Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen kháng kháng sinh drrc từ xạ khuẩn streptomyces peucetius

HOÀNG VÂN ANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

---------------

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN
KHÁNG KHÁNG SINH DRRC TỪ XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES PEUCETIUS

2014 - 2016

HOÀNG VÂN ANH

Hà Nội, 1/2017



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

---------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã ngành: 60420201

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN
KHÁNG KHÁNG SINH DRRC TỪ XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES PEUCETIUS
HỌC VIÊN: HOÀNG VÂN ANH
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TẠ THỊ THU THỦY

Hà Nội, 1/2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố
trong bất cứ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 10 tháng 1 năm 2017
Tác giả

Hoàng Vân Anh


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Tạ Thị Thu Thủy đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn trong phòng Sinh học
phân tử, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội - nơi tôi thực
hiện luận văn đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân
yêu của tôi.
Xin chân thành cảm ơn.




MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
PHẦN MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 2
1.1

Tổng quan về kháng sinh ....................................................................... 2

1.1.1

Lịch sử kháng sinh ................................................................................... 2

1.1.2

Định nghĩa kháng sinh ............................................................................. 3

1.1.3

Cơ chế tác dụng của kháng sinh .............................................................. 4

1.1.3.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào .................................................................. 4
1.1.3.2 Tổn thương màng nguyên sinh chất. ....................................................... 5
1.1.3.3 Ức chế quá trình tổng hợp protein........................................................... 5
1.1.3.4 Ức chế tổng hợp axit nucleic ................................................................... 5
1.1.3.5 Ức chế chuyển hóa axit folic ................................................................... 6
1.2

Xạ khuẩn .................................................................................................. 6

1.2.1

Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ..................................... 6

1.2.2

Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ........................................................... 7

1.2.3

Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 .................................................. 8

1.3

Kháng sinh Doxorubicin ........................................................................ 9

1.3.1

Giới thiệu chung về Doxorubicin ............................................................ 9

1.3.2

Cấu trúc của Doxorubicin ...................................................................... 10

1.3.3

Cơ chế hoạt động của Doxorubicin ....................................................... 11

1.4

Giới thiệu về gen drrC ............................................................................ 11

1.5

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu........................................................... 12


CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 13
2.1

Vật liệu, hóa chất và thiết bị ............................................................... 13

2.1.1

Vật liệu .................................................................................................... 13

2.1.2

Môi trường nuôi cấy ............................................................................... 15

2.1.3

Hóa chất .................................................................................................. 18

2.1.4

Thiết bị .................................................................................................... 19

2.2

Các phương pháp nghiên cứu............................................................. 20

2.2.1

Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ xạ khuẩn .............................. 21

2.2.2

Phương pháp thiết kế mồi ...................................................................... 22

2.2.3

Phương pháp PCR .................................................................................. 23

2.2.4

Phương pháp điện di trên gel agarose ................................................... 26

2.2.5

Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose......................................... 26

2.2.6

Phương pháp nối DNA........................................................................... 27

2.2.7

Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn ............................ 28

2.2.8

Phương pháp cắt DNA bằng enzym giới hạn ....................................... 28

2.2.9

Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn E. coli bằng sốc nhiệt ................ 29

2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans .......... 31
2.2.11 Phương pháp biểu hiện gen và thu nhận enzym trong xạ khuẩn ......... 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 33
3.1

Tách dòng gen drrC bằng vector tách dòng pGEM-T ................... 33

3.1.1

Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 33

3.1.2

Nhân gen drrC tạo vector pGEM-T drrC .............................................. 34

3.1.3

Giải trình tự gen drrC ............................................................................. 37

3.2

Tạo vector biểu hiện pIBR25.drrC .................................................... 43

3.3

Biểu hiện gen drrC trong hệ xạ khuẩn Streptomyces lividans ..... 44

3.3.1

Điều kiện thích hợp chuyển pIBR25.drrC vào xạ khuẩn ..................... 44

3.3.2

Điều kiện thích hợp biểu hiện gen drrC ................................................ 47


