Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tách dòng gene doxa và thiết kế vector pIBR25 DoxAV biểu hiện trong vật chủ xạ khuẩn streptomyces lividans TK24

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
------------***-----------BỘ GIÁO
DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
------------***------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENE DOXA VÀ THIẾT
KẾ VECTOR PIBR25.DOXAV
BIỂU
LUẬN VĂN THẠC
SĨ HIỆN TRONG
VẬT CHỦ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS
TK24

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENNE DOXA, VÀ THIẾT KẾ
HỌC VIÊN: BIỂU
NGUYỄN
NGA VẬT CHỦ XẠ

VECTOR PIBR25.DOXAV
HIỆNTHỊ
TRONG
KHUẨN STREPTPMYCES LIVIDANS TK 24

HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ
HÀ NỘI, 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
------------***------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENE DOXA VÀ THIẾT KẾ VECTOR
PIBR25.DOXAV BIỂU HIỆN TRONG VẬT CHỦ XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES LIVIDANS TK 24

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 60420201
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ NGA
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TẠ THỊ THU THỦY

HÀ NỘI, 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là khóa luận nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kì khóa luận nào khác.
Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2016
Tác giả

Nguyễn Thị Nga

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]




VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này của mình không chỉ là sự cố
gắng hết mình của bản thân, em còn nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình
của của các thầy cô cũng như sự giúp đỡ động viên của gia đình và bạn bè.
Trước tiên em xin trân trọng biết ơn cô giáo TS. Tạ Thị Thu Thủy Trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình
dìu dắt, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc em tới người
thân, và toàn thể các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động
viên, giúp đỡ luôn hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
quá trình học tập và rèn luyện để hoàn thành tốt khoá luận của mình.
Để có những hiểu biết về kiến thức chuyên ngành, em xin chân thành
cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở
Hà Nội đã tạo cho em được môi trường giảng dạy tốt nhất để em có thể hoàn
thành tốt khoá luận của mình.
Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè đã
luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần em trong suốt thời gian thực tập
tốt nghiệp để hoàn thành tốt khoá luận của mình.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều
cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất
mong nhận được những góp ý của quý thầy – cô để bài khóa luận của em
được đầy đủ và hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2016
Học Viên
Nguyễn Thị Nga
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1 Tổng quan về kháng sinh ........................................................................ 3
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ..................................................................... 3
1.1.2 Lịch sử kháng sinh........................................................................... 3
1.1.3 Phân loại kháng sinh ....................................................................... 5
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh ...................................................... 6
1.2

Đại cương về xạ khuẩn ...................................................................... 10

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn ...................................................... 10
1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh trong xạ khuẩn .............................. 10
1.3 Vật chủ biểu hiện xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24..................... 11
1.4. Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin ................................................ 12
1.4.1 Giới thiệu chung về kháng sinh Doxorubicin ................................. 12
1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin.................................................... 13
1.4.3Cấu trúc của Doxorubicin. .............................................................. 14
1.4.4Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin ........................................... 15
1.4.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của Doxorubicin .............. 16
1.4.6 Ứng dụng và thành tựu đạt được về nghiên cứu kháng sinh DXR.. 18
1.5 Giới thiệu chung về gen doxA , dnrV .................................................. 21
1.5.1 Giới thiệu chung về gen doxA ....................................................... 21
1.5.2 Giới thiệu chung về gen dnrV....................................................... 23
1.6 Vector biểu hiện pIBR25 trong hệ xạ khuẩn ........................................ 23
1.7. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm ................................................................. 24
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................. 25
2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường và thiết bị .............................................. 25
2.1.1 Vật liệu .......................................................................................... 25
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

