Tải bản đầy đủ

Ứng dụng phương pháp mã vạch DNA trong kiểm định thành phần chính của các sản phẩm thảo dược từ Giảo Cổ Lam. (Khóa luận tốt nghiệp)

I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM
-----------

-----------

PHAN TH MY
tài:
NG D

CH DNA TRONG KI

PH N CHÍNH C A CÁC S N PH M TH

C T GI O C LAM

KHÓA LU N T T NGHI

H

ot o


NH THÀNH

IH C

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công ngh sinh h c

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa h c

: 2011- 2015

Thái nguyên,

2015


I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM
-----------

-----------

PHAN TH MY
tài:
NG D

CH DNA TRONG KI

PH N CHÍNH C A CÁC S N PH M TH

C T GI O C LAM


KHÓA LU N T T NGHI

H

o

NH THÀNH

IH C

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công ngh sinh h c

Khoa

: CNSH - CNTP

L p

: K43 - CNSH

Khóa h c

: 2011- 2015

Gi ng viên

ng d n

ng
2. PGS.TS Ngô Xuân Bình


i

L IC

Trong quá trình h c t p và nghiên c

c khóa lu n t t

nghi p này ngoài s n l c c

cs

ch b

p hoàn thành lu

ng viên c a th y cô, b
Tôi xin bày t lòng bi

ng d

,

c nh t t i th y giáo:

ng gi ng viên Khoa Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c ph m

ng

i h c Nông Lâm Thái Nguyên, ThS. Ma Th Trang cán b t i B môn Sinh h c
Phân t và Công ngh Gene

Vi n Khoa h c S s ng

n tình ch b o, tr c ti

ng d

th c hi

i h c Thái Nguyên
tôi trong su t th i gian

nh lu n

Tôi xin chân thành c

t nghi p.

o Vi n Khoa h c S s ng

iH c

Thái Nguyên, ban ch nhi m Khoa Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c ph m
i h c Nông Lâm Thái Nguyên, các cán b , anh ch làm vi c t i B môn
Sinh h c Phân t và Công ngh Gene
,t

u ki

Vi n Khoa h c S s ng

tôi h c t p và nghiên c u.

Cu i cùng, tôi xin g i l i c
i

i h c Thái

ng viên, chia s

n bè nh ng
t qua m i

trình h c t p, nghiên c u và hoàn thành lu
Xin chân thành c
Thái nguyên, tháng 06
Sinh viên

Phan Th My


ii

DANH M C CÁC B NG

B ng 2.1. Tình hình nghiên c u và ng d ng công ngh DNA mã v ch trên th gi i....... 18
B ng 2.2. Tình hình nghiên c u và ng d ng công ngh mã v ch DNA Vi t Nam ... 20
B ng 3.1. Danh sách các s n ph m trà Gi o C Lam túi l c, trà Gi o C Lam khô và thu c
th
c Gi o C Lam d
i hóa trên
ng s d ng
trong nghiên c u....................................................................................................................... 23
B ng 3.2. Hình nh các m u trà túi l c, trà Gi o C Lam khô và thu c th
c d ng viên
i hóa trên th
ng............................................................................... 24
B ng 3.3. Danh sách các s n ph m trà th
c Gi o C Lam khô .................................. 26
B ng 3.4. Hình nh các m u trà Gi o C Lam khô............................................................... 26
B ng 3.5. Thông tin trình t c a các c p m i ITS2 và rbcLa ............................................... 28
B ng 3.6. Các thi t b s d ng trong nghiên c u................................................................... 29
B ng 3.7. Thành ph n dung d ch CTAB buffer s d ng trong tách chi t DNA t trà Gi o
C Lam khô.............................................................................................................................. 30
B ng 3.8. Thành ph n dung d
m CTAB s d ng trong tách chi t DNA t các m u trà
túi l c......................................................................................................................................... 30
B ng 3.9. Thành ph n dung d ch chi
ng nh t m u s d ng trong tách chi t DNA t
thu c th
c d ng viên nén ............................................................................................... 30
B ng 3.10. Thành ph n dung d ch CTAB buffer s d ng trong tách chi t DNA t thu c
th
c d ng viên nén.......................................................................................................... 31
B ng 3.11. Thành ph n dung d ch TE ( 10 : 0.1)................................................................... 31
B ng 3.12. Thành ph n ph n ng PCR.................................................................................. 36
B ng 4.1. Các thông s
i trong quy trình tách chi t DNA t ng s t các m u trà
Gi o C Lam khô..................................................................................................................... 40
B ng 4.2 . K t qu
u trà Gi o C Lam khô tách chi t theo quy trình s
i
................................................................................................................................................... 42
B ng 4.3. Các thông s
i trong quy trình tách chi t DNA t ng s t các m u trà túi
l c.............................................................................................................................................. 43
B ng 4.4. K t qu
a các m u trà túi l c tách chi t theo quy trình s
i ........ 44
B ng 4.5. T ng h p k t qu c a ph n ng khu
i trình t DNA mã v ch................... 49
B ng 4.6. T l
ng gi a trình t c a các m u trà Gi o C Lam v i trình t mã
v ch........................................................................................................................................... 56