3.3.2.1 Nhiệt độ biểu hiện thích hợp.................................................................. 47
3.3.2.2 Thời gian biểu hiện thích hợp ................................................................ 48
3.3.2.3 Môi trường phù hợp để biểu hiện protein từ chủng tái tổ hợp............. 49
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................... 51
4.1

Kết luận .................................................................................................. 51

4.2

Đề xuất ................................................................................................... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 52


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Chú thích

bp

base pair

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNR

Daunorubicin

DXR

Doxorubicin

kb

kilobase

kDa

kilodalton

PEG

Polyethylene Glycols

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate PolyAcrylamide

RNA

Ribonucleic acid


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:

Kháng sinh được phát hiện qua các năm ................................................ 2

Hình 1.2:

Cơ chế tác dụng của kháng sinh ............................................................. 4

Hình 1.3:

Công thức cấu tạo của Doxorubicin ..................................................... 10

Hình 2.1:

Cấu trúc vector tách dòng pGEM-T Easy ............................................. 14

Hình 2.2:

Cấu trúc vector biểu hiện pIBR25 ........................................................ 15

Hình 2.3 : Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................. 20
Hình 2.4:

Sơ đồ phản ứng PCR ............................................................................ 25

Hình 3.1:

Streptomyces peucetius trên môi trường NDYE ................................... 33

Hình 3.2:

DNA tổng số tách chiết từ Streptomyces. peucetius ............................. 34

Hình 3.3:

Điện di sản phẩm PCR gen drrC .......................................................... 35

Hình 3.4:

Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drrC ...................................... 35

Hình 3.5:

Điện di DNA pGEM-T-drrC plasmid ................................................... 36

Hình 3.6:

pGEM-T-drrC được cắt bằng EcoRI và HindIII ................................... 37

Hình 3.7:

Kết quả so sánh gen drrC giải trình tự với gen drrC trên Genbank ....... 39

Hình 3.8:

So sánh độ tương đồng gen drrC tách dòng với trình tự gen drrC
trên Genbank ....................................................................................... 42

Hình 3.9 : Khuẩn lạc E. coli JM109 có chứa pIBR25.drrC.................................... 43
Hình 3.10 Kết quả điện di pIBR25-drrC được cắt bởi EcoRI và HindIII .............. 44
Hình 3.11: Khuẩn lạc trên môi trường thạch .......................................................... 46
Hình 3.12: Điện di enzyme drrC ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau ..................... 48
Hình 3.13: Điện di protein drrC ở các điều kiện thời gian khác nhau ..................... 49
Hình 3.14: Điện di protein tách chiết ở các môi trường khác nhau: ....................... 50


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài ................................................. 13
Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB .................................................................. 15
Bảng 2.3: Thành phần môi trường NDYE ............................................................ 16
Bảng 2.4: Thành phần môi trường AMP .............................................................. 16
Bảng 2.5: Thành phần môi trường R2YE ............................................................. 17
Bảng 2.6: Thành phầ môi trường ISP2 ................................................................. 17
Bảng 2.7: Thành phần môi trường ISP4 ............................................................... 18
Bảng 3.1. Khảo sát điều kiện thích hợp cho chuyển gen vào tế bào ...................... 45