2.1.2 Môi trường ................................................................................... 27
2.1.3 Hóa chất ....................................................................................... 28
2.1.4. Thiết bị ......................................................................................... 31
2.2 Các phương pháp nghiên cứu ............................................................. 31
2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi ............................................................ 31
2.2.2 Phương pháp PCR ....................................................................... 33
2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số của xạ khuẩn. ................... 35
2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose .......................................... 36
2.2.5 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose................................ 36
2.2.6 Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn .................... 37
2.2.7 Phương pháp nối ADN ................................................................ 38
2.2.8 Phương pháp cắt ADN bằng enzyme giới hạn ............................. 38
2.2.9 Phương pháp chuyển gen bằng sốc nhiệt ...................................... 39
2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào Streptomyces lividans TK24 ........ 40
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 41
3.1 Tách dòng gen doxA và dnrV .............................................................. 42
3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ xạ khuẩn S.peucetius ATCC27952 ..... 42
3.1.2 Nhân gen doxA , dnrV bằng phản ứng PCR ................................. 42
3.2.3 Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T.doxAV .......................................... 45
3.3 Giải trình tự và dự đoán chức năng gen qua genbank........................... 48
3.3.1 Giải trình tự gen và dự đoán chức năng doxA: .............................. 48
3.3.2 Giải trình tự gen và dự đoán chức năng dnrV ............................... 49
3.4 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV ........................................... 52
3.5 Tạo chủng tái tổ hợp S.lividans có mang vector pIBRdoxAV ............... 56
PHẦN 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................... 59
4.1. Kết luận ............................................................................................... 60
4.2. Đề xuất ................................................................................................ 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

ADN

Deoxyribonucleic acid

ARN

Ribonucleic Acid

Amp

Ampicillin

bp

Base paire

C

Carbon

Da

Dalton

DNR

Donorubicin

DMSO

Dimethyl sulfoxide

dNTPs

Deoxyribonucleotides

DTT

Dithinotheitol

DXR

Doxorubicin

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IPTG

Isopropyl-thio-β-galactoside

Kb

Kilobase

NDYE

Nitrate-Deniffined

plus

Extract
LB

Luria-Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

Yeast


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong tách chiết.................................................. 29
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng ........................................................................... 31
Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen doxA với các trình tự được công
bố trên ngân hàng gen bằng phần mềm Blast................................................ 49
Bảng 3.2. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen dnrV với các trình tự được công
bố trên ngân hàng gen bằng phần mềm Blast................................................ 51
Bảng 3.4. Thời gian ủ lysozyme để tạo tế bào trần ....................................... 57
Bảng 3.5 Điều kiện thích hợp với nồng độ PEG ........................................... 58
Bảng 36. Khảo sát điều kiện thích hợp với nồng độ kháng sinh.................... 59

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA SAU ĐẠI HỌC

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1.Cơ chế tác dụng của kháng sinh ....................................................... 7
Hình 1.2: Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin ............................. 15
Hình 1.3: Cấu trúc không gian của Daunorubicin và Doxorubicin................ 15
Hình 1.4. Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR .. 16
Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế vector pIBR25.DoxAV ........................................... 24
Hình 2.1: Cấu trúc pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen ................... 26
Hình 2.2: Cấu trúc pIBR25 dùng trong biểu hiện gen ................................... 27
Hình 3.1. Điện di kết quả tách chiết ADN tổng số của chủng xạ khuẩn
Streptomyces peucetius................................................................................. 42
Hình 3.2 Điện di kết quả PCR nhân gen doxAV ........................................... 44
Hình 3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR gen doxAV ........................................... 44
Hình 3.4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp doxAV-pGEM T ........................... 45
Hình 3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp pGEM T.doxAV vào vi khuẩn E. Coli
JM109 .......................................................................................................... 46
Hình 3.6. Tách plasmid từ khuẩn lạc E. coli JM109 trắng ............................ 47
Hình 3.7.