iii

DANH M C CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình nh Gi o C Lam m c ngoài t nhiên và qu Gi o C Lam ....................... 2
Hình 3.1: Chu trình nhi t c a ph n ng PCR khu

n gen rbcLa.......................... 36

Hình 3.2: Chu trình nhi t c a ph n ng PCR khu

n gen ITS2............................ 37

Hình 4.1. Hình nh so sánh k t qu tách chi t DNA t ng s t các m u trà Gi o C Lam
khô ti n hành theo hai quy trình.............................................................................................. 41
Hình 4.2. Hình nh so sánh k t qu tách chi t DNA t ng s t các m u trà túi l c Gi o C
Lam ti

c và sau khi s

Hình 4.3. K t qu PCR khu

i.......................................................... 43

n gen rbcLa t DNA các m u trà Gi o C Lam khô

................................................................................................................................................... 45
Hình 4.4. K t qu khu

n gen ITS2 t các m u trà Gi o C Lam khô................. 46

Hình 4.5. K t qu khu ch

n gen rbcLa t DNA khuôn tách các m u trà túi l c . 47

Hình 4.6. K t qu khu

n gen ITS2 t m u trà túi l c s 1 và 4 ........................... 48

Hình 4.7. K t qu tinh s ch s n ph m PCR c a các m u trà Gi o C Lam khô và trà túi l c
................................................................................................................................................... 50
Hình 4.8. Ch

ng tín hi u gi i trình t theo giá tr Quality Valu (hình a-e th hi n ch t

ng tín hi u trình t theo giá tr QV c a các m u l

t là trà Gi o C Lam túi l c s 1,

2, 4 và trà Gi o C Lam kh s 3 và 6).................................................................................. 52
Hình 4.9. Hình nh th hi n các vùng b nhi u trong trình t c a m u trà Gi o C Lam túi
l c s 2 ...................................................................................................................................... 54
Hình 4.10. Hình nh th hi n s t p nhi m b i DNA c a các loài có quan h g n
trình t c a m u trà Gi o c Lam khô s 6............................................................................ 54
Hình 4.11. Hình nh th hi n s t p nhi m b i DNA c a các loài khác nhau trong trình t
c a m u trà túi l c s 4 ............................................................................................................ 55
Hình 4.12. K t qu so sánh trình t rbcLa c a m u trà túi l c s 1 v i các trình t công b
trên ngân hàng gen................................................................................................................... 57
Hình 4.13. Hình nh th hi n m
th

thu h i DNA t các d ng chi t xu t c a nguyên li u

c .................................................................................................................................. 59


iv

DANH M C CÁC T

VI T T T

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

DMSO

: Dimethylsulfoxide

dNTP

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

dATP

: DeoxyAdenine Triphosphate

dGTP

: DeoxyGuanine Triphosphate

dCTP

: DeoxyCytosine Triphosphate

dTTP

: DeoxyThymine Triphosphate

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic acit

Kb

: Kilo base

NCBI

: Nation Cetrer for Biotechnology Information (Trung tâm Qu c gia v

Thông tin Công ngh sinh h c)
PCR

: Polymerase Chain Recation

ddNTP

: Dideoxynucleotide Triphosphate

ddATP

: DideoxyAdenine Triphosphate

ddGTP

: DideoxyGuanine Triphosphate

ddCTP

: Dideoxycytosine Triphosphate

ddTTP

: DideoxyThymine Triphosphate

cpDNA

: Chloroplast (DNA trong l c l p)

mtDNA

: Mitochondrial (DNA trong ty th )


v

M CL C

PH N 1...........................................................................................................................1
M

U ........................................................................................................................1
tv

.................................................................................................................1

1.2. M

tài .................................................................................................4
c ti n c

tài..................................................4

PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U..............................................................................5
2.1. Gi i thi u v công ngh mã v ch DNA ................................................................5
l a ch n các trình t
c

s d ng làm DNA mã v

m

n mã v ch................................................................................6

2.3. Mã v ch DNA s d

nh loài

ng v t và th c v t ....................7

2.3.1. Mã v ch DNA

ng v t ....................................................................... 7

2.3.2. Mã v ch DNA

th c v t ........................................................................ 8

