

Escherichia coli

ETDA

Ethylene Diamine Tetra- acetic Acid

IPTG

Isopropylthio- β- D- galactoside

LB

Luria và Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

PI

Protease Inhibitor (chất ức chế protease)

SDS

Sodium Dodecyl sulfate

TAE

Tris- acetat- ETDA

Taq

Thermus aquaticus

rpm

Vòng/ phút

TTHĐ

Trung tâm hoạt động

UV

Ultraviolet

X- gal

5- brom-4- chloro-3- indolyl- β-D- galactosidase


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh Hải miên.......................................................................... 4
Hình 1.2: Cấu tạo của protease ....................................................................... 8
Hình 1.3: Cấu trúc không gian của protease ................................................... 8
Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pCR®2.1…………21
Hình 3.1: Điện di đồ DNA tổng số của VSV-HM ........................................ 39
Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi 667................................... 39
Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm thôi gel của HM9-QT trên gel agarose 1%... 41
Hình 3.4: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli Top
10F’.............................................................................................................. 42
Hình 3.5: Kết quả tách DNA plasmid ........................................................... 43
Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm cắt bởi enzym giới hạn ................................ 44
Hình 3.7: Kết quả blast gen HM9-QT trên ngân hàng quốc tế NCBI……….45


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease ......................................................... 12
Bảng 2.1: Tên hóa chất và hãng sản xuất trong thí nghiệm ........................... 22
Bảng 2.2: Tên thiết bị máy móc và hãng sản xuất trong thí nghiệm .............. 25
Bảng 2.3: Thành phần phản ứngPCR............................................................ 30
Bảng 3.1: Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ AND (µg/ml) của các
mẫu nghiên cứu...............................................................................................38


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Môi trường biển rất đa dạng, người ta tính được rằng vi khuẩn biển cực

kỳ nhiều, đạt mật độ đến 106/ml nước biển, và là sinh khối biển và các chất
trao đổi nhiều nhất. Môi trường biển, gồm cả lớp dưới bề mặt, người ta tin là
chứa khoảng 3,67x1030 vi sinh vật và với gần 71% bề mặt trái đất của 361
triệu km2 được bao phủ bởi đại dương, môi trường này là khu vực rộng lớn
tiềm năng của đa dạng vi sinh vật và công nghệ sinh học có thể khai thác hay
“công nghệ sinh học xanh” .
Trong môi trường biển, vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ,
độ mặn, dinh dưỡng cực đoan. Những enzymes tách chiết từ những vi sinh vật
trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh
hóa đa dạng cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong
các điều kiện đó. Như vậy có thể khai thác các enzymes do vi sinh vật biển
tổng hợp có các hoạt tính xúc tác sinh học khác thường, có khả năng hoạt
động dưới các điều kiện cực đoan.
Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô
của chúng. Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều
kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và
tiến hóa. Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào. Những
nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật
vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển
vi.Những nghiên cứu về vi sinh vật liên đới hải miên cho thấy vi sinh vật có
thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so với
lượng vi khuẩn trong nước biển, và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên. Rất
nhiều sản phẩm của hải miên được cho là thực tế do vi khuẩn liên đới sinh ra
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 1