Cắt kiểm tra plasmid các dòng E.coli JM1109 mang pGEM-

T.doxAV ...................................................................................................... 47
Hình 3.1: Trình tự đoạn gen doxA ................................................................ 49
Hình 3.1: Trình tự đoạn gen dnrV................................................................. 51
Hình 3.8: Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV ................... 53
Hình 3.9 Cắt vector pGEM-T.doxA và vector pIBR25 bằng enzyme XbaI và
EcoRI và điện di tren gel agarose 1% ........................................................... 54
Hình 3.10. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid vector pGEM T.doxAV và vector
pIBR25 bằng enzyme XbaI và EcoRI ........................................................... 55
Hình 3.11 Kiểm tra các khuẩn lạc đã được chuyển vector pIBR25 và được cắt
bởi hai enzyme EcoRI/XbaI.......................................................................... 56

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]


MỞ ĐẦU
Bệnh ung thư được coi là một trong những bệnh nan y nguy hiểm được
phát hiện với số ca mắc bệnh ngày càng gia tăng trên thế giới. Theo thống kê
của tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2014 cho thấy tới năm 2035 số lượng
bệnh nhân mới mắc bệnh ung thư đạt 24 triệu người tăng 70% so với năm
2012 là 14,1 triệu người. Nhưng ở một số nước phát triển như Hoa kỳ, theo
thống kê của tổ chức ung thư Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ ca tử vong vì bệnh ung
thư trong hai thập kỷ qua có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000 người
năm 1991 xuống còn 175/100.000 người năm 2010. Điều đó đã chứng tỏ vai
trò vô cùng quan trọng của các chất kháng sinh tham gia vào quá trình điều trị
ung thư.Tuy nhiên, hiện nay kho tàng thuốc kháng sinh ngày càng trở nên hạn
hẹp và khan hiếm. Tốc độ phát triển của các loại kháng sinh kháng các loài vi
sinh vật gây bệnh mới cũng không thể bắt kịp sức tăng trưởng và biến đổi của
các mầm bệnh kháng thuốc. Hiện tượng kháng kháng sinh đã trở thành vấn đề
mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển. Với gánh
nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí có liên quan trong việc
chữa trị đã trở thành gánh nặng lớn với các bệnh nhân. Chính vì vậy, song
song với việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách hợp lí của người bệnh thì
việc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng sản xuất các loại kháng sinh mới
đang là nghĩa vụ và trách nhiệm của các nhà khoa học trên toàn thế giới.
Doxorubicin là kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, được sử dụng trong
điều trị các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ lympho như
ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu... Hiện nay,
kháng sinh này được biết đến bởi các đặc điểm vượt trội của nó như có phổ
tác dụng mạnh và tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp tế
bào ung thư mới.
Doxorubicin là một loại kháng sinh có giá thành rất đắt và hiện nay ở Việt
Nam chưa sản xuất được. Trong con đường sinh tổng hợp tự nhiên của chủng
xạ khuẩn Strepyomyces peucetius thì hàm lượng DNR được tạo ra với hàm
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

1


lượng lớn hơn rất nhiều so với DXR. Một trong những biện pháp tăng sản
lượng kháng sinh DXR đó là thực hiện phản ứng chuyển hóa invitro nhằm
DNR thành DXN. Việc chuyển hóa DNR thành DXR dựa trên sự hoạt động
của Cytochrome P450 Hydroxylase, Putative Ketoreductase. Vì vậy, chúng
tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tách dòng gene doxA, và thiết
kế vector pIBR25.doxAV biểu hiện trong vật chủ xạ khuẩn Streptomyces
lividans TK24” nhằm tạo Cytochrome P450 Hydroxylase, Putative
Ketoreductase tái tổ hợp để thực hiện phản ứng chuyển hóa DNR thành DXR.

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để
dùng trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa :" Kháng sinh là
những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn,
vi nấm), có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi
sinh vật khác", theo Waksman1942.
Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán
tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các
chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật
những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng
sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự
nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự
phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có
tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con
đường cung cấp chung”[3].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml
dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị
kháng sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một
thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm
định trong thời gian xác định[3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI
penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0µg (Hopwood, 2007).
1.1.2 Lịch sử kháng sinh
Kháng sinh được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin cách đây
hơn 70 năm. Nhưng thực tế, từ lâu con người đã biết dùng các chất có tác
dụng chữa trị các bệnh mà sau này được gọi là các chất kháng sinh.