PHẦN MỞ ĐẦU
Ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, có
khoảng 7,6 triệu người chết mỗi năm do ung thư. Sử dụng thuốc chống ung
thư là một trong những biện pháp hữu hiệu trong việc điều trị bệnh. Thuốc
chống ung thư là những hoạt chất có tác dụng ức chế sự phát triển nhân lên
của tế bào ung thư và thải loại chúng ra khỏi cơ thể. Doxorubicin là kháng
sinh kìm tế bào thuộc họ các anthracycline ức chế quá trình tổng hợp DNA và
RNA của tế bào khối u. Hiện nay, kháng sinh này được biết đến bởi các đặc
điểm vượt trội của nó như có phổ tác dụng mạnh và tác động mạnh mẽ, trực
tiếp vào quá trình sinh tổng hợp tế bào ung thư mới, sử dụng trong điều trị
bệnh bạch cầu, đặc biệt có hiệu quả đối với dòng lympho, các bệnh như ung
thư máu, ung thư cổ tử cung... Doxorubicin được tạo ra bởi con đường sinh
tổng hợp sản phẩm bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius
ATCC27952.
Gen drrC là một trong những gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
doxorubicin. Gen drrC là gen kháng kháng sinh, vừa có tác dụng sinh tổng
hợp kháng sinh, vừa giúp xạ khuẩn có thể tồn tại trong môi trường
doxorubicin. Tuy đóng vai trò quan trọng nhưng chưa có nhiều nghiên cứu cụ
thể về gen này.
Vì vậy, tôi đã quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu tách dòng và biểu
hiện gen kháng kháng sinh drrC từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius”

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử kháng sinh
Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877)
sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này
một số vi khuẩn hiếu khí lành tính khác.
Năm 1885, Babes đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một
chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hóa học có hoạt tính kìm hãm
các chủng đối kháng.
Năm 1907, Nicolle là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của
Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại trực khuẩn này.
Năm 1925, Gratia và đồng nghiệp đã tách được từ nấm mốc một chế
phẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do
cầu khuẩn.
Năm 1928, nhà khoa học Alexander Fleming nhận thấy trong môi trường
nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicilium thì khuẩn lạc gần nấm sẽ
không phát triển được. Tới năm 1929 thuật ngữ “chất kháng sinh” mới được
ông mô tả một cách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về Penicillin.
Đến năm 1941, Penicilin được sản xuất để dùng trong lâm sàng.

Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm

2


Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960 đã ghi nhận những bước
tiến vượt bậc của công nghệ kháng sinh với việc khám phá ra hàng loạt chất
kháng sinh, có thể gọi đây chính là thời kỳ vàng son của kháng sinh (hình
1.1). Ở thời kỳ này, việc phát triển và sử dụng kháng sinh trong điều trị đã
làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Hiện nay, với sự phát triển của
nền y học, công nghệ sinh học và hóa dược, đã có hơn 8000 chất kháng sinh
được tìm ra và ứng dụng vào điều trị.
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh
Vào thời kỳ đầu, người ta định nghĩa: “ Kháng sinh là những sản
phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm),
có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh
vật khác”.
Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể tổng hợp, bán
tổng hợp các kháng sinh tự nhiên và nhân tạo, do đó định nghĩa kháng sinh đã
được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc
tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển
hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng
hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung
cấp chung” [6].
Để biểu thị hoạt tính của một chất kháng sinh, người ta sử dụng đơn vị
kháng sinh (UI) để chỉ độ lớn giá trị hoạt tính của kháng sinh đó. Giá trị hoạt
tính thường dùng trong dịch thể là đv/ml hay trong chế phẩm là đv/mg. Đó
chính là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan hoàn toàn trong một thể tích môi
trường xác định có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn kiểm định. Do vậy,
mỗi một chất kháng sinh có nồng độ hòa tan tối thiểu vào môi trường dịch thể
khác nhau, hay nói một cách khác là hoạt tính kháng sinh của các chất kháng
sinh trong cùng một lượng là khác nhau.

3


1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác động của chất kháng sinh là những cách thức mà chất kháng
sinh tác động lên các vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến
sự sinh trưởng của vi sinh vật. Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc
vào bản chất hóa học và nồng độ của chất kháng sinh. Các đích tác dụng đặc
trưng cho từng nhóm kháng sinh, nhìn chung cơ chế tác động của chất kháng
sinh được biểu hiện theo các hướng cơ bản sau [1]:

Hình 1.2: Cơ chế tác dụng của kháng sinh

1.1.3.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào
Thành tế bào được cấu trúc chủ yếu bởi các peptidoglucan, có chức năng
giữ hình dạng đặc trưng cho tế bào, bảo vệ tế bào khỏi vỡ dưới áp lực thẩm
thấu cao ở bên trong tế bào. Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải
tổng hợp các đơn vị peptidoglucan mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh
trưởng của thành tế bào.
Các kháng sinh β-lactam (đại diện là penicillin và cephalosporin) ức chế
sự hình thành peptidoglucan mới bằng cách gắn với transpeptidase, ngăn cản

4


sự kết nối các phân tử peptidoglucan làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào
của vi khuẩn.
Một số chất kháng sinh khác như vancomycin ức chế sinh tổng hợp
thành tế bào vi khuẩn ở giai đoạn sớm hơn so với β-lactam, ngoài ra còn tác
động đến tính thấm màng tế bào và quá trình tổng hợp DNA.
1.1.3.2 Tổn thương màng nguyên sinh chất.
Thuộc nhóm này bao gồm có các kháng sinh colistin, polymycins,
amphotericin B. Các kháng sinh này phá hủy màng sinh chất bằng cách gắn
với ergosterol hay cholesterol là thành phần của màng sinh chất, tạo nên các
lỗ trên màng và làm thất thoát nội chất ra ngoài dẫn tới gây chết tế bào.
1.1.3.3 Ức chế quá trình tổng hợp protein
Quá trình này xảy ra thông qua việc chuyển giao thông tin di truyền đã
được mã hóa trên mRNA. Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như:
- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của
ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp
cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi
polypeptide mới thành lập.
- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome
làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide.
- Nhóm tetracyclin ảnh hưởng tới sự gắn tRNA mang amino acid vào
ribosome ở tiểu phần 30S của ribosome do đó ngăn cản sự bổ sung amino
acid vào chuỗi polypeptide đang tổng hợp.
1.1.3.4 Ức chế tổng hợp axit nucleic
Một số chất kháng sinh đã cản trở quá trình tổng hợp axit nucleic bằng
cách ức chế sự tổng hợp nucleotit, ức chế sao chép hoặc dừng phiên mã. Do

5


không thể tổng hợp vật chất di truyền nên các vi sinh vật gây bệnh không thể
sinh sản và duy trì nòi giống được. Cụ thể:
- Nhóm quinolon: ức chế DNA gyrase (enzyme duỗi xoắn DNA để tổng
hợp RNA), ngăn cản tổng hợp DNA vi khuẩn.
- Rifampicin gắn vào tiểu đơn vị β của RNA-polymerase làm sai lệch
thông tin của enzym này, dẫn đến ức chế tổng hợp RNA mới.
1.1.3.5 Ức chế chuyển hóa axit folic
Acid folic là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ
đó tổng hợp nên protein và các axit nucleic của vi khuẩn. Sulfamides và
trimethoprim là những chất tương tự về mặt cấu trúc và hóa học với các axit
p-aminobenzoic (PABA) và axit folic.
- Sulfamides đối kháng cạnh tranh với PABA- một tiền chất để tổng hợp
axit folic. PABA kết hợp với axit pteroic hoặc axit glutamic để tạo PGA, chất
này giống như một coenzym trong sự tổng hợp purin và timin. Do đó khi
thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, axit nucleic.
- Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển
hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của axit folic), làm
cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn.
1.2 Xạ khuẩn
1.2.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh. Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế
giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Một trong những tính chất của
các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói
riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một
nhóm vi sinh vật nhất định. Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn
đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh

6


là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Có nhiều quan điểm khác
nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được
ủng hộ hơn cả là [4]:
- Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh

có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm
được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh
thái cục bộ đó.
- Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho
khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất
là các loài có bào tử. Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh
vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo
một số con đường nhất định:
- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông
qua một chuỗi phản ứng enzym.
- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hay ba chất chuyển hóa sơ cấp
khác nhau.
- Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất
chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình
sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài
các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu
trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor [5].
1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius
Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500
loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong DNA. Một phần rất lớn các chất
kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài
7