2.4. Các s n ph m th

c và nh

m

i v i s c kh

i tiêu

dùng ...............................................................................................................................10
2.

th s d

nh nguyên li u th

c ........11

a trên ch th phân tích gi i ph u h c.......................... 11
a trên ch th hóa h c ........................................... 12
a vào ch th DNA....................................................... 13
mc

ch so v

nh nguyên li u th

c...................................................................................16

2.7. L a ch n và s d ng vùng DNA mã v
nguyên li u th

nh các thành ph n

c ..................................................................................................16

2.8. Tình hình nghiên c u, ng d
ng các s n ph m th

ch trong ki

nh,

c và th gi i .......................17

2.8.1. Tình hình nghiên c u trên th gi i........................................................ 17
2.8.2. Tình hình nghiên c

c.......................................................... 19


vi

PH N 3

NG, N

U.......22

ng và ph m vi nghiên c u........................................................................22
ng nghiên c u............................................................................ 22
3.1.2. V t li u nghiên c u ............................................................................... 28
3.1.3. Ph m vi nghiên c u............................................................................... 28
m và th i gian ti n hành nghiên c u........................................................28
m nghiên c u ............................................................................. 28
3.2.2. Th i gian nghiên c u ............................................................................ 28
3.3. Thi t b , hóa ch t nghiên c u ...............................................................................28
3.3.1. Thi t b nghiên c u ............................................................................... 28
3.3.2. Hóa ch t nghiên c u.............................................................................. 29
3.4. N i dung nghiên c u.............................................................................................32
u ......................................................................................32
ách chi t DNA t ng s ................................................... 32
n di trên gel agarose .................................................. 35
................................................................................. 36
ch s n ph m PCR ................................................. 37
nh trình t các nucleotide...................................... 38
c t các s n ph m v i các
trình t DNA mã v ch..................................................................................... 39
PH N 4 K T QU VÀ TH O LU N....................................................................40
4.1. K t qu ...................................................................................................................40
4.1.1. K t qu tách chi t DNA t các m u trà túi l c, trà Gi o C Lam khô và
thu c th
c d ng viên nén ....................................................................... 40
4.1.2. K t qu PCR khu

i gen rbcLa và ITS2 ...................................... 445

4.1.3. K t qu tinh s ch s n ph m PCR .......................................................... 49
4.1.4. K t qu gi i trình t

n gen rbcLa và ITS2....................................... 51

4.2. Th o lu n ...............................................................................................................58


vii

PH N 5 K T LU N VÀ KI N NGH ....................................................................62
5.1. K t lu n..................................................................................................................62
5.2. Ki n ngh ................................................................................................................62
TÀI LI U THAM KH O...........................................................................................64


1

1

1.1
Các cây thu c th

c s d ng t r t

truy n. Hi n nay, thu c th
V

cv

i trong n n y h c c

c s d ng nhi u trong vi c ch a tr b nh.

ng c a cu c s ng ngày càng hài hòa cùng thiên nhiên, vi c s d ng các

nguyên li u th

b o v s c kh e và

ngàn loài th c v

u tr b nh

ng v

Hàng

c dùng làm nguyên li u thu c

[28]. Vi t Nam là m t qu c gia có ngu n tài nguyên th c v t phong phú. Theo th ng
kê c a B y t m

t Nam tiêu th kho ng 30 - 50 t n nguyên li u th

s d ng trong y h c c truy n và xu t kh
th dùng tr c ti p làm tác nhân
t ng h p các lo i thu c. Hi n nay,
lo

c li u [1],

s n ph m th

c

c ngoài. Các loài cây th

u tr ho c làm nguyên li

c có

u cho quá trình

Vi t Nam m i ch khai thác s d ng kho ng 200
ts

i d ng các

Sâm Ng c Linh, trà Tam Th t X

N m Linh Chi...Các s n ph m th

en, trà Gi o C Lam, trà
ng v i các hình th c m u

mã, nhãn hi u khác nhau và có th ch a duy nh t m t thành ph n ho c là s k t h p
c a nhi u thành ph n. Vi c li t kê chính xác các thành ph n c a các s n ph m th o
c là r t quan tr
d

iv

i tiêu dùng, song các thành ph

nh b ng hình th c tr c quan [32].
Gi o C Lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino
c

c s d ng

r

t lo i cây thu c dân gian và trà th

c châu Á bao

g m

Trung Qu c, Nh t B n và Hàn Qu c [50]. Gi o C Lam còn có

nhi u tên g i khác, trong ti ng Trung g i là "Jiao Gu Lan", trong ti
g i là

á,

Vi t Nam

ng g i là Gi o C Lam ho c cây B

ng. Trong cu n "Compendium of Materia Media" c a tác gi Li Shi
b

n Gi o C Lam

c

cs d

Zhen xu t

u tr nhi u lo i b nh


2

ái ra máu, phù n
d ng Gi o C Lam

h ng và c , kh i u, các ch
u tr các b nh c m l nh

ng và các b nh truy n

nhi m khác [38].