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

3


Giữa thế kỷ 17, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cách
dùng rêu đắp lên vết thương.
Cuối thế kỷ 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa vết
thương. Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì mốc meo trên bánh mỳ
thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn và
lại càng không biết chất kháng sinh là gì.
Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi
nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào
hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn. Hiện tượng kì lạ này đã được
Fleming nghiên cứu, phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là
Penicillium notatum – một chủng tạo penicillin [1][2].
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới
được xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa
liệu pháp kháng sinh.
Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces
griseus. Sau đó đến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc
nhóm macrolide và glycopeptide(tức vancomycin) được phát hiện. Các kháng
sinh tổng hợp như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất
quinolone đã được tạo ra vào năm 1962.
Đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, khi công nghệ sinh học và
hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh
mới. Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở thế
kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ 1980 số
kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển
và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trạng đáng
báo động là ngày càng tăng các vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh
hiện có. Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải được khắc phục bằng việc
phát hiện ra các thuốc mới. Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng nhanh

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

4


kháng thuốc và tốc độ kháng thuốc nhanh hơn cả tốc độ tạo được thuốc mới
của con người [1].
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Việc phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh
mục các kháng sinh do việc tìm ra các kháng sinh ngày càng nhiều. Nhờ đó
tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ
chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh [1].
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác
dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa
học. Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học
nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh [1].
1.1.3.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [1]:
• Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
• Nhóm 2: Các lactone macrolide
• Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
• Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid
• Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
• Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
• Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
• Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
• Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng
1.1.3.2 Phân loại kháng sinh theo cơ chế tác dụng
Dựa vào cơ chế tác dụng, kháng sinh được chia thành 6 nhóm chính như sau:
• Nhóm 1: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của thành tế bào.
• Nhóm 2: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của màng tế bào.
• Nhóm 3: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của Protein của vi khuẩn.
• Nhóm 4: Kháng sinh ức chế sự tổng hợp ADN của vi khuẩn.
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

5


• Nhóm 5: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic.
• Nhóm 6: Kháng sinh ức chế một số quá trình tổng hợp khác.
1.1.3.3

Phân loại kháng sinh dựa vào mức độ tác dụng

Dựa vào mức độ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm sau:
• Nhóm 1: Kháng sinh diệt khuẩn bao gồm những kháng sinh tác dụng
đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp ADN và ARN …
• Nhóm 2: Kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzyme hay các ribosome
30S, 50S và 70S.
1.1.3.4

Phân loại kháng sinh dựa vào phổ tác dụng

Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh được phân thành 5 nhóm sau:
• Nhóm1: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại
hay một nhóm vi khuẩn nào đó.
• Nhóm 2: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng.
• Nhóm 3: Nhóm kháng sinh dùng ngoài.
• Nhóm 4: Nhóm kháng sinh chống lao.
• Nhóm 5: Nhóm kháng sinh chống nấm
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gây bệnh
khác – gọi tắt là mầm bệnh ) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc
điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó, những kiểu tác động
thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều
tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất làm rối loạn hay
làm kiềm tỏa quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản
AND, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các
chuyển hóa trao đổi chất (2).
Cơ chế tác động chủ yếu của kháng sinh:
- Ức chế sự thành lập vách tế bào.
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

6


- Ức chế quá trình trao đổi chất của màng tế bào.
- Ức chế sự tổng hợp protein.
- Ức chế sự tổng hợp của acid nucleic.
- Ức chế sự tổng hợp acid folic

Hình 1.1.Cơ chế tác dụng của kháng sinh [3].
1.1.4.1

Ức chế sự thành lập vách tế bào

Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế làm cho vi khuản Gr(+) biến
thành dạng hình cầu không có vách (proto – plast) còn vi khuẩn Gr (-) có
vách không hoàn chỉnh ( spheroplast) dẫn đến tế bào dễ vỡ ở môi trường có
trương lực bình thường.
Kháng sinh thuộc nhóm này: Bacitracin, cephalosporin, cycloserine,
penicilline, rostocetin, vancomycin.

