Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu thiết kế và biểu hiện nhóm gen doxAVC trên chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES LIVIDANS

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
********⁂⁂⁂********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN NHÓM GEN doxAVC
TRÊN CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS”

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Tạ Thị Thu Thủy

Sinh viên

: Nguyễn Văn Tòng

Lớp

: CNSH-1301


HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô giáo công tác tại
khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện
cho chúng em được học tập trong một môi trường khoa học và hoàn thiện
nhất.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô giáo TS. Tạ Thị Thu
Thủy. Người đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết đinh hướng nghiên cứu,
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện bài khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư công
nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, và
toàn thể các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động viên,
giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều cố
gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất mong
nhận được những góp ý của quý thầy – cô để bài khóa luận của em được đầy
đủ và hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn văn Tòng


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1 Tổng quan về kháng sinh ................................................................................ 3
1.1.1 Định nghĩa về kháng sinh ............................................................................ 3
1.1.2 Lịch sử kháng sinh ...................................................................................... 4
1.1.3 Phân loại kháng sinh ................................................................................... 5
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh .................................................................. 7
1.2 Xạ khuẩn ........................................................................................................ 10
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên .......................................................... 10
1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ......................................... 13
1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ............................................................. 14


1.2.4 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 ..................................................... 15
1.3 Giới thiệu về kháng sinh Doxorubicin .......................................................... 16
1.3.1 Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin ...................................................... 16
1.3.2 Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin ....................................................... 16
1.3.3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin ..................................................... 17
1.3.4 Lịch sử nghiên cứu về kháng sinh Doxorubicin......................................... 20
1.3.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh Doxorubicin ........ 22
1.4 Giới thiệu về gen doxA, dnrV, drrC .............................................................. 24
1.4.1 Gen doxA và dnrV .................................................................................... 24
1.4.2 Gen drrC ................................................................................................... 26
1.5 Vector tách dòng pGEM-T và vector biểu hiện pIBR25 ............................. 27
1.5.1 Vector tách dòng pGEM-T ........................................................................ 27
1.5.2 Vector biểu hiện pIBR25 .......................................................................... 28
1.6 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .................................................................. 29
1.6.1 Mục tiêu.................................................................................................... 29
1.6.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 29
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 31
2.1 Chủng vi sinh vật, hóa chất, môi trường và thiết bị ..................................... 31
2.1.1 Chủng vi sinh vật ...................................................................................... 31
2.1.2 Môi trường nuôi cấy ................................................................................. 31
2.1.3 Thiết bị ..................................................................................................... 33
2.1.4 Hóa chất.................................................................................................... 34
2.2 Các phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 37
2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn ................................... 37
2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi ......................................................................... 38


2.2.3 Phương pháp PCR..................................................................................... 39
2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose .............................................. 40
2.2.5 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose .............................................. 40
2.2.6 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn .................................. 41
2.2.7 Phương pháp chuyển gen vào E. coli bằng sốc nhiệt ................................. 42
2.2.8 Phương pháp nối DNA.............................................................................. 43
2.2.9 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn. .......................................... 43
2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans bằng tế bào
trần .................................................................................................................... 44
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 46
3.1 Tách dòng gen doxAV và drrC ...................................................................... 46
3.1.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius ........................... 46
3.1.2 Tách dòng gen doxAV bằng vector pGEM-T ............................................ 47
3.1.3 Tách dòng gene drrC bằng vector pGEM-T ........................................... 49
3.2 Thiết kế vector biểu hiện pIBR25-dAVC...................................................... 52
3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC ........................................................... 52
3.2.2 Tạo vector biểu hiện pIBR25.dAVC ......................................................... 53
3.3 Chuyển vector pIBR25-dAVC bằng tế bào trần (Streptomyces lividans) .... 54
3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào .................... 55
3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) ............................ 55
3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ PEG bổ sung khi chuyển gene ............................ 56
3.4 Tách và thu nhận hỗn hợp enzyme thô doxAVC ......................................... 57
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................... 59
4.1 Kết luận .......................................................................................................... 59
4.2 Đề xuất ........................................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 60


