Tải bản đầy đủ

Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các Enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp βcarotene trong vi khuẩn Escherichia coli. (Khóa luận tốt nghiệp)

I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM
--------------

TÀI:
THI T K VECTOR BI U HI N CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC
NG SINH T NG H P - carotene
TRONG VI KHU N Escherichia coli

KHÓA LU N T T NGHI

H

o

IH C

: Chính quy

Ngành


: Công ngh sinh h c

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa h c

: 2011-2015

Thái Nguyên, 2015


I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM

--------------

TÀI

THI T K VECTOR BI U HI N CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC
NG SINH T NG H P - carotene
TRONG VI KHU N Escherichia coli

KHÓA LU N T T NGHI
H

o

IH C

: Chính quy

Ngành

: Công ngh sinh h c

L p

: 43-CNSH



Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa h c

: 2011-2015

Gi

ng d n: 1 .
2. ThS. Ma Th Trang

Thái Nguyên, 2015

ng


L IC

Trong quá trình h c t p và nghiên c

hoàn thành khóa lu n t t nghi p

ngoài s n l c, c g ng c a b n thân
b

cs

ng viên c a th y cô, b
Tôi xin bày t lòng bi

t

p hoàn thành khóa lu n:
c t i Th

ng d n ch b o, gi
il ic

nghi m công ngh gen

ng d n, ch

c m c và c ng c ki n th c cho tôi.
i Th.S Ma Th Trang, cán b phòng thí

c ti p ch b

c, t o m

u ki n t t nh

tôi h c t p và nghiên c u.
y cô trong khoa Công ngh sinh h c Công
ngh th c ph

o và d y d tôi trong su t th i gian qua.

Cu i cùng tôi xin g i l i c
ng viên, chia s

i thân và b

nh

c t p nghiên c u.
Thái Nguyên, tháng 06
Sinh viên

5


Amp

: Ampicillin

Bp

: Base pair C

CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

Cs

: C ng s

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic acit

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Laria Broth

NCBI

: Nation Cetrer for Biotechnology Information

PCR

: Polymerase Chain Recation

S. chromofuscus

: Streptomyces chromofuscus

TAE

: Tris-acetate-EDTA

UV

: Ultraviolet

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indoly- -D-galactoside

ROS

: Reactive Oxygen Species

RNS

: Reactive Nitrogen Species


Trang

B

ng carotenoid có trong th c v t........................................ 15

B ng 3.1: Các thành ph n c a vector pRSET-A............................................. 27
B ng 3.2: Các thành ph n c a vector pET22b(+)........................................... 28
B ng 3.3: Danh m c các thi t b s d

tài.................................... 31

B ng 3.4: Thành ph n ph n ng c t v i EcoRI và HindIII ............................ 36
B ng 3.5: Thành ph n ph n ng c t v i KpnI và EcoRI ................................ 36
B ng 3.6: Thành ph n ph n ng c t v i EcoRI và XbaI ................................ 37
B ng 3.7: Thành ph n ph n ng g n n i ........................................................ 39


Trang
Hình 2.1: Công th c c u t o c a -carotene...............................................................4
chuy n hóa -carotene thành vitamin A...........................................6
Hình 2.3: Bi

kh o sát th

ki

....9

Hình 2.4: Sinh t ng h

ng MAV .............................11

Hình 2.5: Sinh t ng h

ng MEP ..............................12

Hình 2.6: Quá trình sinh t ng h p carotenoids t IPP và DMAPP ..........................13
Hình 2.7: Quá trình chuy n hóa phyopene thành lycopene.......................................13
Hình 2.8: T ng h p -carotene t lycopene .............................................................14
t ng h p - carotene c a BASF .....................................................16
t ng h p -carotene c a Roche....................................................17
Hình 2.11: Quá trình chuy n hóa -carotene

i s tham gia các gene Crt...........19

ki m soát s phiên mã c a T7 promoter.....................................20
h th ng vector bi u hi n pRSET.................................................22
h th ng vector bi u hi n pET......................................................22
a protein tái t h p ch a 6xHis và giá th Niken.............23
Hình 3.1: C u trúc vector bi u hi n pRSET .............................................................26
Hình 3.2: C u trúc vector bi u hi n pET22b(+).........................................................28
Hình 3.3: Quy trình thi t k vector pR-iEIBY..........................................................33
Hình 3.4: Quy trình thi t k vector pET22iEIBY. .....................................................34
Hình 4.1: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pR-iEIY ................................41