Hình 1.1. Hình nh Gi o C Lam m c ngoài t nhiên và qu Gi o C Lam
( Ngu n nh : NaturalyPure.com)
Trong cây Gi o C Lam có ch a nhi u ho t ch t quý bao g m saponin,
flavonoid, chlorophyll, và carotenoids. Trong

c cho là

ch u trách nhi m chính cho tính ch t c a Gi o C Lam.
dammarane

saponin triterpene

nh t Gi o C Lam

c g i là vitamin

P. Saponin và flavonoids t Gi o C Lam có vai trò quan tr ng trong phòng ng a
và h tr

u tr

m ung
u tr các b nh b ch c u, glioma, mi

i tr c tràng, tuy n ti n li t và
i, th c qu n [50], ngoài

ra Gi o C Lam còn có tác d ng r t tích c c trong phòng ng

u tr b nh ti u

ng [23]. Ph n l n các báo cáo ch y u t p trung vào hi u qu c a c
là các flavonoid [50]. Hi n nay, Gi o C Lam
th

c

Hoa K và nhi

c Châu Á

i hóa

i d ng trà

c, Nh t B n và Vi t

Nam [23, 50].
Các s n ph m th

c bày bán s n trên th

th b ng các loài cây khác ho c có ch a các ch

ng có th b nhi m, b thay
c li t kê trên nhãn

c a s n ph m do s nh m l n ho c c ý. Theo t ch c y t th gi i, s pha tr n,


3

thay th các nguyên li u th

c là m t m i

tiêu dùng vì h không th t ki

al n

c ch

n s an toàn c

ng c a các s n ph m h

dùng cho nên vi c mua ph i các lo i s n ph

m b o ch

c [34]. S thay th , pha tr n các nguyên li u th
gi m tác d ng c a thu c, trong m t s
li

u
c có th làm

ng h p còn gây ch

thay th có ch a các ch

i

i n u nguyên

ch

nh chính xác các

thành ph n nguyên li u làm thu c là vô cùng quan tr ng [49].
n th ng
ph

m quan (x

xúc giác)

nh n di n cây thu c bao g m các

nh b ng các giác quan: V giác, th giác, kh u giác,
c ví d

M

HPLC-UV, HPLC-MS [9, 49].

nh b ng c m quan có

chính xác l i ph thu c r t nhi u vào kinh nghi m c a các thanh tra viên [45]
n a s khác bi t gi a các loài có liên quan ho c các s n ph m ch bi
không rõ ràng [28]. Phân tích hóa h
ng b

tin c

t qu có th b

u ki n sinh lý và sinh hóa c a các lo i th o m c. Các loài có

ch a các thành ph n hóa h

ng nên có th nh m l n . Vì v

các thành ph n c a các s n ph m th

c là r

nh

c bi

nh ng nguyên li u có ngu n g c t th c v

iv i

c ch bi n m t ph n ho c

d ng nghi n thành m nh nh [36, 45, 49].
V i s ti n b c a

t di truy n, DNA marker tr thành m

thu n l i cho vi c nh n d ng các loài
phân t

nh, không b

thu ho ch

c

n

nghiên c u phân t . DNA là m

ng b i các y u t

tu

i

u ki n

c tìm th y trong t t c các mô c a m t cá th , vi

ch c n m

u nh . Vì v y, vi c l a ch n nghiên c u DNA

nh loài là m
nghiên c u DNA

u qu

các m u khô ho

Các k thu t m

n trong vi c
.

nh các m u v t sinh h c s d ng các trình t

DNA ng n c a h gen sinh v t g i là mã v ch DNA.
xu t b i Paul Hebert,

các sinh v t

i h c Guelph

t k thu t s d ng nh ng vùng gen tiêu chu

ãv

c

phân lo i loài [26,49].
phân bi t các loài. So v i


4

n th ng, k thu t mã v ch DNA cho k t chính xác
nhi u, mã v ch DNA cung c p công c h

cl

r t

b sung cho các phân

tích hóa h c trong vi c
nh
m b o ch
ng
c li u [27].
Hi n nay, có nhi u phòng thí nghi m trên th gi i ng d ng
mã v ch DNA