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

7


Cơ chế: Giai đoạn 1 thuốc gắn vào thụ thể PBPs làm phong bế
Transpeptidase dẫn đến ngăn cản sự tổng hợp peptidoglycan. Mỗi tế bào
thường có 3-6 thụ thể PBP. Những thụ thể khác nhau có ái lực khác nhau đối
với một loại thuốc do đó tác dụng của thuốc cũng khác nhau.Giai đoạn 2 hoạt
hóa các enzym tự tiêu làm ly giải tế bào ở môi trường đẳng trương.
1.1.4.2.

Ức chế quá trình trao đổi chất của màng tế bào

Chức năng của màng tế bào: Màng tế bào là lớp màng bao bọc bên ngoài
tế bào có. Nó tham gia vào quá trình thẩm thấu chọn lọc, vận chuyển chủ
động, kiểm soát các thành phần bên trong màng tế bào.
Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Amphotericin B,
Colistin, Imidazole, Nystatin, Polymycins [3].
Tác dụng: Imidazole làm suy yếu sự toàn vẹn của màng tế bào vi nấm
bằng cách ức chế sụ tổng hợp lipid của màng tế bào. Polymicins tác động lên
vi khuẩn Gr (-). Polyenes tác động lên vi nấm.
1.1.4.3.

Sự ức chế tổng hợp Protein

Quá trình này xảy ra thông qua việc chuyển giao thông tin di truyền đã
được mã hóa trên mARN. Qúa trình tổng hợp protein diễn ra qua ba giai đoạn
là giai đoạn khởi đầu, giai đoạn kéo dài, giai đoạn kết thúc. Các loại kháng
sinh khác nhau sẽ tác động vào quá trình này ở những giai đoạn khác nhau.
Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như:
Tác động vào giai đoạn khởi đầu:
- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome,
ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận
tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào
chuỗi polypeptide mới thành lập.

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

8


- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome
làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi
polypeptide.
Tác động vào giai đoạn kéo dài:
- Tetracyclin ảnh hưởng tới sự gắn tARN mang amino acid vào ribosome ở
tiểu phần 30S của ribosome do đó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào
chuỗi polypeptide đang tổng hợp
1.1.4.4.

Sự ức chế tổng hợp acid nucleic

Các hợp chất có khả năng hoạt động như các tác nhân kháng vi sinh vật
bằng cách can thiệp vào chức năng của các acid nucleic được gọi là các chất
tương tự như acid nucleic. Do có sự giống nhau về mặt cấu trúc của các hợp
chất này với các acid nucleic thông thường cho phép chúng gắn được vào các
phân tử ADN hoặc ARN của các tác nhân gây bệnh, sau đó chúng sẽ làm biến
dạng các phân tử axit nucleic và ngăn ngừa sự sao chép, phiên mã và dịch mã
xảy ra sau đó. Đặc biệt, các chất có cấu tạo tương tự như acid nucleic cũng có
tác dụng lên các tế bào ung thư trong giai đoạn phân chia nhánh [3].
1.1.4.5.

Sự ức chế tổng hợp acid folic

Acid folic là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ
đó tổng nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamides và
trimethoprim là những chất tương tự về mặt cấu trúc và hóa học với các acid
p-aminobenzoic (PABA) và acid folic. Sulfamides đối kháng cạnh tranh với
PABA - một tiền chất để tổng hợp acid folic. PABA kết hợp với acid pteroic
hoặc axit glutamic để tạo PGA, chất này giống như một coenzym trong sự
tổng hợp purin và timin. Do đó khi thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid
nucleic. Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển
hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của acid folic), làm
cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn [3].