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Chú thích

Amp

Ampicillin

bp

Base paire

C

Carbon

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxyribonucleotides

ARN

Ribonucleic Acid

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

kb

Kilobase

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

IPTG

Isopropyl-thio-β-galactoside

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate

DTT

Dithinotheitol

Da

Dalton


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Thiết bị sử dụng

33

Bảng 2.2

Hóa chất sử dụng

34

Bảng 3.1

Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh khi phủ bề mặt đĩa nuôi

55

tế bào (overlay)
Bảng 3.2

Khảo sát thời gian lysozyme thích hợp cho chuyển gene

56

Bảng 3.3

Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyển gene

56


DANH MỤC HÌNH VẼ
Tên hình

Trang

Hình 1.1

Cơ chế tác dụng của kháng sinh

7

Hình 1.2

Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin

17

Hình 1.3

Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh

18

DXR
Hình 1.4

Các gen tham gia vào quá trình mã hóa cho các enzyme

19

Polyketide synthase loại II và tổng hợp hợp chất trung
gian ε-rhodomycinone
Hình 1.5

Cơ chế và con đường tổng hợp DNR và DXR từ ε-

20

rhodomycinone
Hình 1.6

Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh

24

Doxorubicin
Hình 1.7

Tóm tắt các phản ứng xúc tác bởi gen doxA

25

Hình 1.8

Cấu trúc pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen.

27

Hình 1.9

Cấu trúc vetcor biểu hiện pIBR25

28

Hình 1.5

Tiến trình thực hiện

30

Hình 3.1

Điện di DNA tổng số

46

Hình 3.2

Qui trình tạo vector tách dòng pGEM-T-doxAV

47

Hình 3.3

Điện di sản phẩm PCR gen doxAV

47

Hình 3.4

Điện di plasmid pGEm-T-doxAV từ khuẩn lạc

48

Hình 3.5

Điện di plasmid pGEM-T-doxAV được cắt

bằng 2

49

enzyme XbaI và EcoRI
Hình 3.6

Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC

49


Hình 3.7

Điện di chạy PCR gen drrC

50

Hình 3.8

Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc

51

Hình 3.9

Điện di plasmid pGEm-T-drrC được cắt bằng 2 enzyme

51

XbaI và HindIII
Hình 3.10 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC

52

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC

53

Hình 3.12 Kết quả điện di pIBR25-dAVC và được cắt bởi 2

54

enzyme XbaI và EcoRI
Hình 3.13 Các khuẩn lạc S.lividans pIBR25.dAVC đã được tái tổ

57

hợp phát triển trên đĩa thạch sau khi chuyển gen 36 giờ
Hình 3.14 Điện di enzyme tổng số protein

58


MỞ ĐẦU
Năm 1928, penicillin, loại kháng sinh đầu tiên được tìm ra bởi một nhà
sinh học người Scotland, Alexander Fleming. Ông được coi là người đã mở ra
kỷ nguyên vàng của kháng sinh trong y học. Nó được gọi là thần dược của tây
y, khi đã cứu hàng triệu người bệnh mỗi năm khỏi cái chết gây ra bởi nhiễm
khuẩn.
Tuy nhiên, câu chuyện tuyệt vời ấy dường như đang đi đến hồi kết. Sau
hơn 70 năm kháng sinh được đưa vào y học, thời đại hoàng kim của nó đã
không còn được duy trì. Có hàng triệu người đã chết mỗi năm trong thời đại
chưa có kháng sinh, và rồi sẽ là một con số tương tự trong những năm sắp tới.
Cơn ác mộng này mang tên "kháng kháng sinh", và xuất phát từ chính sự lạm
dụng thuốc của con người. Các hệ quả có thể thấy ngay đó là vi khuẩn đã trở
nên kháng thuốc hơn làm cho hiệu quả điều trị không cao. Chính vì vậy, song
song với việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách hợp lí của người bệnh thì
việc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng sản xuất các loại kháng sinh mới
đang là nghĩa vụ và trách nhiệm của các nhà khoa học trên toàn thế giới.
Doxorubicin là kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, được sử dụng
trong điều trị các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ lympho
như ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu... Hiện
nay, kháng sinh này được biết đến bởi các đặc điểm vượt trội của nó như có
phổ tác dụng mạnh và tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào quá trình sinh tổng
hợp tế bào ung thư mới.
Doxorubicin là một loại kháng sinh có giá thành rất đắt và hiện nay ở
Việt Nam chưa sản xuất được. Doxorubicin có phổ tác dụng rất rộng so với
DNR tuy nhiên trong con đường sinh tổng hợp tự nhiên của chủng xạ khuẩn
Streptomyces peucetius thì hàm lượng DNR được tạo ra với hàm lượng lớn
hơn rất nhiều so với DXR. Một trong những biện pháp tăng kháng sinh DXR
Page | 1