nh thành ph n trong các s n ph m th

c. Tuy nhiên,

Vi t Nam các nghiên c u v DNA mã v ch ch y u t
di truy n, nh n di n

m t s loài. Các ng d ng c a DNA mã v

c ph

c

n. Vì v y, vi c ng d ng công ngh sinh h c

thu t di truy

c bi t là k

ng các s n ph m th

ra các lo i s n ph m kém ch
c n thi t. N m b

ng góp ph n

mb ol

có th tìm
i tiêu dùng là r t

c t m quan tr ng và nhu c u th c t trên, tôi th c hi

d

ch DNA trong ki

ph m th

ng

ng

nh thành ph n chính c a các s n

c t Gi o C Lam

1.2.
- Tách chi t thu DNA t ng s t các m u trà Gi o C Lam khô, m u trà túi l c
Gi o C Lam và thu c th

c d ng viên nén .
i thành công vùng gen rbcLa và ITS2 t

- Th c hi n ph n ng PCR khu
DNA thu

các m u trên.

- Gi i trình t các s n ph m PCR, t các d li u trình t
ng các m u trà và thu c th

1.3

c.

c ti n c
-

c:

tài

ng d

ki

thành ph n chính trong các s n ph m trà th
ng c a các s n ph m th
th

c ti n: X

cs

nh
t

c khác.
c ch

ng c a các s n ph m trà

i tiêu dùng có nh ng l a ch n h p lí nh t.


5

PH N 2

S

ng loài là n n t ng cho t t c các nghiên c u sinh h c
t thách th c l n, v

phân lo

nh các loài là m t nhi m v

không d dàng. Trong th c t , m i ch
hàng ch c tri u loài sinh v
xác

nh

ch .

c kho ng 1,7 tri u loài trong
t [31]. T

vào nh n d
nh



, có r t nhi

m và ch

c

hình thái. Tuy nhiên,

a vào hình thái bên ngoài c a sinh v t có r t nhi u h n

u tiên là s m m d o v ki u hình và bi n d di truy n

nên nhi u khi s cho k t qu không chính xác. Th
c a các loài có quan h g

các loài sinh v t
m hình thái

m bên ngoài gi ng nhau d d n t i nh m

l

i theo t
u ki n s ng d n

n phát tri n, t ng môi
c loài. Cu i cùng, vi c nh n di n

nh danh loài yêu c u chuyên môn cao

c phân lo i h c [38, 53].

a, tr ng và các loài sinh v t khi còn non không th phân bi t d a vào các
cá th
nh t

i v i th c v t, m t m u v t có th d dàng xác

m c a hoa, trong khi r và các b ph n th c v t khác không th phân

bi t. Qua các nghiên c u cho th y s

ng các loài b tuy t ch

ng có r t nhi u loài th c v
r t nhi u loài trong s
c n ph i t o ra m t danh m
ch ng

nh. T th c tr ng trên cho th y
ng sinh h

ph c cho các nghiên c u

các loài [24]. Ô

c khi chúng b tuy t

ng sinh h c [25].

3, Paul Hebert, nhà nghiên c u t
sáng l

ng v t b m t m i

i h c Guelph, Canada

ch,

nh n di n

xu t s d ng m t trình t ng n c a m

Cytochrome c oxidase 1 (CO1) có chi u dài kho

i

c g i là

là m t trình t DNA


6

có ch a trong t t c
phân bi t các loài
c

ng v t, tuy nhiên các trình t này có th s d
n gen CO1

ng v t.

c tìm th y trong ty th . H gen ty th

ng v t là m t m c tiêu t t

intron và vi

gen nhân vì thi u các

n

ng t p trung vào các gen trong ty th , 13 gen mã hóa

cho protein trong ty th

ng v t là nh ng vùng gen có nhi u ti

mã v ch DNA b i vì s thêm và m t các trình t d
CO1

c r t hi m x y ra

nm ts

ng

i trong

các y u t quan tr

có th s

n CO1

d ng làm DNA mã v ch [38, 57]. L i th c a vi c s d
loài

dùng làm

nh

c gi i trình t m t cách nhanh chóng và r ti n
c các bi n th gi a các loài [58].
nh loài b ng trình t

v ch

u tiên, m t m u v t ph
tm

c thu gom và

n DNA mã

nh b i các nhà phân lo i.

c l y t m u và ti n hành tách chi t thu DNA t ng s , sau

trình t DNA

c khu

i b ng ph n ng PCR và

t o ra m t mã v ch. Cu i cùng, các mã v

c gi i trình t

c nh p vào h th ng d li u Barcode

cu c s ng (BOLD). Nó là m t h th ng tr c tuy

giúp các nhà nghiên c u thu

th p, qu n lý và phân tích mã v ch DNA. M i m

c t ch c trong BOLD có

tên phân lo i, hình nh c a loài, GPS t

c tìm

th y và trình t mã v ch. Thông tin này có th truy c p thông qua BOLD cho b t c
ai trên th gi i và có nhi u ng d ng bao g m c gi

ng, an toàn th c

ph m và y h c. Ví d , DNA mã v ch s

nh các u trùng

cs d

c a loài xâm h i, phát hi n ra các loài m i [46]
v t c n, chích ho c ng

nh các loài gây ra m t

c, xác minh th c v t hay thành ph

ng v t trong th c

ph m [57].