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

và rất nhiều báo cáo đã chứng minh giả thuyết này. Việc phân lập, nuôi cấy vi
sinh vật trong điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt là vi sinh vật liên
kết với các cơ thể khác bởi mối tương tác giữa chúng khá phức tạp. Hơn nữa,
nếu khai thác hải miên để tách chiết các hoạt chất thì nguồn nguyên liệu có
hạn này sẽ bị mất đi nhanh chóng, khó phục hồi và gây hủy hoại môi trường.
Vì vậy cần phải có phương pháp mới nhằm phát hiện và có thể thu được các
hợp chất hoạt tính sinh học lượng lớn. Phần lớn các báo cáo về phát hiện và
tách chiết các chất có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế khối u cũng như ức chế
protease là từ những chủng vi sinh vật nuôi cấy được.
Hiện nay, Serine protease inhibitors là một trong những thành viên
quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ nhiều nhất trong họ protease inhibitors.Chúng
hoạt động như một tác nhân điều hòa (modulator) và tham gia vào rất nhiều
quá trình phân giải các protein quan trọng, liên kết hóa trị với protein đích và
bất hoạt chúng. Vì vậy việc tìm kiếm các chất ức chế protease mới gợi sự
quan tâm mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực.Vi sinh vật biển là một trong những
nguồn giàu nhất các hợp chất có hoạt tính sinh học và hiện nay ở Việt Nam
chưa có nhiều nghiên cứu. Sự đa dạng của vi sinh vật liên kết hải miên biển
và các đặc trưng của môi trường biển đã góp phần tạo ra các nguồn gen mới
trong đó có cả các gen ức chế serine protease. Các hợp chất ức chế serine
protease mã hóa bởi các gen này có thể có những đặc tính duy nhất và có tiềm
năng ứng dụng trong chữa trị bệnh.
Xuất phát từ đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Tách dòng gen ức chế
protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị
2.

Mục tiêu của đề tài
Tách dòng thành công gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên

kết hải miên vùng biển Quảng Trị.

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 2


Khóa luận tốt nghiệp
3.

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Ý nghĩa của đề tài
Góp phần tìm kiếm nguồn gen ức chế protease gây bệnh phục vụ cho y

học.
4.

Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA của vsv liên kết với hải miên
- Nhân dòng gen mã hóa các protein có hoạt tính ức chế protease từ
DNA tách chiết.
- Gắn gen vào vector tách dòng thích hợp theo Kit.
- Giải trình tự gen đã tách dòng thành công.

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 3


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Khái quát về hải miên
Hải miên (sponge) là những động vật sống rất lâu và rất ổn định. Chúng

đã tồn tại 700-800 triệu năm với vận tốc sinh trưởng khác nhau ở các nhóm
khác nhau. Chúng là động vật không xương sống đa bào, ăn lọc sống bám chủ
yếu vào nền biển, nhưng cũng có loài nước ngọt. Trong số khoảng 15.000 loài
hải miên, chỉ có 1% sống trong môi trường nước ngọt. Hải miên không có mô
thực sự, nhưng có các loại tế bào khác nhau với các chức năng khác nhau và
cùng nhau thực hiện các chức năng bình thường của cơ thể.

Hình1.1: Hình ảnh Hải miên
Hải miên là “mỏ vàng” về khía cạnh đa dạng các chất trao đổi thứ cấp
được phát hiện trong những năm gần đây. Hải miên sản xuất các chất trao đổi
thứ cấp để xua đuổi và ngăn cản các loài ăn thịt, cạnh tranh không gian với
các loài không cuống khác và để liên lạc, chống lại sự nhiễm bệnh. Hải miên
có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều loại bệnh. Trong
số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển được mô tả, hơn 30% từ hải
miên[22][23]. Nhưng nồng độ các chất hoạt tính sinh học trong mô hải miên
rất thấp. Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 4


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

vật có thể chiếm 50% thể tích của hải miên, và con số này cao hơn 2-3 lần vi
sinh vật có trong nước biển.Ở Việt Nam, hải miên đã biết 160 loài, gặp nhiều
ở vùng biển phía Nam, nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo[34].
Hải miên là động vật thân lỗ hay còn gọi là bọt biển là một ngành động
vật đa bào nguyên thủy. Thường sống dưới biển có cấu trúc tế bào tách biệt.
Cơ thể động vật thân lỗ có hình cốc gồm các tế bào động vật đa bào sớm nhất,
phát triển từ các tập đơntế bào. Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên
thủy nhất, có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan
bên trong, hay khả năng vận động. Chúng đã từng được xem là đã tách ra từ
các động vật khác trước đây. Các tế bào của chúng khác biệt nhưng trong hầu
hết các trường hợp không được tổ chức thành các mô riêng biệt.
Hai thành phần hóa học chủ yếu của loài hải miên là các axit béo không
no và các hợp chất steroid. Trongđó đáng quan tâm nhất là hợp chất béo
không no bị brom hóa. Các hợp chất này thể hiện nhiều đặc tính như: kháng
vi sinh vật, gây độc tế bào, một số còn ức chế enzym HIV protease[35].
1.2.