đó là thực hiện phản ứng chuyển hóa DNR thành DXN. Một trong những biện
pháp làm tăng năng suất kháng sinh DXR đó là thực hiện phản ứng in vitro để
biến đổi Daunorubicin thành Doxorubicin. Có 37 gen tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp kháng sinh Doxorubicin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces
peucetius, trong đó có 3 gen quan trọng doxA, dnrV và drrC là 3 gen tham gia
vào quá trình chuyển hóa DNR thành Doxorubicin. Gen doxA là gen điều
khiển quá trình sản xuất DXR, gen dnrV là gen điều hòa của gen doxA, gen
drrC là gen kháng kháng sinh DXR giúp xạ khuẩn có thể tồn tại trong môi
trường DXR. Do vậy, nếu thiếu bất kì 1 gen nào cũng làm cho sản lượng
DXR giảm đáng kể. Vì vậy, em đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài
mang tên: “Nghiên cứu thiết kế và biểu hiện nhóm gen doxAVC trên chủng
xạ khuẩn Streptomyces lividans” nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh DXR.

Page | 2


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa về kháng sinh
Kỷ nguyên hiện đại của hóa trị liệu kháng khuẩn được bắt đầu từ việc
tìm ra sulfonamid (Domagk, 1936). Thời kỳ vàng son của kháng sinh bắt đầu
từ khi sản xuất penicilin để dùng trong lâm sàng (1941). Kháng sinh được coi
là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm
sự phát triển của vi sinh vật khác. Khi đó người ta đã định nghĩa : "Kháng
sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi
khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối
với các vi sinh vật khác", theo Waksman 1942.
Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể tổng hợp, bán
tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các
chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật
những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng
sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự
nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự
phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có
tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con
đường cung cấp chung” [3].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml
dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị
kháng sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một
thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm
định trong thời gian xác định [3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI
penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0µg (Hopwood, 2007).

Page | 3


1.1.2 Lịch sử kháng sinh
Kháng sinh được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin cách đây
hơn 70 năm. Nhưng thực tế, từ lâu con người đã biết dùng các chất có tác
dụng chữa trị các bệnh mà sau này được gọi là các chất kháng sinh.
Giữa thế kỷ 17, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cách
dùng rêu đắp lên vết thương.
Cuối thế kỷ 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa vết
thương. Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì mốc meo trên bánh mỳ
thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn và
lại càng không biết chất kháng sinh là gì.
Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi
nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào
hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn. Hiện tượng kì lạ này đã được
Fleming nghiên cứu, phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là
Penicillium notatum – một chủng tạo penicillin [1][2].
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới
được xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa
liệu pháp kháng sinh.
Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces
griseus. Sau đó đến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc
nhóm macrolide và glycopeptide (tức vancomycin) được phát hiện. Các
kháng sinh tổng hợp như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất
quinolone đã được tạo ra vào năm 1962.
Đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, khi công nghệ sinh học và
hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh
mới. Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở thế
kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ 1980 số
kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển
Page | 4


và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trạng đáng
báo động là ngày càng tăng các vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh
hiện có. Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải được khắc phục bằng việc
phát hiện ra các thuốc mới. Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng nhanh
kháng thuốc và tốc độ kháng thuốc nhanh hơn cả tốc độ tạo được thuốc mới
của con người [2].
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Việc phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh
mục các kháng sinh do việc tìm ra các kháng sinh ngày càng nhiều. Nhờ đó
tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ
chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh [2].
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác
dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa
học. Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học
nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh [2].
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính[2]:
• Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate.
• Nhóm 2: Các lactone macrolide.
• Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất.
• Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid.
• Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ.
• Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy.
• Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no.
• Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm.
• Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng.
Page | 5