l a ch n các trình t
v ch

mc
Có m t s

s d ng làm DNA mã

n mã v ch
l a ch n m t trình t có th

cs d

t mã

v ch DNA. Các trình t

c s d ng làm mã v ch ph i có trong t t c các loài c a

m

mb

phân lo i l

ng n kho ng 400-

có th phân l p


7

c t các m u v

ng, suy gi m v ch

khu ch

i m t cách d dàng mà không t n kém. Trình t c a mã v ch DNA gi a các loài
c n có s gi
có th

i ch a kho ng 30% trình t khác nhau
nh, th m chí có th phân bi

c các loài có liên quan ch t

ch m t cách d dàng. Hai bên c a các trình t này là các vùng b o t n ti n hóa
t

u ki n thu n l i cho vi c s d ng các c p m

khu

n

gen mã v ch [46].

2.3. M
2.3
S
lo

ng c a th gi

ng v

t ra m t thách thách l n trong vi c phân

nh danh các loài. M t h th ng phân lo i cho th gi

bao g m ít nh t hàng tri u loài khác nhau [38]. Phân lo i hi
gi a th k

ng v t s có th
i có ngu n g c t

c kho ng 1,7 tri
c mô t

ng v t l

u tiên, trong khi nhi u sinh v t nh

n. Tuy nhiên, ngay c

ng v t l

d ng gi a các loài. H sinh v t c

n

c bi t

n có nh ng nghi ng v nh n

t có th ch a t

v t nhân chu n. Vì v

n 100 tri u loài sinh
m hình thái thì con

s trên là quá l n, bên c

ts

n vi c xác

u tranh ch ng buôn bán các loài nguy c p
tuy t ch ng, giám sát th y s
h i ho c b

nh và ki m soát s lây lan c a các loài v t gây

nh dòng tuy t ch ng [53]. V i s

ng sinh h

v y thì vi c tìm ra m t công ngh cho vi c phân lo i là vô cùng quan tr ng.
, Paul Hebert
m

xu t "mã v

nh loài, mã v ch DNA là m t chu i nucleotide ng n l y t m t

ph n thích h p c a h gen

cs d

xu t xây d ng m t h th ng phân lo
Cytochrome c oxidase ti

nh

m

ng v t d a trên s

loài [1, 49]. Ông
ng trong chu i

1 (COI) [38]. Gen Cytochrome c oxidase ti

v 1 trong ty th cung c p m t s l i th so v i DNA trong nhân: Có th nhân lên


8

n intron và có s

nhanh chóng, thi
r t quan tr

i v i s khu

d

ng b n sao cao. Nh

i b ng ph n ng chu i polymerase (PCR) và s
ng trình t gen CO1 ch

t marker phân t [29].
ng v

ng và côn trùng, nó không th dùng cho t t c các

ng vât, ch ng h
[12, 21],

xác

i v i b t bi n và san hô thì vùng gen này r t b o th

i có s bi

i quá cao

giáp xác [17, 46],
tardigrades (loài g

trong khi
gen này có s s p x p l i l n nên s

c) thì vùng

n vi c s d ng các c p m i ph

bi n trong ph n ng PCR [7]. Ngoài locut gen CO1,

n gen khác trong ty

Cytb (cytochrome b

th

mã v ch trong nh n d ng

ng v t [1].

2.3
H th c v

ng. Chúng bao g m th c v t có h t

(h t tr n và h t kín) cùng v

và các loài có quan h g n v

T ng s loài khác nhau r t nhi u gi a công b c a các tác gi
g

.

m

c tính

y r ng hi n có kho ng 380.000 loài th c v t trên c n, g m

kho ng 352.000 loài th c v t h t kín, 1.300 loài th c v t h t tr n, 13.000 loài rêu và
.V im ts

ng loài l

y thì v

không d dàng và s t n nhi u th i gian, vi

v phân lo

nh danh loài d

tin c y không cao, trong khi s
ng, s loài tuy t ch

S

m

ng loài luôn luôn bi n

mà có th chúng còn ch

Vì v y, c n có m t bi n pháp thích h

nh danh s

gi quy t v

c bi

n.

này [6, 31].