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

9


1.2 Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng
hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm.
Tên xạ khuẩn là actinomycete, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia)
và “mykes” (nấm). Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh
trưởng giống với nấm.
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes
(gồm vi khuẩn Gram (+) và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật và vi khuẩn
nhân sơ. Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được
xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [5].
Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu,
axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn
cacbon, muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ.
Khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng
khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số ít
ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25–30 0C. Tuy nhiên, nhiệt
độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng
18–280C. Độ ẩm thích hợp đối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 40 - 50%,
giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn không có giới tính [28]. Xạ
khuẩn có khả năng hình thành enzym và các chất kháng sinh nên được ứng
dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống.
1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh trong xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh.Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới có
trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [5]. Một trong những tính chất của các
chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

10


là có tác dụng chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm vi
sinh vật nhất định. Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ
kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc
điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Có nhiều quan điểm khác nhau về khả
năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:
• Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có
lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự
phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó.
• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho
khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất
là các loài có bào tử. Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh
vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo
một số con đường nhất định.
Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất
như Chloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleoside. Chất
kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau
như lincomycin, novobiocin. Chất kháng sinh được hình thành bằng con
đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các
phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình
sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài
các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu
trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor[6].
1.3 Vật chủ biểu hiện xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24
Cấu trúc và vai trò của Streptomyces lividans TK24
Streptomyces lividans TK24 là một vi khuẩn đất gram dương, cấu trúc
dạng sợi. Với hàm lượng G - C cao nên bộ gen của chúng rất bền. Do môi
trường sống tự nhiên của chúng, cùng với các tác nhân không gây bệnh của
NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

11


các loài trong chi này, S. lividans TK24 được sử dụng như máy chủ để tổng
hợp và tiết ra protein tương đồng và dị hợp [10].
Ứng dụng công nghệ sinh học
Streptomyces lividans TK24 sản xuất một số lượng lớn các protein, nó
đã được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất và bài tiết của các protein trong
công nghiệp. Các chi Streptomyces là vi khuẩn dạng sợi sống trong đất, và
môi trường sống tự nhiên của nó đã cho phép họ sản xuất hầu hết các loại
kháng sinh được biết đến từ tự nhiên, cũng như nhiều chất chuyển hóa thứ cấp
khác và các enzym quan trọng để sử dụng trong kinh tế và công nghiệp.
1.4
1.4.1

Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin
Giới thiệu chung về kháng sinh Doxorubicin
Doxorubicin hay còn được gọi là Hydroxydaunorubicin, là một trong

những kháng sinh quan trọng thuộc nhóm Anthracycline được tạo ra bởi con
đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai của chủng xạ khuẩn Streptomyces
peucetius ATCC27952. Dẫn xuất được sử dụng trong điều trị bệnh u bướu và
ung thư bằng phương pháp hóa trị liệu.
Doxorubicin là kháng sinh có khả năng điều trị các loại bệnh về khối u
cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ Lympho như ung thư bàng quang, ung
thư vú, ung thư cổ tử cung , ung thư máu......
Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn
Streptomyces peucetius ATCC27952 đươc phân lập từ tự nhiên. DXR được
tạo ra bằng cách thêm vào cấu trúc của DNR (sản phẩm trao đổi chất bậc một
của chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952, tiền thân của
Doxorubicin) vị trí C14 một nhóm OH.Vì vậy mà DXR còn được gọi là C14 Hydroxydaunorubicin.
Cũng giống như các kháng sinh khác thuộc nhóm kháng sinh
Anthracycline, DXR hoạt động bằng cách liên kết với phân tử ADN, ức chế
quá trình sinh tổng hơp acid nucleic và sự phân chia của tế bào ung thư nhưng

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

12


nó lại có một tác dụng phụ lớn nhất là gây tổn thương cho tim và đe dọa tính
mạng của người sử dụng nếu có tiền sử về bệnh tim [16].
1.4.2

Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin
Trong những năm 1960, một công ty nghiên cứu ở Italia - Farmitalia