Phân loại kháng sinh theo cơ chế tác dụng
Dựa vào cơ chế tác dụng, kháng sinh được chia thành 6 nhóm chính như
sau:
• Nhóm 1: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của thành tế bào
• Nhóm 2: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của màng tế bào
• Nhóm 3: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của Protein của vi khuẩn
• Nhóm 4: Kháng sinh ức chế sự tổng hợp DNA của vi khuẩn
• Nhóm 5: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic
• Nhóm 6: Kháng sinh ức chế một số quá trình tổng hợp khác
Phân loại kháng sinh dựa vào mức độ tác dụng
Dựa vào mức độ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm sau:
• Nhóm 1: Kháng sinh diệt khuẩn bao gồm những kháng sinh tác dụng
đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp DNA và ARN.
• Nhóm 2: Kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzyme hay các ribosome
30S, 50S và 70S.
Phân loại kháng sinh dựa vào phổ tác dụng
Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh được phân thành 5 nhóm sau:
• Nhóm1: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một
loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó.
• Nhóm 2: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng.
• Nhóm 3: Nhóm kháng sinh dùng ngoài.
• Nhóm 4: Nhóm kháng sinh chống lao.
• Nhóm 5: Nhóm kháng sinh chống nấm.

Page | 6


1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí
chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng
trao đổi chất làm ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.
Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong
nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác
dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào,
tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp DNA,
tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp
và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian [3].

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.

Sự ức chế tổng hợp thành tế bào
Các nhà khoa học đã làm thay đổi các β-lactam để tạo ra các dẫn xuất
bán tổng hợp. Các chất này bền hơn trong môi trường axit của dạ dày, dễ hấp
thụ hơn trong đường ruột, ít mẫn cảm hơn so với sự bất hoạt các enzyme vi
khuẩn hoặc hoạt động mạnh hơn chống lại nhiều vi khuẩn.

Page | 7


Dưới sự tác động của các kháng sinh sẽ ngăn cản vi khuẩn tăng số
lượng nguyên liệu thành tế bào, song không gây tác động lên thành tế bào
peptidoglucan, nên chỉ có hiệu quả đối với các tế bào trưởng thành hoặc đang
sinh sản, các tế bào nghỉ không bị ảnh hưởng. Tất nhiên, chúng sẽ không gây
hại đối với các tế bào động thực vật vì chúng không có thành tế bào
peptidoglucan.
Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Bacitracin,
Cephalosporin, Cycloserine, Penicillin, Rostocetin, Vancomycin [3].
Sự tổn thương màng tế bào
Một số kháng sinh gây tổn thương cho thành thành tế bào bằng cách
phá vỡ màng tế bào chất của tế bào đích bằng cách gắn vào màng và làm hư
hỏng tính toàn vẹn của nó.
Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Amphotericin B,
Colistin, Imidazole, Nystatin, Polymycins [3].
Sự ức chế tổng hợp Protein
Quá trình này xảy ra thông qua việc chuyển giao thông tin di truyền đã
được mã hóa trên mARN. Quá trình tổng hợp protein diễn ra qua ba giai đoạn
là giai đoạn khởi đầu, giai đoạn kéo dài, giai đoạn kết thúc. Các loại kháng
sinh khác nhau sẽ tác động vào quá trình này ở những giai đoạn khác nhau.
Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như:
Tác động vào giai đoạn khởi đầu:
- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của
ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can
thiệp tiếp cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào
chuỗi polypeptide mới thành lập.
Page | 8


- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome
làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi
polypeptide.
Tác động vào giai đoạn kéo dài:
- Tetracyclin ảnh hưởng tới sự gắn tARN mang amino acid vào ribosome
ở tiểu phần 30S của ribosome do đó ngăn cản sự bổ sung amino acid
vào chuỗi polypeptide đang tổng hợp.
Sự ức chế tổng hợp acid nucleic
Các hợp chất có khả năng hoạt động như các tác nhân kháng vi sinh vật
bằng cách can thiệp vào chức năng của các acid nucleic được gọi là các chất
tương tự như acid nucleic. Do có sự giống nhau về mặt cấu trúc của các hợp
chất này với các acid nucleic thông thường cho phép chúng gắn được vào các
phân tử DNA hoặc ARN của các tác nhân gây bệnh, sau đó, chúng sẽ làm
biến dạng các phân tử axit nucleic và ngăn ngừa sự sao chép, phiên mã và
dịch mã xảy ra sau đó. Đặc biệt, các chất có cấu tạo tương tự như acid nucleic
cũng có tác dụng lên các tế bào ung thư trong giai đoạn phân chia nhánh [3].
Sự ức chế tổng hợp acid folic
Acid folic là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine,
từ đó tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamides và
trimethoprim là những chất tương tự về mặt cấu trúc và hóa học với các acid
p-aminobenzoic (PABA) và acid folic. Sulfamides đối kháng cạnh tranh với
PABA - một tiền chất để tổng hợp acid folic. PABA kết hợp với acid pteroic
hoặc axit glutamic để tạo PGA, chất này giống như một coenzym trong sự
tổng hợp purin và timin. Do đó khi thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid
nucleic. Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển
hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của acid folic), làm
cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn [3]
Page | 9


1.2 Xạ khuẩn
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên
Đặc điểm về xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc nhóm Procaryotes, có cấu tạo nhân đơn giản giống như
vi khuẩn [9]. Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân
nhánh phức tạp và có nhiều màu sắc giống như nấm mốc. Các sợi kết với
nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, v.v....
Màu sắc của xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng. Đường kính sợi
của xạ khuẩn khoảng từ 0,1 - 0,5 µm. Có thể phân biệt được hai loại sợi khác
nhau. Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của
khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử. Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào
môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố
thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí
sinh. Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng [7].
Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi
này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có
sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường.
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng
phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp
không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay
đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc thường có dạng
phóng xạ (vì thế mà gọi là xạ khuẩn), một số có dạng những vòng tròn đồng
tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn
đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua
vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng lại
sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh

Page | 10


trưởng sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo thành khuẩn
lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm [4].
Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử. Bào tử được hình thành trên
các nhánh phân hoá từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh
bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau. Có loài dài
tới 100 - 200 nm, có loài chỉ khoảng 20 - 30 nm. Có loài cấu trúc theo hình
lượn sóng, có loài lò xo hay xoắn ốc. Sắp xếp của các cuống sinh bào tử cũng
khác nhau. Chúng có thể sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc vòng hoặc
từng chùm. Đặc điểm hình dạng của cuống sinh bào tử là một tiêu chuẩn phân
loại xạ khuẩn [9].
- Kiểu kết đoạn:
Hạt cromatin trong cuống sinh bào tử được phân chia thành nhiều hạt
phân bố đồng đều dọc theo sợi cuống sinh bào tử. Sau đó tế bào chất tập trung
bao bọc quang mỗi hạt cromatin gọi là tiền bào tử. Tiền bào tử hình thành
màng tạo thành bào tử nằm trng cuống sinh bào tử. Bào tử thường có hình cầu
hoặc ôvan, được giải phóng khi màng cuống sinh bào tử bị phân giải hoặc bị
tách ra
- Kiểu cắt khúc:
Hạt cromatin phân chia phân bố đồng đều dọc theo cuống sinh bào tử.
Sau đó giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần đều có tế bào chất.
Bào tử hình thành theo kiểu này thường có hình viên trụ hoặc hình que.
Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có thể sinh sản
bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ
khuẩn ty. Thuộc nhóm Procaryotes ngoài xạ khuẩn và vi khuẩn còn có niêm
vi khuẩn, xoắn thể, ricketsia và Mycoplasma. Các nhóm này đều có cấu tạo
nhân đơn giản. Cấu tạo tế bào và hoạt tính sinh lý có nhiều sai khác. Ví dụ
như Mycoplasma có kích thước rất nhỏ bé so với vi khuẩn, không có màng tế
Page | 11