i c a m t công ngh g i là "mã v ch DNA" là m t công c h u ích

gi i quy t v

trên

c dùng làm mã v ch có th tìm th y

t tc

các sinh v t (ho c ít nh t là trong t t c các thành viên c a m t nhóm loài), các trình
t nucleotide s gi ng nhau ho c r t gi ng nhau

các cá th trong cùng m t loài,

a các loài. Vì v y, khu v c này có th

c s d ng cho nh n

d ng các loài b ng cách so sánh trình t c a nó trong sinh v t th nghi m v i trình t
t tài li u tham kh

c bi t t

d li u [46]. Mã v ch DNA

c s d ng


9

m t cách hi u qu

ng v t, t o và n

n còn có nh ng cu c tranh lu n

v vi c s d ng các vùng DNA chu

áp d ng cho th c v t. Mã v ch DNA d a

trên trình t Cytochromecoxidase 1 (cox1) c a ty th
nh và phát hi

c s d ng trong vi c

ng v t [41] ch ng h

cá [53], nh n [18], n m [44] và t o

[47], chim [20],

[42] m t cách hi u qu v i m

loài là trên 90% [41]. Vi c áp d ng h th ng mã v
g p nhi

, thách th c

phân bi t

i v i th c v t trên c n

c n nghiên c u b gen trong l c l p và b

tìm ki m vùng mã v ch phù h p cho th c v t [6, 50]. T l nh ng s
thay th trong b gen c a th c v t là th
th

ng v t. T

so v i nh ng quan sát trong ty

y r ng c n ph i có m t s

nhi u locus cho mã v ch

ng l n d li u trình t t

th c v t [35]. Không có vùng DNA ph bi n nào phù h p

cho t t c các loài th c v

ng t t c các tiêu chí c n thi

c tìm th y.

ng (PWG - Plant Working Group)
ra 5 vùng gen n m trong l p th có ti

s d ng làm mã v ch cho th c v t,

bao g m vùng matK (mã hóa cho maturase và có v trí trong gen trnK), vùng rpoB
RNA polymerase), rpoC1(ti

(ti

RNA polymerase), accD (ti u

c

c bi

ycf5 gen mã hóa protein tham gia vào quá trình sinh t ng h p Cytochrome c).
2007, trong m t nghiên c u ti p theo

xu t thêm hai vùng gen n m trong DNA

rbcL và matK
x , bút tháp và rêu. Hi u su

nh các cây h t tr n, h

nh loài c a s k t h

t 72%. Ngoài

psbA-trnH thu c plastid và trình t ITS thu c DNA ribosome h t

ra

c th nghi

ch b sung [16].

DNA trong t t c các t bào c a m t cá th

,

vi

nh

loài có th ti n hành b ng cách s d ng b t c ph n mô t bào nào c a sinh v
t ib tk

n phát tri n. DNA có th

sau khi sinh v t ch

c phân l p t tiêu b n ho c t các m u

c b o qu

.

DNA còn có t m quan tr ng
t

ov

c b o qu n trong m t th i gian dài
nh loài kh

c bi t cho nghiên c u khoa h c và các m

ng,

c a phân t
c

ng sinh h c, nghiên c u sinh h c, các


10

bi n pháp ki m d ch, khoa h c pháp y và
ph m [4, 46].
ng v t, n m và t o t l

nh ch

ng các nguyên li u s n

nh loài thành công là 90% thì

T l

th c v t

a t l phân bi t khác nhau r t nhi u

gi a các dòng gi ng cây tr ng [41]. Ví d , kho ng 90% các loài asterella (m t loài
rêu) có th
ch

c phân bi t b ng

n gen rbcL,

i v i th c v t h t kín thì

t 70% [42] và ch có 32% các loài th c v t h t tr n

t thành công b i

s k t h p c a m t s khu v c DNA trong l c l p [22].
Qua các nghiên c u v các locus
n k t lu n r

trong h gen l c l p và h gen nhân d n
ch

th c v t t n t i và ch có mã v ch

u ki n tiên quy t cho mã v ch DNA

th c v t [50]. L a ch n c hai

vùng mã v ch là rbcL và matK cùng v i hai khu v c b sung là ITS (ho c ITS2) và
trnH psbA

c ch ng minh là phù h

s d ng cho phân bi t các loài th c

v t m t cách hi u qu hi u qu [15].