Khái quát về vi sinh vật liên kết hải miên
Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không

phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh
vật cộng sinh hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả
thấy rằng vi khuẩn liên đới hải miên bền vững theo không gian và thời gian.
Nhưng một số tác giả khác lại thay đổi giả thuyết này, ví dụ: mặc dù
Cymbastela concentrica có cộng đồng vi sinh vật ít thay đổi giữa các khoảng
cách địa lý nhỏ nhưng cộng đồng sinh vật của Cymbastela concentrica vùng
ôn đới khác với cộng đồng vi sinh vật Cymbastela concentrica từ nước vùng
nhiệt đới của Australia[24].
Hải miên được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò
của những vi sinh vật này thay dổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 5


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

sinh với hải miên. Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các
phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S
rRNA gene sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người
ta nhận thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên có hơn 25phyla, trong
đó



Proteobacteria,

Nitrospira,

Cyanobacteria,

Bacteriodetes,

Actinobacteria, Chloflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và
Verrucomicrobia. Các quần thể khác sống trong hải miên gồm fungi và
microalgae. Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống trong
virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia)
cavernicola[6][7]. Có 2 con đường để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một
là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên
trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên đới thông qua giao
tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa vi khuẩn vào noãn bào (oocytes)
hoặc ấu trùng (larvae) [25][26].
Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh
dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và
sản sinh các chất trao đổi thứ cấp. Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên
đới với hải miên là các nhà sản xuất gốc, các hợp chất họa tính sinh học. Bằng
chứng thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là Flaulkner và cs, xác định
vị trí của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải miên Theonella
swinhoei. Với mục đích này, quần thể tế bào được tách bằng ly tâm và nghiên
cứu bằng hóa học. Bằng cách đó có thể định vị được cytotoxic macrolide
swinholide A và peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và
vi khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng [27][28].
Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa
được hiểu rõ. Người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do
vi khuẩn liên kết với nó sinh ra. Ví dụ diketopiperazines của Tedania
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 6


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

ignisđược cho là sản phẩm trao đổi chất của Micrococcus sp liên kết với hải
miên. Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea
herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae
nội cộng sinh tạo ra. Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P.clavata
được nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin.
Vi sinh vật liên kết với hải miên biển có vai trò chủ yếu trong việc bảo
vệ vật chủ chống lại các loài ăn thịt do chúng sản sinh ra các chất trao đổi thứ
cấp có hoạt tính sinh học. Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn quang hợp cố định
cacbon cung cấp đến gần 50% nhu cầu cacbon cho hải miên. Ngoài ra, có
quan hệ cộng sinh với vi khuẩn quang hợp giúp hải miên nhận được một số
sản phẩm từ quá trình quang hợp như glycerol. Ngược lại, vi khuẩn sẽ được
cung cấp giá thể và cơ chất từ hải miên mà nó có quan hệ 16 cộng sinh[33].
Một số vi sinh vật được cho là sinh các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo
vệ vật chủ. Các chức năng khác như loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình
trao đổi chất có hại. Đổi lại hải miên làm cho vi sinh vật có thể nhận được ánh
sáng mặt trời, chỗ ẩn náu khỏi các loài săn mồi, cơ chất để bám và cung cấp
dinh dưỡng.
Người ta đã chứng minh được rằng vi sinh vật liên kết với hải miên sản
sinh các chất có hoạt tính sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm,
kháng khối u, ức chế miễn dịch…và cũng có hoạt tính chữa bệnh tim, hô hấp
và tiêu hóa[29].
1.3.
1.3.1.