Hình 4.2: K t qu

n di s n ph m c t ki m tra s có m t c a gene crtY...............42

Hình 4.3: Hình minh h
Hình 4.4: K t qu

ki m tra chi u g n gen crtY trên vector pR-iEIY..........43

n di s n ph m c t ki m tra chi u g n gene crtY trên pRiEIY ..........44

Hình 4.5: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pR-iEIBY .............................45

Hình 4.6: K t qu

n di s n ph m c t ki m tra s có m t c a gene crtB ..............46

Hình 4.7: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pET22-Y ................................47

Hình 4.8: K t qu

n di ch n l c dòng pET22-Y v i enzyme EcoRI.....................47


Hình 4.9: Hình minh h

ki m tra chi u g n gen crtY trên vector pET22-Y........48

Hình 4.10:K t qu

n di ki m tra chi u g n crtY trên vector pET22-Y..................49

Hình 4.11: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pET22-iEIBY ......................49

Hình 4.12: K t qu
Hình 4.13: Hình minh h
Hình 4.14: K t qu

n di ch n l c dòng pET-iEIBY v i enzyme XbaI và EcoRI .........50
ki m tra chi u g n c m gene iEIB trên vector pET22iEIBY .......51
n di ki m tra chi u g n c m iEIB trên vector pET22-iEIBY..........52

Hình 4.15: K t qu bi u hi n vector pR-iEIBY trong ch ng E. coli BL21 (DE3)...53
Hình 4.16: K t qu bi u hi n vector pET22iEIBY trong ch ng E. coli BL21 (DE3) ....54
Hình 4.17: K t qu so sánh so sánh bi u hi n c a hai h vector pRSET-A và pET22b(+)...55


C
PH N 1 M
tv

U .....................................................................................................1
.............................................................................................................1

1.2 M

u.............................................................................................3

1.3 M c tiêu nghiên c u..............................................................................................3
tài..................................................................................................3
c ...............................................................................................3
c ti n ................................................................................................3
PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U ..........................................................................4
2.1 Khái quát v s c t

-carotene..............................................................................4

2.1.1 C u trúc và tính ch t lý hóa................................................................................4
2.1.2 Vai trò c a s c t

-carotene v

2.1.2.1 Vai trò c a -carotene
2.1.2.2

i......................................................5

i v i s c kh

i........................................5

ng d ng c a -carotene trong công nghi p..................................................8
ng t ng h p -carotene ......................................................................10

2.1.4 Ngu n cung c p -carotene .............................................................................14
2.1.4.1 Ngu n cung t th c v t.................................................................................14
2.1.4.2 Ngu n cung t vi sinh v t .............................................................................15
2.1.4.3 Ngu n cung t t ng h p hóa h c ..................................................................16
2.1.5

ng d ng công ngh DNA tái t h p vào s n xu t -carotene t nhiên ........18

2.2 Vi khu n E.coli và các h vector bi u hi n trong s n xu t protein tái t h p. ...19
m c a vi khu n E. coli trong s n xu t protein tái t h p .....................19
2.2.2 M t s h th ng vector bi u hi n trong vi khu n E. coli .................................21
2.3 Tình hình nghiên c

c .........................................................23

2.3.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i...................................................................23
2.3.2 Tình hình nghiên c
Ph n 3 V T LI U, N

c.....................................................................25
U ...........26

3.1 V t li u nghiên c u .............................................................................................26
3.1.1 Vi khu n ...........................................................................................................26
3.1.2 V t li u .............................................................................................................26
3.1.2.1 Enzyme..........................................................................................................26


3.1.2.2 Vector ............................................................................................................26
3.1.3 Hóa ch t ...........................................................................................................29
3.1.4 D ng c ............................................................................................................31
3.1.5 Thi t b .............................................................................................................31
3.1.6 Ph m vi nghiên c u..........................................................................................31
m và th i gian nghiên c u .......................................................................32
3.3 N i dung nghiên c u ...........................................................................................32
u.....................................................................................33
t k in silico..........................................................................34
pb