Research Laboratories, tổ chức này đã thực hiện tìm kiếm các hợp chất chống
ung thư từ vi khuẩn đất trên quy mô phòng thí nghiệm. Họ đã tiến hành phân
lập từ các mẫu đất xung quanh lâu đài Castel Del Monte bằng sự lỗ lực cố
gắng họ đã phát hiện ra một chủng xạ khuẩn.Chủng xạ khuẩn này đã tạo ra
một hợp chất có sắc tố đỏ và có hoạt tính chống lại các khối u ở chuột rất tốt.
Chủng xạ khuẩn này chính là Streptomyces peucetius [15].
Cùng thời gian đó, một nhóm nghiên cứu ở pháp đã phát hiện ra một
hợp chất tương tự cũng có màu sắc đỏ và sau này khi kháng sinh được tách
chiết thì đặt tên cho chất màu đỏ này là Daunorubicin. " Daunorubicin " là
tên hợp nhất của hai từ Dauni và Rubis (Rubi), Dauni là tên của bộ lạc trước
thời kỳ La Mã sinh sống và chiếm đóng vùng đất đã phân lập được chủng xạ
khuẩn sản xuất được chất kháng sinh này, còn Rubis là tiếng Pháp mô tả
màu sắc [15].
Những năm 1960, bắt đầu thử nghiệm lâm sàng loại kháng sinh này và
đã thành công trong việc điều trị bệnh bạch cầu cấp tính và ung thư hạch.
Tuy nhiên, năm 1967 Daunorubicin được công nhận có tác dụng phụ lớn
nhất là gây ra độc tính trên tim và gây tử vong cho con người [16].
Năm 1969, Arcamone F cùng với các cộng sự đã tiến hành biến đổi một
chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ chủng Streptomyces peucetius bằng cách sử
dụng N - nitroso - N- methyl urethane, kết quả là tạo ra một chủng đột biến
mới và đặt tên là Streptomyces peucetius phân loài Casius ATCC27952 có
khả năng sản xuất ra một kháng sinh cũng có màu đỏ như DNR và họ đặt tên
chất này là Adrimycin , sau đó được thay đổi tên thành DXR để phù hợp với
quy ước đặt tên của quốc tế [17] [18].

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

13


Trong bài báo cáo khoa học lần thứ 53 của Di Manrco A, Gactani M,
Scarpinato B năm 1969 đã chỉ ra rằng DXR có tác dụng chống lại các khối u
chuột đặc biệt là u cứng tốt hơn hẳn so với DNR và có chỉ số điều trị cao hơn
nhưng tác động phụ tới tim vẫn còn tồn tại [19].
Năm 1996, nhóm Strohl đã phát hiện ra gene DoxA - gen mã hóa các
enzyme có thể chuyển đổi DNR thành DXR [20].
Năm 1999, nhóm Strohl sản xuất tái tổ hợp được gen DoxA là một
oxydaza Cytochrome P- 450, gen này tham gia xúc tác nhiều bước trong quá
trình sinh tổng hợp DXR bao gồm cả các bước sản xuất DNR [21]. Bằng đột
biến ba gen với sự có mặt của DoxA đã làm tăng từ 36%-86% năng suất sinh
tổng hợp Doxorubicin [18].
1.4.3

Cấu trúc của Doxorubicin.

• Công thức phân tử: C27H29NO11 .
• Tên khác: C-14 hydroxydaunorubicin.
• Tên thương mại: Doxil, Adriamycin.
• Tên khoa học: (8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methylt-etrahydro2H-pyran-2-yloxy)-6,7,8,11-trihydroxy-8-2-(hydroxyacetyl)-1methoxy-7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione.
• Kích thước: 1.583 × 1.212 (4 KB)
• Khối lượng phân tử: 543.526 đơn vị Cacbon
• Nhiệt độ nóng chảy: 205oC
• Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nước và hexan.

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

14


Hình 1.2: Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin
1.4.4 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin
Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn được
phân lập trong tự nhiên là Strepyomyces peucetius. Chủng xạ khuẩn này tạo ra
sản phẩm đầu tiên là DNR. Khi có một nhóm OH được gắn vào vị trí C-14
của DNR thì hình thành sản phẩm bậc hai, đó chính là Doxorubicin.