Protease và chất ức chế protease.
Protease

1.3.1.1. Giới thiệu chung
Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme là các enzyme có khả
năng thủy phân các liên kết peptide của protein thành các đoạn peptide ngắn
hơn và các acid amin[36].
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 7


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Protease là nhóm phổ biến và đa dạng trong các enzyme và có tất cả
sinh vật sống, nấm, vi khuẩn, virus, sinh vật nguyên sinh, thực vật và động
vật. protease là nhóm lớn nhất với hơn 560 chủng đã được biết đến[9].

Hình 1.2: Cấu tạo của
protease

Hình 1.3: Cấu trúc không
gian của protease

Cơ chế thủy phân như sau: thường các protease trong cơ thể tồn tại ở
dạng không hoạt động (zymogen) và có thể trở thành hoạt động do chính
protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide
trong phân tử của nó, khi đó sự thay đổi cấu trúc phân tử thao hướng có lợi
cho hoạt động xúc tác, enzyme chuyển sang trạng thái hoạt động[37].
Protease cần thiết cho các vi sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ
mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều
đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa..)
và động vật ( gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật,
protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi
sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau
về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng
tinh thể đồng nhất[37][38].
Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 8


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.3.1.2. Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)[36]

Peptidase (protease)

Exopeptidase

Endopeptidase
Serine proteinase

Aminopeptidase

Cystein proteinase

Carboxypeptidase

Aspartic proteinase
Metallo proteinase

Sơ đồ phân loại protease
Protease được chia làm hai loại endopeptidase và exopeptidase.
• Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác hoạt động thủy phân liên kết peptide ở
đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino
acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C
của chuỗi polypeptide và giải phóng ra môt amino acid hoặc một
dipeptide.

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 9


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

• Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4
nhóm[14]:
+ Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc
serine trong TTHĐ và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với các
hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm
nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm
các enzyme động vật như: chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm
sublitisin bao gồm hai loại enzym vi khuẩn như sublitisin
Carlsberg, sublitisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt
động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung
tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực
vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và
proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt
động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như pepsin,
chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa
nhóm carboxyl trong TTHĐ và thường hoạt động mạnh ở pH
trung tính.
+ Metallo proteinase: metallo proteinase là nhóm proteinase được
tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao
hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung
tính vào hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3
nhóm[30]:
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 10


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

- Protease acid: pH 2- 4
- Protease trung tính: pH 7- 8
- Protease kiềm: pH 9- 11
1.3.2 Chất ức chế protease (protease inhibitor- PI)
1.3.2.1

Khái niệm và phân loại

Khái niệm: Chất ức chế protease là những chất có tác dụng ức chế hoạt
động của protease ở những mức độ khác nhau.
Phân loại:
a. Dựa vào nguồn gốc của chất ức chế protease
- Chất ức chế tổng hợp như FOY- 305[11], các chất tương tự
pepstatin,...
- Chất ức chế protease có nguồn gốc động vật như aprotinin,
hirustatin,...
- Chất ức chế có nguồn gốc thực vật như amastatin, E-64,
bestatin[8]...
b. Dựa vào các nhóm protease bị ức chế[2][8]
- Serin protease inhibitor như leupeptin, antipain, chymostatin,
elastatina,...
- Cystein protease inhibitor như E- 64,...
- Aspartic protease inhibitor như pepstatin, hydropeptatin,...
- Metallo protease inhibitor như bestatin, amastatin, actinonin,
histagin,...
Trong đó các chất ức chế loại serine protease được chú ý nghiên cứu
nhiều nhất.

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 11


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease[3][4][5][9]
Tên chất ức chế

Nguồn gốc

Nhóm enzym bị ức chế

A. PI động vật
Aprotinin

Tụy, mang tai, phổi,gan Chymotrypsin,
của động vật

trypsin,...