gi i h n.....................................................................35

n di DNA trong gel agarose ..................................................37
n DNA t gel agarose ....................................................38
n gen mong mu n lên vector bi u hi n .........................38
n b t bào E. coli kh bi n .................................................39
n n p DNA plasmid vào t bào kh bi n b ng s c nhi t ......39
t DNA plasmid.............................................................40
Ph n 4 K T QU VÀ TH O LU N....................................................................41
4.1. Thi t k vector bi u hi n mang policistron g m 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên
n n t ng vector bi u hi n pRSET-A t o vector tái t h p pR-iEIBY. ...........................41
4.1.1. K t qu g n gene crtY vào vector pR-iEI t o vector tái t h p pR-iEIY.......41
4.1.2. K t qu g n gene crtB vào vector pR-iEIY t o vector tái t h p pR-iEIBY....45
4.2 Thi t k vector bi u hi n mang policistron g m 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên n n
t ng vector bi u hi n pET22b(+) t o vector tái t h p pET22-iEIBY. ...............................46
4.2.1 K t qu g n gene crtY vào vector pET22b(+) t o vector tái t h p pET22-Y.....46
4.2.2 K t qu g n c m gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y t o vector tái t h p
pET22-iEIBY...............................................................................................................49
4.3. K t qu ki m tra s ho

ng c a các gene......................................................52

Ph n 5 K T LU N VÀ KI N NGH ...................................................................56
5.1. K t lu n ..............................................................................................................56
5.2 Ki n ngh .............................................................................................................56
TÀI LI U THAM KH O ......................................................................................57


N1
U

Carotenoid là m t d ng s c t t nhiên xu t hi n ch y u
loài sinh v t quang h

th c v t và các

m, t o và m t vài lo i vi khu n (Schmidt-

Dannert, 2000) [57]. Chúng có vai trò hình thành màu s c cho cây, che ch n ánh
sáng (Vershinin, 1999) [70] và có kh

ng oxy hóa m nh (Stahl and Sies,

2003) [63]. Ngày nay có kho ng 600 lo
s

n thi t cho ch

c tìm th y và 40 lo i trong

ng c

i (Rao and Rao, 2007) [52].

-carotene là s c t có màu vàng ho c da cam, thu c nhóm carotenoid. Chúng
c tìm th y

m t s lo

u hà lan (Desobry, Netto

et al. 1998) [18]. -carotene

c bi

t ti n ch

t ng h p vitamin A

m t lo i vitamin r t c n thi t cho m t (Lampert, Holzschuh et al. 2003; Stutz,
Bresgen et al. 2015) [35, 65]. Theo t ch c WHO và FAO m

u

tr em b m c các b nh v m t mà nguyên nhân ch y u là thi u provitamin A trong
kh u ph

(Harjes, Rocheford et al. 2008) [26].

d ng trong su

ng v t, -carotene

ng, chúng tham gia vào m t lo t các quá trình

sinh lý, sinh s n, phát tri n bi u bì c a mô, c
mi n d ch (Sklan, 1987) [60]. Nhi u nghiên c
d

cs

ng kh
ra r ng -carotene có tác

a quá trình oxy hóa b ng cách lo i b các g c oxy t

b ov t

a quá trình phát tri n c a t

nh tim

m ch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al. 2015) [29].
u s d ng -carotene

Trong nh
th ng kê c a công ty nghiên c u th

ng BCC, th

t 1,2

t
c u s d ng -carotene chi m t tr ng cao nh t v i 262 tri u USD (chi m 21,8%)
im
2018 s
carotene

ng bình quân h
u USD (BCC 2011) [11].

c s n xu

ng chính: M

ki
ng nhu c

-

ng t ng h p hóa


h c, hai là chi t xu t t các ngu n có s n trong t nhiên (Bernardo Dias Ribeiro,
Daniel Weingart Barreto et al. 2011, Vachali, Bhosale et al. 2012) [12, 69]. S n
ph m -carotene t ng h p hóa h c ch có ch

ng phân duy nh

-carotene t nhiên không nh ng có ch a -carotene mà c

-carotene

-carotene t nhiên có ho t tính sinh h

i t ng

h p hóa h c (Voutilainen, Nurmi et al. 2006; Baky. and El-Baroty. 2013) [71, 9].
n ph m -carotene t

Bên c

công nghi p thì ngu n cung -carotene t

m

m là ph

thu c th i v , ph c t p trong xây d ng và qu n lý vùng nguyên li u. V

t ra

t o ngu n cung -carotene t nhiên.

là c n ph

Cùng v i s phát tri n c a khoa h c công ngh nói chung và công ngh sinh
h c nói riêng, vi c ng d ng công ngh DNA tái t h p cùng v i ng d ng
thu t di truy

i quy

vi sinh v t có kh
carotene

c các v

nêu trên. Các nghiên c u v t o ch ng

n sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình t ng h p c nh ng thành công nh

c ng s t o ch ng sinh v t có kh

nh

0, Misawa và

ng h

u tiên

trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al.
1991) [45]

Escherichia coli (Lee, Momen et al. 2003) [36].