bào, vì thế hình dạng luôn biến đổi. Ricketsia cũng có kích thước nhỏ bé,
sống ký sinh bắt buộc v.v... [9].
Xạ khuẩn Streptomyces
Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi
thuộc nhánh streptomycetaceae. Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã
được mô tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi
khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ G, C có phần trăm cao [14]. Vi khuẩn
này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces
sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình
chuyển hóa các chất. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến
nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces). Streptomyces thường sống
ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chủng vi sinh này sản
xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá
trị lớn trong lĩnh vực y tế [9].
Streptomyces và họ hàng của nó đã trở nên phổ biến nhờ vào khả năng
sản xuất ra các chế phẩm như:
• Thuốc kháng sinh (antibacterials): streptomycin, erythromycin,
tetracyclin, neomycin, chloramphenicol, vancomycin, gentamicin.
• Thuốc kháng nấm: nystatin, amphotericin.
• Thuốc chống ung thư: doxorubicin, bleomycin, mitomycin.
• Ức chế miễn dịch: rapamycin.
• Thuốc diệt cỏ: bialaphos.
Quá trình sinh tổng hợp của các hợp chất này khá khó khăn. Quy định
một cách cẩn thận với các quá trình của sự phân lập tế bào, bắt đầu trong việc
chuyển đổi sang sợi nấm trên môi trường thạch hoặc trong giai đoạn cuối theo
cấp số nhân (trong các môi trường nuôi cấy lỏng).

Page | 12


Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi
khuẩn gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu
thường là 25 – 30oC, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở
nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng
sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên
sinh.
1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh. Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế
giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Một trong những tính chất của
các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói
riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một
nhóm vi sinh vật nhất định. Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn
đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh
là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Có nhiều quan điểm khác
nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được
ủng hộ hơn cả là [5]:
- Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh
có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay
kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển
trong hệ sinh thái cục bộ đó.
- Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho
khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên,
nhất là các loài có bào tử. Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác
nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh
tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
Page | 13


Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất
như Chloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleoside. Chất
kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau
như lincomycin, novobiocin. Chất kháng sinh được hình thành bằng con
đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các
phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình
sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài
các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu
trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor.
1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius
Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500
loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong DNA. Một phần rất lớn các chất
kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài
thuộc chi Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin,
erythromycin và tetracyclin [4].
Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt
tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện
chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.
Streptomyces peucetius ATCC27952 thuộc chi Streptomyces, là chủng
sinh kháng sinh Doxorubicin. Khi sinh trưởng trên môi trường NDYE ở nhiệt
độ 280C sau 4-5 ngày bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc.
Về hình thái xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 tồn tại ở
dạng khuẩn ty. Khi nuôi trên môi trường đĩa thạch hoặc dịch lỏng thì dịch
nuôi có nâu đỏ, các tế bào tồn tại dưới dạng sợi mảnh, nhỏ nhưng liên kết với

Page | 14


nhau thành từng búi sợi. Mỗi sợi khuẩn ty bao gồm nhiều đốt nhỏ và mỗi đốt
nhỏ là một tế bào xạ khuẩn [4].
Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 có khả năng hấp thụ các
nguồn cacbohydrat khác nhau. Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi
trường có glucose, sacharose và maltose. Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh
trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất là trong
môi trường có maltose.
1.2.4 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24
Streptomyces lividans TK24 là một loại vi khuẩn đất gram dương, cấu
trúc dạng sợi. Với hàm lượng G-C cao nên bộ gen của chúng rất bền.
Streptomyces lividans TK24 có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ có
trong đất. Do môi trường sống tự nhiên của chúng và chúng không gây bệnh
nên chúng được sử dụng như máy chủ để trổng hợp và tiết ra protein tương
đồng và dị hợp. Các tế bào Streptomysces lividans TK24 đã được nghiên cứu
để sử dụng trong việc điều khiển hệ gene và điều hòa tăng hiệu xuất sinh tổng
hợp kháng sinh, một số chất là tác nhân chống ung thư [8]
Streptomyces lividans TK24 có cấu trúc tuyến tính, và so với
Streptomyces coelicolor, chúng có cấu trúc chung tương đồng giống hệt nhau
ở chuỗi Cosmid. Các khu vực lõi trung tâm chứa các gen cần thiết, trong khi
bên ngoài lõi mang gen có điều kiện thích nghi với DNA của loài ta chuyển
gen vào. Không giống như hầu hết các loài Eubacteria, loài Streptomyces
thường chứa nhiễm sắc thể tuyến tính và plasmid. Các plasmid tuyến tính là
dài 12-1700 kb. Với các trình tự lặp lại đảo ngược trong các telomere của họ,
việc nhân rộng plasmid tuyến tính của strptomyces bắt đầu ở locus nằm ở
trung tâm và tiếp tục hai chiều đối với các telomere. Điều này để lại một dải
đơn dài khoảng 280 nucleotide. Tuy nhiên, khi các telomere bị xóa, các locus
nằm ở trung tâm plasmid tuyến tính của Strepmyces lividans TK24 cũng có
Page | 15