Hirustanin

Nước bọt đỉa

Serine protease

Alpha 1- antitrypsin

Máu người

Trypsin

B. PI thực vật
Kunitz

trypsin Đậu tương

Serin protease

inhibitor
C. PI vi sinh vật
Bestatin

S. olivoleticuli

Aminopeptidae

Chymostatin

S. testaceus

Serin protease

E- 64

Aspergillus japonicus

Cystein protease

D. PI tổng hợp
Saquinavir

Nhân cấu trúc:

HIV protease

NHCH(R)CH(OH)CH2NR (Serin protease)
Benzoxazinones

Herpesvirusprotease
(Serin protease)

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 12


Khóa luận tốt nghiệp

1.3.2.2

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Cấu trúc và tính chất của chất ức chế protease

PI là chất ức chế đặc hiệu có nhiều bản chất khác nhau nhưng các PI có
bản chất protein được nghiên cứu ứng dụng nhiều hơn cả. Trong phân tử của
chất ức chế protease có một phần tương tác đặc hiệu, kết hợp trực tiếp với
trung tâm hoạt động của protease bị nó ức chế, gọi là trung tâm phản ứng.
Gốc acid amin có vai trò quan trọng nhất trong tương tác đặc hiệu với enzym
gọi là acid amin của trung tâm phản ứng, kí hiệu là acid amin PI, liên kết
peptid tương ứng –P I-P’I gọi là liên kết peptid của trung tâm phản ứng
thường nằm trên bề mặt của phân tử PI trong vùng có cầu disunfua. Bản chất
gốc P1 phản ánh tính đặc hiệu của PI. Acid amin P1 của chát ức chế trypsin
thường là lysin hoặc arginin của Chymotrypsin là methionin hoặc leucin.
Ngoài acid amin PI, các acid amin lân cận cũng có ảnh hưởng quan trọng đến
tính đặc hiệu của chất ức chế.
Phân tử PI có thể có 1, 2, 3 hay nhiều trung tâm phản ứng. Nếu chỉ có
một trung tâm phản ứng gọi là chất ức chế một đầu hay đầu đơn, nếu có hai
trung tâm phản ứng- chất ức chế hai đầu hay đầu kép, và nếu có nhiều trung
tâm phản ứng- chất ức chế nhiều đầu. Các PI hai đầu hay nhiều đầu có thể kết
hợp đồng thời hai hay nhiều phân tử protease, các enzym này có thể có tính
đặc hiệu giống nhau hoặc khác nhau[1]. Mỗi một chất ức chế protease thường
có tác dụng ức chế đặc hiệu một hoặc một số protease.
Cho đến nay, chúng ta đã tìm ra hơn 100 chất ức chế protease trong tự
nhiên được tách ra từ nhiều tổ chức khác nhau của vi khuẩn, thực vật, động
vật. Những PI này ức chế thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, ngăn cản cơ
chất tiếp cận với vị trí xúc tác tại trung tâm hoạt động của enzym suốt quá
trình diễn ra sự cản trở. Kích cỡ của chúng cũng đa dạng từ 50 đoạn acid amin
(như chất ức chế trypsin ở thận bò) tới 400 đoạn acid amin(như chất ức chế
alpha-proteinase). Những chất ức chế serin được nghiên cứu và biết đến nhiều
Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 13


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

nhất. Gần đây, một bước tiến lớn đã hình thành nghiên cứu ức chế tự nhiên
của cystatine. Trong khi đó, những hiểu biết về chất ức chế cả aspatyl và
metallo đều rất hạn chế. Vì vậy nghiên cứu chất ức chế protease vẫn còn
nhiều vấn đề cần được quan tâm tìm hiểu đặc biệt đối với chất ức chế aspatyl
protease và metalloprotease[16].
1.3.2.3