S bi u hi n c a các gene liên quan t i m t lo t các y u t
promoter, ch ng ch ; và các

H vector,

ch phiên mã, d ch mã và sau d ch mã (Jana and

Deb 2005) [32]. Vector là m t trong nh

c quan tâm t i, theo

lý thuy t m t h vector có s b n sao cao s làm

t n s mRNA

su t bi u hi n protein tái t h p (Camps 2010) [15]. Tuy nhiên, s

ng b n sao

cao li u có ph i là t t nh t? Theo nghiên c u c a Jones KL và c ng s , m t vài h
vector có s b n sao th

u hi n

ho c có ph n t t

i m t h vector có s b n sao cao (Jones, Kim et al. 2000) [33]. Bên c nh
, v trí ti

t y u t quan tr ng. N

có th tr nên không tan khi

m

t ng h p cao, d

i trong t bào ch t nó
n s hình thành các th

vùi. Vi c thu h i protein có ho t tính sinh h c t nh ng th vùi này là r t khó


(Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay et al. 2015) [6]. Nh m gi i quy t v
ngày nay protein tái t h p s

này,

c g n thêm m t chu i tín hi u ti t b

m t trình t mã hóa cho chu i tín hi
c nh n bi t b i h th ng ti

u hi n. Chu i tín hi u này
c v n chuy n t

Hi n nay, vi c s n xu t các h p ch t carotenoid

Vi t Nam v n còn m t v n

m i, các nghiên c u m i ch d ng l i

vi c tách chi t t th c v t và phân l p

các ch ng vi sinh v t s n xu t -carotene

quy mô nh . Vi c s d ng các h p ch t

-carotene

Vi t Nam ch y u do nh p kh u t

phát t nhu c u th c ti n, tôi th c hi

c ngoài v i giá thành cao. Xu t
Thi t k vector bi u hi n các gene

mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh t ng h p -carotene trong vi
khu n Escherichia coli

h mm

p v t li u cho các nghiên c u t o

n xu t -carotene tái t h p.

ch ng vi sinh v t có kh

Thi t k thành công vector bi u hi n các gene mã hóa cho các enzyme liên
n quá trình sinh t ng h p -carotene trong vi khu n Escherichia coli.
Ki m tra

t bi u hi n -carotene trong

ng c a s b n copy t

vi khu n E. Coli.

- N i dung 1: Thi t k vector bi u hi n mang polycistron ch a 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên n n t ng vector pRSET-A.
- N i dung 2: Thi t k vector bi u hi n mang polycistron ch a 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên n n t ng vector pET22b(+).

K t qu c

tài là ti

cho các nghiên c u v bi u hi n -carotene trong

E. coli sau này.

S n ph m c a nghiên c u m
carotene m i, rút ng n th i gian s n xu

ng nghiên c u ng d ng s n xu t ng nhu c u th c ti n.


2

2.1
2.1.1

-carotene
ý hóa
Carotenoid là nhóm s c t t

c tìm th y ch y u trong các loài th c

v t,

, bao g m 65-70 s c t t nhiên và là m t

trong nh ng h p ch t màu quan tr ng nh
ph

c s d ng trong công nghi p th c

c ph m, m ph m.

c chia làm hai nhóm: Th nh t
-carotene, torulen và nhóm còn l i là

astaxantin. Hi

xantophyl b
c u r ng rãi, tiêu bi

ik

c nghiên
n -carotene.

C u trúc: -carotene là m t trong s

c tìn th y

trong t nhiên. Chúng là m t d n xu t isoprene

bao g m 40 nguyên t

cacbon và 56 nguyên t hydro (C40H56) -carotene có d ng tinh th hình kim, trong
c u trúc có các n

t o nên m t chu i polyen (hình 2.1).

Hình 2.1: Công th c c u t o c a -carotene

Tính ch t lý hóa: -carotene là h p ch t có màu vàng cam, tan t t trong d u và
các dung môi h

-

c.

p dài mà -carotene có ái l c m nh v

i

ng phân hóa khi ti p xúc v i không khí, ánh sáng hay nhi

.

Nh có h th ng n
nên d b oxy

l i

(Goodwin 1980) [23].


2.