thuộc chi Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin,
erythromycin và tetracyclin [18].
Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên
năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi
này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.
Streptomyces peucetius ATCC27952 thuộc chi Streptomyces, là chủng
sinh kháng sinh doxorubicin. Khi sinh trưởng trên môi trường NDYE ở nhiệt
độ 28°C sau 4-5 ngày bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc.
Về hình thái xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 tồn tại ở
dạng khuẩn ty. Khi nuôi trên môi trường đĩa thạch hoặc dịch lỏng thì dịch
nuôi có nâu đỏ, các tế bào tồn tại dưới dạng sợi mảnh, nhỏ nhưng liên kết với
nhau thành từng búi sợi. Mỗi sợi khuẩn ty bao gồm nhiều đốt nhỏ và mỗi đốt
nhỏ là một tế bào xạ khuẩn [18].
Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 có khả năng hấp thụ các
nguồn cacbohydrat khác nhau. Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi
trường có glucose, sacharose và maltose. Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh
trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất là trong
môi trường có maltose.
1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24
Streptomyces lividans TK24 là một loại vi khuẩn đất gram dương, cấu
trúc dạng sợi. Với hàm lượng G-C cao nên bộ gen của chúng rất bền.
Streptomyces lividans TK24 có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ có
trong đất. Do môi trường sống tự nhiên của chúng và chúng không gây bệnh
nên chúng được sử dụng như máy chủ để trổng hợp và tiết ra protein tương
đồng và dị hợp. Các tế bào Streptomysces lividans TK24 đã được nghiên cứu
để sử dụng trong việc điều khiển hệ gen và điều hòa tăng hiệu xuất sinh tổng
hợp kháng sinh, một số chất là tác nhân chống ung thư [19].

8


Streptomyces lividans TK24 có cấu trúc tuyến tính. Các khu vực lõi
trung tâm chứa các gen cần thiết, trong khi bên ngoài lõi mang gen có điều
kiện thích nghi với DNA của loài ta chuyển gen vào. Không giống như hầu
hết các loài Eubacteria, loài Streptomyces thường chứa nhiễm sắc thể tuyến
tính và plasmid. Các plasmid tuyến tính là dài 12-1700 kb. Với các trình tự
lặp lại đảo ngược trong các telomere, việc nhân rộng plasmid tuyến tính của
Streptomyces bắt đầu ở locus nằm ở trung tâm và tiếp tục hai chiều đối với
các telomere. Điều này để lại một dải đơn dài khoảng 280 nucleotide. Tuy
nhiên, khi các telomere bị xóa, các locus nằm ở trung tâm plasmid tuyến tính
của Strepmyces lividans TK24 cũng có thể duy trì chế độ khép kín. Do đó các
chế độ sao chép và chức năng của Streptomyces lividans TK24 khác nhau đã
được bảo tồn cao [19].
1.3 Kháng sinh Doxorubicin
1.3.1 Giới thiệu chung về Doxorubicin
Doxorubicin (DXR) hay còn được gọi là Hydroxydaunorubicin, là một
trong những kháng sinh quan trọng thuộc nhóm Anthracycline được tạo ra bởi
con đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai của chủng xạ khuẩn Streptomyces
peucetius ATCC27952. Dẫn xuất được sử dụng trong điều trị bệnh u bướu và
ung thư bằng phương pháp hóa trị liệu.
Doxorubicin là kháng sinh có khả năng điều trị các loại bệnh về khối u
cứng, ung thư hệ tạo máu và khối u hệ lympho như ung thư bàng quang, ung
thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu...
Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn
Streptomyces peucetius ATCC27952 đươc phân lập từ tự nhiên. DXR được
tạo ra bằng cách thêm vào cấu trúc của Daunorubicin (DNR) (sản phẩm trao
đổi chất bậc một của chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952,
tiền thân của Doxorubicin) vị trí C14 một nhóm OH. Vì vậy mà DXR còn
được gọi là C14 - Hydroxydaunorubicin.