thể duy trì chế độ khép kín. Do đó các chế độ sao chép và chức năng của
Streptomyces lividans TK24 khác nhau đã được bảo tồn cao [8].
1.3 Giới thiệu về kháng sinh Doxorubicin
1.3.1 Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin
Doxorubicin(DXR) hay còn được gọi là Hydroxydaunorubicin, là một
trong những kháng sinh quan trọng thuộc nhóm Anthracycline được tạo ra bởi
con đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai của chủng xạ khuẩn Streptomyces
peucetius ATCC27952 Dẫn xuất được sử dụng trong điều trị bệnh u bướu và
ung thư bằng phương pháp hóa trị liệu.
Doxorubicin là kháng sinh có khả năng điều trị các loại bệnh về khối u
cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ Lympho như ung thư bàng quang, ung
thư vú, ung thư cổ tử cung , ung thư máu...
Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn
Streptomyces peucetius ATCC27952 đươc phân lập từ tự nhiên. DXR được
tạo ra bằng cách thêm vào cấu trúc của Daunorubicin (DNR) (sản phẩm trao
đổi chất bậc một của chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952,
tiền thân của Doxorubicin) vị trí C14 một nhóm OH. Vì vậy mà DXR còn
được gọi là C14 - Hydroxydaunorubicin.
Cũng giống như các kháng sinh khác thuộc nhóm kháng sinh
Anthracycline, DXR hoạt động bằng cách liên kết với phân tử DNA, ức chế
quá trình sinh tổng hơp acid nucleic và sự phân chia của tế bào ung thư nhưng
nó lại có một tác dụng phụ lớn nhất là gây tổn thương cho tim và đe dọa tính
mạng của người sử dụng nếu có tiền sử về bệnh tim.
1.3.2 Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin
- Công thức phân tử: C27H29NO11.
- Tên khác: C-14 hydroxydaunorubicin.
Page | 16


- Tên thương mại: Doxil, Adriamycin.
- Tên khoa học: (8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methylt-etrahydro2H-pyran-2-yloxy)-6,7,8,11-trihydroxy-8-2-(hydroxyacetyl)-1methoxy-7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione.
- Kích thước: 1.583 × 1.212 (4 KB).
- Khối lượng phân tử: 543.526 đơn vị Cacbon.
- Nhiệt độ nóng chảy: 205oC
- Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nước và hexan.

Hình 1.2 Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin.

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin
Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn được
phân lập trong tự nhiên là Strepyomyces peucetius. Chủng xạ khuẩn này tạo
ra sản phẩm đầu tiên là DNR. Khi có một nhóm OH được gắn vào vị trí C-14
của DNR thì hình thành sản phẩm bậc hai, đó chính là Doxorubicin.
Theo nhiều chứng minh cho thấy rằng, DXR có hoạt tính mạnh hơn và
ưu việt hơn so với DNR nhưng nếu tuân theo con đường sinh tổng hợp tự
nhiên của chủng xạ khuẩn trên thì hàm lượng DNR được tạo ra với hàm lượng
lớn hơn rất nhiều so với DXR.

Page | 17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×