-carotene
-carotene
Hi n nay, -carotene

tác d ng h u ích c
c bi

c các nhà khoa h

c bi t quan tâm nghiên c u b i
i (Nagao 2009) [48]. -carotene

i v i s c kh

n ch t vitamin A r t c n thi t cho m t (Lampert, Holzschuh et

al. 2003) [35], bên c
ng a m t s b

ng oxy hóa m
.

Vai trò là ch t ch ng oxy hóa
G c t do là nh ng phân t b thi u h

n tích. Các g c t

không cân b ng và r t d ph n ng. Chúng luôn tìm cách chi
phân t khác, các phân t b m
t

Ch t oxy hóa tiêu bi

c g i là ch t oxy hóa.

c phát hi n là ROS. ROS là m t s n ph m ph

c a quá trình hô h

cao

n t t các

n tích s l i tr thành nh ng g c t do m i. Quá

c g i là quá trính oxy hóa và g c t

thích sinh ra do các tác

ng

i ch

ng th

ng c
gây t

c kích

tia UV hay ti p xúc v i nhi
t bào và các phân t sinh h

protein (Adetayo O. Omoni and Aluko 2005) [4]. Theo nhi u nghiên c

ra

quá m c là nguyên nhân gây ra các b nh thoái
nh mãn tính, b nh tim m ch. Các
ch t ch ng oxy hóa là các ch t
Chúng
et al. 2003) [25]

n ho c làm ch m quá trình oxy hóa.

y này b ng cách kh

c t do (Guerin, Huntley

c ch ng minh là ch t ch ng oxy hóa sinh h c,

b o v t bào và mô t các tác h i c a các g c t do (Maiani, Caston et al. 2009) [42].
Trong carotenoid, -carotene có hi u qu trong vi c b o v màng lipid c a t bào
kh i tác h i c a các g c t do (Britton 1995) [14], bên c

im ts

i b oxy t t nh t, lutein và
zeaxanthin có hi u qu trong vi c lo i b các g c t
bào (Smith 1998) [61].

nc at


Ti n ch t vitamin A
-carotene

c bi

n v i tên g i là ti n ch t vitamin A (Lampert,
, -carotene b phân c t

Holzschuh et al. 2003) [35]
cacbon trung tâm t o thành hai phân t

retinal b

(Biesalski, Chichili et al. 2007) [13]. Retinal ti p t
thành retinol. Retinol t o thành có th
ru t hay s

c chuy n hóa b i enzyme

c h p thu tr c ti p t th

c v n chuy n nh liên k t v

n thi t ho c

id

c n, retinyl este

c th y phân thành retinol t do và acid h
th

gi a m ch

c h p th . Quá trình

c enzyme d ch t y xúc tác, axit h

ng là acid

palmitat chi m thành ph n ch y u trong retinyl este th c ph m. Quá trình chuy n hóa
-carotene

c ki m soát ch t ch nên không t

n

ng v t c n -carotene trong su t quá

th

ng c a mình, song b n thân chúng l i không có kh
mà ch y u thu nh

Hình 2.2

ng h

ng tiêu hóa (Fujisawa, Watanabe et al. 2008) [21].

chuy n hóa -carotene thành vitamin A

c


ng th giác
Trong máu phân t

i d ng retinol s chuy n hóa thành retinal.

Trong bóng t i, retinal k t h p v
t nh y c m v i ánh sáng

t o thành Rhodopsin

võng m c m t, giúp võng m c nh

u ki n thi

m ts c

c các hình nh
i b phân h y thành

opsin và trans-retinal, r i tran[72]. Bên c

tr l i cis-retinol (Wolf 2001)
ra r ng -carotene có kh

t s nghiên c

làm ch m s ti n tri n c a b

m vàng làm gi m thi

mù lòa (Snodderly 1995; Gordon and Schooff 2002) [62, 24]. Vi c thi u h t
vitamin A gây ra m t lo

iv

ng

nhi u nh t là m t. M t trong nh ng bi u hi

u tiên là s suy gi m th l

nh quáng gà (kh

m m

n

chi u sáng th p)

(Roncone 2006) [56].
Gi m thi u các b nh v tim m ch
Theo WHO, b nh tim m

guyên nhân t

u

trên toàn th gi i và chi m nhi u nh t
ch t do b

t qu nhi

n. M

i
i

t rét và HIV c ng l i

(Moran, Forouzanfar et al. 2014) [47]

ca t vong do các b nh tim

m ch là 13,3 tri u ca chi

u

i chi m 31,5% t ng s ca t vong trên toàn th gi i (Mendis, Shanthi; et al.
2014) [44]. B nh tim m ch bao g m các b
m ch vành và nh
do s

ng m

(GBD 2015) [22]. B nh tim m

c hình thành

u s n ph m oxy hóa gây nên (Singh, Dhalla et al. 1995) [59],

c bi t là quá trình oxy hóa lipoprotein t tr ng th p (LDL) do ROS d
thành các m ng bám trên thành m
2000) [19].