9


Cũng giống như các kháng sinh khác thuộc nhóm kháng sinh
Anthracycline, DXR hoạt động bằng cách liên kết với phân tử DNA, ức chế
quá trình sinh tổng hơp acid nucleic và sự phân chia của tế bào ung thư nhưng
nó lại có một tác dụng phụ lớn nhất là gây tổn thương cho tim và đe dọa tính
mạng của người sử dụng nếu có tiền sử về bệnh tim.
1.3.2 Cấu trúc của Doxorubicin
- Công thức phân tử: C27H29NO11 .
- Tên khác: C-14 hydroxydaunorubicin .
- Tên thương mại: Doxil, Adriamycin .
- Tên khoa học: (8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methylt-etrahydro2H-pyran-2-yloxy)-6,7,8,11-trihydroxy-8-2-(hydroxyacetyl)-1-methoxy7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione.
- Kích thước: 1.583 × 1.212 (4 KB)
- Khối lượng phân tử: 543.526 đơn vị Cacbon
- Nhiệt độ nóng chảy: 205°C
- Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nước và hexan.

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Doxorubicin

10


1.3.3 Cơ chế hoạt động của Doxorubicin
Doxorubicin tác động vào tế bào ung thư bằng cách tương tác với DNA,
ức chế sự tổng hợp axit nucleic (RNA - quá trình phiên mã) và sự phân chia
của tế bào ung thư [12].
Các enzym DNA Topoisomerase chính là các mục tiêu tác động của
DXR trong sự tiêu diệt tế bào ung thư. DXR thực hiện quá trình ức chế trực
tiếp lên sự hoạt động của các enzym này, làm gián đoạn chức năng đồng thời
thay đổi chức năng tự nhiên của nó tạo ra sự đứt đoạn trong phân tử DNA
cuối cùng dẫn đến các tế bào ung thư bị chết [17].
Trong tế bào ung thư, enzym DNA Topoisomerase được sinh tổng hợp
và biểu hiện với tốc độ rất cao. Sau đó, enzyme này xúc tác cho quá trình sao
chép DNA hay quá trình phân chia tế bào ung thư diễn ra rất nhanh chóng.
Kết quả là số lượng tế bào ung thư sẽ được nhân lên với một số lượng lớn. Do
đó, enym DNA Topoisomerase là mục tiêu của rất nhiều loại thuốc kháng
sinh chống và điều trị ung thư trong đó có cả kháng sinh DXR.
Khi xảy ra sự tương tác với tế bào ung thư, DXR sẽ gây ức chế quá trình
sinh tổng hợp DNA hay quá trình phân chia tế bào ung thư bằng cách phân tử
DXR hình thành mối tương tác xen kẽ giữa các cặp bazơ trong chuỗi DNA ở
trạng thái xoắn kép từ đó ức chế hoạt tính của enzym DNA Topoisomerase II
dẫn đến ức chế quá trình tháo xoắn và mở xoắn của DNA. Ngoài ra, DXR còn
giúp cho quá trình cố định lại phức hệ Topoisomerase II với DNA và sau khi
tháo xoắn kép cho quá trình sinh tổng hợp phân tử DNA đó không có khả
năng đóng xoắn lại hay ghép lại mạch bởi cầu nối photphodieste.
1.4 Giới thiệu về gen drrC
Gen drrC có kích thước 2301bp, là đoạn gen dịch mã ra loại protein
kháng kháng sinh DNR, mã hóa một protein 764-amino-acid, nó giống với

11


một chuỗi trình tự gen UvrA của E. coli liên quan đến việc sửa chữa các DNA
bị hư hại bởi sự hình thành DNR... Do sự tương đồng của gen drrC và gen
UvrA nên mọi nghiên cứu cho thấy gen drrC có khả năng kháng DNR. Vì thế
việc chuyển gen drrC có tác dụng giúp cho Streptomyces lividans TK24 vừa
sản xuất được kháng sinh mà không bị tiêu diệt bởi DXR [11].
1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu
- Tách dòng gen drrC, thiết kế vector pIBR25. drrC và biểu hiện gen
trong xạ khuẩn Streptomyces lividans.
Nội dung nghiên cứu
- Tách dòng gen drrC
- Thiết kế vector biểu hiện pIBR25. drrC
- Biểu hiện gen drrC trong tế bào xạ khuẩn