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của Daunorubicin và Doxorubicin
Theo nhiều chứng minh cho thấy rằng, DXR có hoạt tính mạnh hơn và
ưu việt hơn so với DNR nhưng nếu tuân theo con đường sinh tổng hợp tự
nhiên của chủng xạ khuẩn trên thì hàm lượng DNR được tạo ra với hàm
lượng lớn hơn rất nhiều so với DXR.

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

15


dnmL dnmM N
doxA

V

U G H dnmT dnrH dnrE

SN

Gene

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

dnmL
dnmM
dnrN
dnrO
dnrF
drrA
drrB
drrD
dnrX
dpsY
dnmZ
dnmU
dnmV
dnmJ
dnrI
doxA
dnrV
dnrU

F

O

dnrF drrA drrB

E dnrG A

B

C

drrD
D

X

dpsY dnmZ dnmU dnmVdnmJ

C D dnrK dnrP Q

S

I
drrC

dps (PKS)

regulatory

resistance (drr)

deoxysugar (dnm)

oxidation

cyclase

dxr modifying

glycosyltransferase

O-methylation

esterase

reduction

unspecified function

Proposed function

SN Gene

Proposed function

glucose-1-phosphate thymidylyltransferase
TDP-glucose-4,6-dehydratase
pseudo response regulator gene
repressor gene
aklavinone C-11 hydroxylase
resistance gene
resistance gene
resistance gene
putative doxorubicin modifying enzyme
polyketide cyclase (3 rd cyclase)
putative flavoprotein
3,5-epimerase
4-ketoreductase
C-3 aminotransferase
regulatory gene
daunorubicin C-14 hydroxylase
putative ketoreductase
daunorubicin C-13 ketoreductae

19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37

ACP for minPKS
daunorubicin biosynthesis enzyme
putative 2,3-dehydratase
putative baumycin biosynthesis enzyme
aklaviketone reductase
polyketide cyclase (1 st cyclase)
C-9 ketoreductase
oxygenase
3-oxoacyl: ACP synthase
ketosynthase
ketosynthase (propionate starter unit)
acyltransferase, PKS
methyltransferase
methylaklanonic acid cyclase
carminomycin-O-methyltransferase
esterase
glycosyltransferase helping gene
glycosyltransferase
resistance gene

dpsG
dpsH
dnmT
dnrH
dnrE
dpsF
dpsE
dnrG
dpsA
dpsB
dpsC
dpsD
dnrC
dnrD
dnrK
dnrP
dnrQ
dnrS
drrC

Hình 1.4. Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
kháng sinh DXR [32].
1.4.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của Doxorubicin
Doxorubicin tác động vào tế bào ung thư bằng cách tương tác với ADN,
ức chế sự tổng hợp axit nucleic (ARN - quá trình phiên mã) và sự phân chia
của tế bào ung thư [21] [22].
Các enzyme ADN Topoisomerase chính là các mục tiêu tác động của
DXR trong sự tiêu diệt tế bào ung thư. DXR thực hiện quá trình ức chế trực
tiếp lên sự hoạt động của các enzyme này, làm gián đoạn chức năng đồng thời
thay đổi chức năng tự nhiên của nó tạo ra sự đứt đoạn trong phân tử ADN
cuối cùng dẫn đến các tế bào ung thư bị chết [25].
1.4.5.1 Enzyme ADN Topoisomarse
Lịch sử: Enzyme ADN Topoisomerase do James C. Wang là nhà sinh
học người Mĩ gốc Trung Quốc phát hiện ra và đề xuất cơ chế hoạt động của
chúng trong những năm 1970 [10].
Chức năng: Xúc tác và điều khiển quá trình tháo xoắn hoặc mở nút bằng
cách phá vỡ sự liên kết một đoạn ngắn trên phân tử ADN [23].

NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016]

16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×