ng

n hình

a thành m ch (Dhalla, Temsah et al.

ng chính c a -carotene t i các b nh tim m ch là ch ng l i quá

trình oxy hóa, do -carotene

c v n chuy n trong các lipoprotein t tr ng th p

tr c ti p c ch quá trình oxy hóa c a LDL (Reaven, Ferguson


et al. 1994) [53]. Chính vì th
ph m giàu carotene

ng khuy n các s d ng các th c

phòng ng a và ch a tr các b nh v tim m ch.

ab
Oxy là y u t không th thi
t

i v i cu c s ng. Khi các t bào s d ng oxy

ng, các s n ph m ph

ct

t h qu c a ATP

(adenosine triphosphate) s n xu t b i các ty th và l p th . Nh ng s n ph m ph
ng là ch

n ng (RNS).

vai trò kép v a có l i, v a có h

i v i có th .

m

t
th p ho c trung bình,

ROS và RNS phát huy tác d ng có l i trên các ph n ng c a t bào và ch
mi n d ch.

n

cao, chúng t o ra s

ng oxy hóa có th làm h ng t t

c các c u trúc t bào gây nên các sai h ng (Young and Woodside 2001, Lien Ai
Pham-Huy, Hua He et al. 2008) [76, 39]. Nh
t bào ho c m t nhóm t bào d

ns

kh i U (Cooper GM 1992) [16]. -carotene
u khi

t bi

ng c a t

m t

m soát hình thành các
ng m nh m vào t
u hòa bi u hi

lên các t bào mi n d ch, h n ch các sai khác b

ng

ng d n t i s phát tri n

-carotene

không ng ng c a t
ng: M

ng x y ra

ng vào quá trình oxy hóa t bào do tính ch t ch ng oxy

hóa m nh, hai là chúng tham gia vào quá trình bi t hóa và phân chia t bào (Heller,
Descamps et al. 1998) [27].
2.1.2.2
-carotene
-carotene có tính ch ng oxy hóa m
ng a b

.
ng h mi n d

nh tim m ch và các b nh mãn tính khác chính vì v y
c ng d ng r

h v c th c ph m, m ph

c

ph m (Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez et al. 2014) [40].
có hai m ng ng d ng l n là màu th c ph m và th c ph m b sung. Trong công
nghi
ngoài ch

c ph m, -carotene

c s n xu

id

c ch t, s d ng b sung

i. Trong ngành công nghi p m ph m, -carotene

c thêm vào v i tác d ng b o v da ch ng l i tác h i c a UV (Del Campo,


Moreno et al. 2000) [17]. T
màu s c nên -carotene

c màu th c ph m, do có kh
c s d ng là ch t b sung màu cho các th c ph m t

tr ng gà, th t gà, cá.

ng th i bên c nh các thu c tính màu s c,

-carotene còn có tác d ng b o qu n th c ph m, là ngu n cung c p ch t ch ng oxy
hóa cho th c ph m. Ngoài ra, s d ng -carotene t ngu n vi t o có th t n d ng
ng ch t khoáng có trong vi t

ng hóa trong t bào và

. Vi c s d ng -carotene làm màu th c ph m ngày nay r t ph bi n và
không

c h i cho s c kh e
u s d ng -carotene

Trong nh
báo cáo c a công ty nghiên c u th

ng BCC, th

Theo

ng dành cho

1,2 t
nhu c u s d ng -carotene chi m t tr ng cao nh t v i 262 tri
2010; v i m

ng bình quân h

ki

u USD (BCC 2011) [11] (Hình 2.3).