12


CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Vật liệu
Chủng vi sinh vật
Bảng 2.1: Chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài

Chủng vi sinh vật

Nguồn

E.coli JM 109

USA

Streptomyces peucetius ATCC27952

Hàn Quốc

Streptomyces lividans

Hàn Quốc

Trình tự mồi
Để biểu hiện được gen drrC việc quan trọng đầu tiên đó là thiết kế mồi
biểu hiện gen. Căn cứ vào trình tự đoạn gen drrC đã được xác định từ ngân
hàng gen, tiến hành thiết kế 2 cặp mồi đặc hiệu cho gen drrC. Mồi xuôi drrC1
mang trình tự nhận biết của enzym giới hạn là EcoRI và mồi ngược drrC2
mang tình tự nhận biết của enzym giới hạn là HindIII. Hai enzym này được
dùng để cắt gen cần biểu hiện và chuyển vào vector biểu hiện.
Mồi cho tách dòng và biểu hiện gen drrC.
Mồi xuôi drrC1: 5’-CGGAATTCTCTTCCGTCAATGTGAGGATGCT-3’
EcoRI
Mồi ngược drrC2: 5’-CCCAAGCTTTCAGCGCCGGGCCCGGTGGT-3’
HindIII
Vector
- Vector tách dòng pGEM-T Easy
Vector pGEM-T Easy (3015bp) là vectơ tách dòng được thiết kế với

13


nhiều đặc điểm của một vectơ đa chức năng, có khả năng ứng dụng cao trong
lĩnh vực công nghệ gen. pGEM-T Easy có chứa sẵn các gene: lacZ, ori, f1origin, Ampr. Trong đó ori là những gen có chức năng tái bản trong tế bào vi
khuẩn, lacZ dùng để nhận biết tế bào đã được chuyển gen hay gọi là gen chỉ
thị, Ampr có vai trò là gen kháng kháng sinh ampicillin có tác dụng lựa chọn
các tế bào vi sinh vật có mang vector [9].

Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pGEM-T Easy

- Vector biểu hiện pIBR25
Vector pIBR25 có độ dài khoảng 7.5 kb, vector này được thiết kế có
chứa gen kháng Ampicilin, vùngpromotor emrE* là một vùng khởi động
mạnh nằm phía trước vùng gắn của các enzym giới hạn (MCSs) hay vùng gắn
các gen cần nghiên cứu. Đặc biệt vector này có thể dùng như vector tiếp hợp
bởi có vùng SCP2 (conjugation vector). Vùng này có trình tự nhận biết của
enzyme Transposase, enzym này nhận biết trình tự trên genome và có thể
chuyển cả vector tiếp hợp gắn vào genome của vi khuẩn [25]. Với thiết kế đặc

14


biệt như vây vector pIBR25 có thể sử dụng vô cùng tiện lợi trong các nghiên
cứu chuyển gen bằng tế bào trần hoặc bằng phương pháp tiếp hợp giữa các tế
bào vi khuẩn.

Hình 2.2: Cấu trúc vector biểu hiện pIBR25
2.1.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB lỏng
Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB

Thành phần

1000ml

Trypton

10g

Cao nấm men

5g

NaCl

10g
Thêm nước cất vừa đủ 1000ml

Môi trường LB đặc thì bổ sung thêm 2% (20g/l) agar.
Môi trường NDYE
Đây là môi trường đặc hiệu để nuôi xạ khuẩn tạo kháng sinh. Môi trường
này chứa đầy đủ chất dinh dưỡng và khoáng chất để giúp xạ khuẩn sinh
trưởng, phát triển tạo sản phẩm trao đổi chất, trong đó có kháng sinh mà ta
đang quan tâm.

15


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×