Cơ chế tác động của chất ức chế protease

Một số chất ức chế protease thường có tác dụng ức chế đặc hiệu một
hoặc một số protease. Tất cả các chất ức chế protease đều hoạt động theo cơ
chế gần giống nhau. Chúng ngăn cản hoạt động của enzyme protease trong
phạm vi tế bào người hay những vi sinh vật. Protease vi sinh vật cần thiết cho
quá trình trưởng thành và sinh sản. Khi các PI gắn vào enzym này, những vi
sinh vật mới vẫn có thể rời tế bào nhưng chúng không thể lây nhiễm sang tế
bào khác được. Vì vậy sẽ ngăn cản được sự lây lan vi sinh vật trong cơ
thể[10]. Chất ức chế protease tác dụng theo hai cách sau[2][21].
- Ức chế hoạt động của các protease bởi phản ứng tương tác proteinprotein.
- Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào trung tâm
hoạt động của các protease.
Quá trình ức chế protease của các chất ức chế cũng chính là sự tương
tác giữa enzym và chất ức chế theo một cơ chế phổ biến- cơ chế chuẩn giống
cơ chất. Chất ức chế (I) kết hợp với enzym (E) theo cách tương tự như cơ chất
kết hợp với enzym, nghĩa là có sự tương ứng về câu trúc không gian của trung
tâm phản ứng chất ức chế và trung tâm hoạt động enzym theo kiểu “ổ khóa”
và “chìa khóa”. Có thể biểu diễn tương tác theo sơ đồ sau:
E+ I ↔E- I ↔E+ I

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 14


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Phức hợp E-I được hình thành rất nhanh và thường phân ly rất chậm
thành enzym tự do cũng chất ức chế dạng ban đầu hoặc dạng hiệu chỉnh I.
Trong dạng hiệu chỉnh, liên kết – PI- P’I- bị thủy phân, phức E- I khá bền ở
pH trung tính nhưng dễ bị phân ly ở pH acid. ở pH thích hợp cho hoạt động
của protease trong phức E- I, nó lại có thể xúc tác cho sự tái tổng hợp liên kết
–PI- P’I-. Dùng phương pháp đặc hiệu có thể xác đinh bản chất acid amin đầu
N vào đầu C, từ đó biết được bản chất acid amin PI. Việc nghiên cứu về chất
ức chế protease rất cần thiết cho việc tìm ra những thuốc mới ứng dụng trong
điều trị. Tác động của PI từng bệnh sẽ theo những cơ chế khác nhau. Việc
nghiên cứu và xác định rõ vai trò của PI trong việc phát triển của bệnh là rất
cần thiết. Nhìn chung, PI ứng dụng trong điều trị hoạt động của protease theo
ba cơ chế chính là:
- Ức chế sự thủy phân protein thành acid amin, ngăn cản sự tổng hợp
nên protein mới, cơ chế này được thấy rõ nhất trong điều trị virus và bảo quản
thực phẩm.
- Ức chế hoạt động của protease mà có vai trò trong phát triển bệnh hay
nguyên nhân gây di căn tế bào ung thư và bảo quản thực phẩm.
- Chất ức chế protease có vai trò quan trọng trong cơ thể (các PI sinh
lý) như trong quá trình đông máu, cầm máu..., từ đó dưa ra thuốc aprotinin
điều trị xuất huyết.
PI có mặt trong hầu hết các tổ chức tự nhiên và ở bất kì tổ chức nào
cũng đóng vai trò quan trọng nhất định. Tìm hiểu rõ vai trò đó của PI sẽ rất
quan trọng trong ứng dụng của chúng sau này[36][37].
1.4 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 15