Hình 2.3: Bi

kh o sát th

ki

t


-carotene

ng nhu c

c s n xu t b

ó

là t ng h p hóa h c và chi t xu t t t nhiên. Nh ng nghiên c u g
vi c s d ng -carotene t ng h p hóa h c
ng bi

n hi n
-carotene t

ng l i s

a ung

n ph m -carotene t

Bên c
m

li

i nhi m s c th , d

nhiên l i có kh

song

y

công nghi p thì ngu n cung -carotene t

m là

ph thu c th i v , ph c t p trong xây d ng và qu n lý vùng nguyên li u. S chênh
l ch v giá gi a -carotene t nhiên (1000-2000 USD/kg) và -carotene t ng h p
hóa h c (400-800 USD/kg) (Tawfiq Abu-Rezq S., Suad Al-Hooti et al. 2010) [67]
ng chuy n hóa -carotene t

c
nhiên.
2.1.3

-carotene
T t c các carotenoid nói chung và -carotene nói riêng quá trình sinh t ng

h

ng isopr

ng t ng h

thành ba giai: (1)

c chia

phân 5 cacbon (C5) g m IPP và DMAPP, (2)

n hình thành các h p ch t C40, (3)

i chu i C40 trong h th ng các

t o thành -carotene
n m t: Sinh t ng h p các ch
ra

n DMAPP và IPP di n

ng riêng bi

ng non-

mevalonate (MEP).
Sinh v t nhân chu
CoA thành IPP, ti
m ts

ng h p ngo i l

DMAPP qua ph n

ng s d

chuy n hóa acetyl-

ng phân hóa IPP thành DMAPP. Sinh v
ng s d

u tiên gi a pyruvateandglyceraldehyde-3-

phosphate. Th c v t và Streptomycetes thì s d ng c
Min Park et al. 2007) [74].
ng MAV

s n xu t IPP và

ng (Yoon, Hye-


ng MAV l

c phát hi n b i Bloch và Lynen vào nh ng

(Lynen, 1967) [41]. Trong
s k th pl iv

ng này, hai phân t acetyl-

t o thành acetoacetyl-

CoA th

tc

beta-methylglutaryl-CoA (HMG
CoA reductase, HMG

CoA).

u tiên

t phân t acetylt o thành beta-Hydroxyi s xúc tác c a enzyme HMG

c chuy n hóa thành mevalonate. Mevalonate sau

c phosphoryl hóa hai l

t o ra IPP (Isopentenyl
ng phân hóa thành m t isoprene khác là

DMAPP (Dimethylallyl pyrophosphate) nh s xúc tác c a enzyme IPP isomerase.

Hình 2.4: Sinh t ng h p

ng MAV

ng MEP
c khám phá, các nhà khoa h

u và

E. coli và S. chromofuscus

ng sinh

phát hi n m t s lo i vi khu
t ng h p carotenoid không ph thu
non-mevalonate hay còn g

c g i là
ng này quá trình sinh t ng h p


IPP và DMAPP không c

u tiên là ph n

gi a

pyruvate v i glyceraldehyde-3-phosphate t o thành DXD nh xúc tác c a DXD
synthetase, t ng h p ch t trung gian không nh
E. coli và A. thaliana làm

t ng h p thiamine và pydoxol. DXD có th
ti n ch t cho các h p ch

n ra m t lo t các ph n ng chuy n hóa

thành MEOP, MEP và t o

ng MEP không có m t trong

ng v

u trong vi khu n gây b nh và kí sinh trùng

Hình 2.5: Sinh t ng h

ng MEP

n hai: Hình thành các h p ch t C40.
DMAPP l

n ti p theo này,

t thêm IPP vào nh enzyme IPP prenyltransferases t o nên các

diphosphate tuy n tính geranyl pyrophosphate (GPP, C10, monoterpenoids), các
phân t

c liên k t v

t o thành các fanesy pyrophosphate
p t c liên k t v

t o thành
n t o carotenoid

b

u v i s t o thành các h p ch

u tiên phyotene t hai phân t GGPP


Hình 2.6: Quá trình sinh t ng h p carotenoids t IPP và DMAPP

c t o thành

d

ng phân 15C, có ba n

liên h p, không có màu s chuy n hóa ti p t c b ng nh ng ph n ng dehydro hóa
t o s n ph m là lycopene

Hình 2.7: Quá trình chuy n hóa phyopene thành lycopene

Sau cùng, lycopene ti p t
ph

- carotene, -carotene, - carotene

m t ho

u t o ra các s n


Hình 2.8: T ng h p -carotene t lycopene

2.1.4

-carotene
Ngu n cung c p -carotene

i có th là t t c các ngu n có ch a

carotenoid bao g m t th c v t, t o, n m hay t ng h p hóa h c. Tuy nhiên, 80-90%
ngu n cung c p -carotene
carotene có th

i là t th c ph m. Trong công nghi p, -

c t ng h p hóa h c hay lên men t vi sinh v t tùy t ng m c

2.1.4.1
cung
Ngu n cung c p -carotene ch y

i là t các lo i rau, c , qu

(Maiani, Caston et al. 2009) [42]. Các th c ph m có ch

ng -carotene cao

t, khoai lang (Desobry, Netto et al. 1998) [18]
carotene liên quan m t thi

n ki u gen trong các gi ng trái cây và rau c khác

nhau (Maiani, Caston et al. 2009) [42]
-carotene

[51]. Hi n nay

i có th d dàng thu nh n tr c ti p
ng. S h p thu -carotene ch u

m ts y ut

ng -

bi n th c ph m và n
quy mô công nghi

ng

ng (Parker, Swanson et al. 1999)

có nhi u quy trình thu -carotene t th c

c xây d ng và thành công. -carotene trích ly t cà r t (v i kho ng 34%

v
d

ng phân cis, còn l i là 66%

qu g c v i s n ph m

d

ng phân trans -carotene) ho c t

d ng d u g c (ANS 2012) [5].

mc a

c thu c vào th i v , quy trình tinh ch ph c t p, th i gian
dài và hi u su t không cao (Smith 1998) [61].


B ng 2.1

ng carotenoid có trong th c v t (Hà Th Bích Ng c, Tr n

Th Huy n Nga et al. 2007)

2.1.4.2

cung
ng h p -carotene

M t s loài vi sinh v
khu n có kh

t s loài vi

p, vi t o, n m (Heller, Descamps et al. 1998) [27]

có th thu nh n -carotene t vi sinh v

i

c thu -carotene t vi sinh

s d

v t là thu sinh kh i, có th tách chi t t sinh kh i ho c s d ng tr c ti p tùy thu c yêu c u
ch

ng -carotene (Heller, Descamps et al. 1998) [27]. -carotene t vi sinh v t ch

y

c s d ng trong công nghi p làm ch t ph gia th c ph m, th

(Hyung Seok Choi, Sang Yup Lee et al. 2010) [28].
các vi sinh v t ch t ng h p m

ng nh

chúng. Chính vì v y, ngày nay các nhà khoa h
i ch t c a vi sinh v t

ng các k thu t khác nhau tác
chuy n chuy

s lo i vi sinh v t s n xu t ra h p ch t mong mu n. B
c t ng h
1991) [45] và
t ng h p carotene b

-carotene cho b n thân

ng, kích thích m t

u t th

u tiên trên Z. mobilis, A. tumefaciens (Misawa, Yamano et al.
E. coli (Lee, Momen et al. 2003) [36] không mang gene sinh
t DNA tái t h p. Có b n y u t quy

s n xu t -carotene tái t h
(ch t n n cho ph n ng), th

t cao: Th nh t là cung c
hai là c n có s

cân b

nh thành công c a
các ti n ch t
các enzyme


có th chuy n hóa t
là k t h p v

o ra các h p ch t trung gian, th ba

gi m thi u s tích t các các ch

cu i cùng, th

t ch ph

ng ch t

ng t ng h p isoprenoids và kh

-carotene cao (Sies and Stahl 1998) [58].
2.1.4.3

cung
c t ng h p C40 carotenoid là s d
Witting gi a C10- dialdehyde v i hai phân t C15-

t o nên c

ix

c hi n ph n

ix

ng phân hóa và k t tinh t o nên

C40 hoàn ch nh.

u qu

d

c ng

n cu i cùng c a công nghi p t ng h p carotenoid. Trong s

600 lo i carotenoid

c tìm th y thì có 8 lo

c t ng h p hóa h c trên quy mô công

nghi p. Các carotenoid này bao g m lycopene, lutein, zeaxanthin,
canthaxanthin, astaxanthin, s d ng làm ch t ph gia th

- cryptoxanthin. Nh ng s n ph
c bi

-carotene,
c
m và th y

s n (Ernst 2002) [20].
-carotene b

c t ng h p hóa h c t nh

ty là Hofman La Roche (Th y s
t kho ng 500 t n/

c), chi m kho ng 70% s

ng th gi i,

.

T ng h p hóa h c b i Công ty BASF d a trên ph n ng c
hi n b i Badische Anilin và Soda-Fabrik (BASF). Quá trình t ng h
cách n i hai phân t

y u b i hai công

i x ng v i nhau qua trung tâm.

Hình 2.9:

t ng h p - carotene c a BASF

c th c
c th c b ng


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×