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.4.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Gần 40 năm, chất ức chế protease được xem như chất không tốt về dinh
dưỡng. Mãi đến năm 1980, Dr Walter Troll thuộc trường Đại học Y khoa
(NewYork University Midical Center) đã khám phá rằng đậu nành nguyên sơ
có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển ở các loài động vật
do tác dụng của chất ức chế protease. Tiếp theo đó, nhiều nhà khoa học đã
khảo sát và thử nghiệm về chất ức chế protease từ đậu nành trong phòng thí
nghiệm và thấy rằng nó có tác dụng chống lại sự phát triển của mầm ung thư
kết tràng (colon), ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và ung thư miệng[40].
Năm 1987, Viện Ung Thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute)
đã nhận thấy vai trò quan trọng của chất ức chế protease như một loại thuốc
chữa bệnh ung thư. Chúng ngăn cản sự tác động của một số genes di truyền
gây nên chứng ung thư. Ngoài ra chúng còn có tác dụng bảo vệ các tế bào cơ
thể không cho hư hại, gây nên bởi môi trường xung quanh như tia nắng phóng
xạ, các gốc tự do, chất có thể tấn công DNA[32].
7/11/2002, tại NewYork, theo một nghiên cứu gần đây thì chất ức chế
protease tiết ra từ bạch cầu (Secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI)
được tìm thấy trong nước đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa
lây truyền HIV/AIDS qua sữa mẹ[14]. Các báo cáo trước đây cho thấy SLPI
có khả năng bảo vệ tế bào không bị nhiễm HIV trong phòng thí nghiệm. Tuy
nhiên, nồng độ SLPI trong nước bọt ở trẻ sơ sinh có ảnh hưởng đến nguy cơ
lây truyền HIV-1 từ mẹ sang con hay không thì chưa được nghiên cứu. Tiến sĩ
Carey Farquhar, thuộc trường Đại học Washington ở Seattle và cộng sự đang
tiến hành nghiên cứu đo nồng độ của SLPI trong các mẫu nước bọt từ 188 trẻ
sơ sinh của các bà mẹ nhiễm HIV. Các mẫu nước bọt này lấy lúc mới sinh và
lúc 1, 3, 6 tháng tuổi [31].

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 16


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Năm 2006, Coralie E và cộng sự (Viện Hóa sinh học, Đại học
Washington, Mỹ) đã công bố đề tài nghiên cứu về Kunitz- một chất ức chế
cysteine protease tinh chế từ Cauli và Arabidopsis. Đề tài này đã nghiên cứu
về trình tự gen tổng hợp chất ức chế Kunitz và kiểm tra hoạt động của chúng
trong một số môi trường khác nhau[41].
Năm 2009, Simone Susser và cộng sự tại viện nghiên cứu Scheringplough, Đức đã công bố kết quả ngiên cứu chất ức chế protease đối với bệnh
nhân bị viêm gan C.
Năm 2015, các nhà khoa học của trường Đại học Haidelberg, Đức đã
công bố nghiên cứu về các chất ức chế serprin A3N có thể làm giảm đau thần
kinh bằng cách ức chế tế bào T có nguồn gốc từ bạch cầu elastste.
Đến nay, các chất ức chế protease đã được tìm thấy rộng rãi trong tự
nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn. Có thể nói không ở tổ chức sống
nào là không tồn tại các chất ức chế protease và nhiều chất ức chế protease đã
được tổng hợp nhân tạo. Một số công trình nghiên cứu ứng dụng của chất ức
chế protease vào các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như:
“ Sử dụng các chất ức chế protease trong xét nghiệm hiện kháng
nguyên” của Thurgau, Viện Công nghệ sinh học tại Đại học Constance,
Kreuzlingen, Thụy Sĩ.
“Hoạt động kháng virus của các chất ức chế protease chống lại
Toxoplasma gondii”. Bộ môn Ký sinh trùng, Viện Y học Nhiệt đới, Pedro
Kouri, Havana, Cuba.
“Phân lập chất ức chế Pepsin từ rễ cây Anchusa strigosa” của Sở Khoa
học sinh học, Khoa học, Đại học Jordan, Amman, Jordan.
“Nghiên cứu về một số chất ức chế protease aspartic quy định tổng hợp
protease nội sinh trong giai đoạn vận động nảy mầm hạt giống Vigna radiate”

Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH

Page 17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×