2.4.
Các lo i th

c truy n th

c s d ng r t r ng rãi trên toàn th

gi i. Hi n có kho ng 80% dân s th gi i s d ng các s n ph m có ngu n g c th o
o v s c kh e. S
t ra m t v
li u th
nhi u hi

c [40].

v ch

gi m chi phí giá thành s n xu

i nhu n

t

ng làm gi , thay th nguyên li u làm thu c b ng các lo i nguyên li u

n s c kh

cl

v m t s n ph m th

tm i

i tiêu dùng.

t nhi u công trình nghiên c u v v

perforatum

i v i các s n ph m th o

ng, tính hi u qu và s an toàn c a các nguyên

r ti n, b sung thêm các ch
al

g nhu c

c

này. Trong m t nghiên c u
t xu t t cây Hypericum

y có s thay th b ng cây Senna alexandrina (thu c cây h

u), k t qu ch tìm th y mã v ch c a cây Senna alexandrina ch không h có mã
v ch c cây Hypericum perforatum. N u s d ng trong m t th i gian dài

c


11

tính c a cây Senna alexandrina có th gây ra nh ng tác d
i tràng, t

y mãn

ng [35].

Trong m t nghiên c u khác v các s n ph m trà th

c và chè (Camellia

sinensis) thì m t ph n l n các s n ph m có ch a m t ho c nhi u mã v ch c a các
lo i nguyên li
th

n ph m là trà

c, 3/70 (4%) s n ph m là chè [32]. Liuwei Dihuang Wan (LDW) là m t

lo i thu c k t h p b i 6 lo i th

c truy n th ng bao g m: Rehmannia

glutinosa, Cornus officinalis, Paeonia suffruticosa, Dioscorea opposite, Poria
Cocos và Alisma ori entails. T t c các nguyên l
tr n v i nhau cùng v i m t ong ho
tích d li u mã v ch ITS2
th o m

c nghi n thành b t, ph i

c và làm thành viên thu c. Qua s phân

c t các m u LDW thì phát hi n có t 3-4 lo i

c phát hi n có trong lo i thu

i thành ph n c a nó,

n th y có s xu t hi n c a 5 loài khác gây ô nhi m bao g m:
Persicaria odorata, Rumex, Vigna, Saposhnikovia và Taraxacum. S t p nhi m
nh ng loài này vào các m u thu c có th gây ra nh ng tác d ng ph không mong
mu n [11]. Ngoài ra còn r t nhi

ng h p gây ng

c th

gây ra b i s thay th , nh m l n trong vi c s d ng nguyên li u. Ví d s

c
nh

nh m l n loài Gelsemium elegans (cây lá ngón) là loài Mussaenda pubescens (cây
m b c) là m t thành ph n có ch a trong m t lo i trà th o m c
gây ra hai v ng

Trung Qu

c t i H ng Kông. S pha tr n m t ch t ch ng viêm t

ct

c a loài Aristolochia fangchi (m t lo i thu c b H tiêu) và Stephania tetrandra
(Hán phòng k

ng h p suy th

ng

ti t ni u [28].

Các t bào ho c mô l y t các m u nguyên li u th
kình hi n vi có th th

cr

m, thành ph n c a m u mô t

i
a


12

m c a các thành ph

v

ch d n, l p bi u bì, các lo i s

nh loài. Phân tích gi i ph u có th không cung c p m
xác th

xác

nh

n rõ ràng

c bi t là t các loài có liên quan,

t

.

n, d th c hi n, không t n kém. Tuy nhiên, các

y ut

an

c a các lo i th o m c có th
d

u ki n b o qu n

n c u trúc bên trong c a t bào. Vì v y s

i ph u h

xác th c các nguyên li u th

qu

c bi t các nguyên li

c s cho k t
bi n [36].

c ký l p m ng (Thin Layer Chromatography -TLC)
và s c kí l ng cao áp (High Performance Liquid Chromatography- HPLC
d

nh các thành ph n nguyên li u th

ch

cs

c [36]. Protein và các ho t

i khác là s n ph m c a quá trình bi u hi n gen c a sinh v t. Nghiên c u

các khác bi t trong thành ph n c a các s n ph m này có th

nh nh ng s

khác bi t v m t di truy n gi a các cá th và các
m

u hi

n di protein là

phân bi t, nh n di n gi a các loài b i m i protein là

s n ph m c a m

ós

n ánh gián ti p s

hình trong ki u gen c a các loài [3]
các nguyên li u th
ho

m là

c có th b

u ki n b o qu

ch vì các loài trong s

ng b
a, r

u ki
phú [3].

u ki

[36]

i

n ph m bi u hi n gen (protein,

) không cho s
cl pv

phân bi t các loài liên quan ch t

ch a các thành ph n hóa h

v i các cá th có quan h di truy n g
enzyme

u ki n sinh lý, th i gian thu

h c a các ch th hóa sinh
ng (do quá trình bi u hi

ng khác nhau) và s

ng ch th

i


13

Các ch th DNA có th phân chia theo nhi u tiêu chí khác nhau, d
s k thu t hay tính ch t di truy n c a ch th . D

k thu t có th phân

chia thành các nhóm sau:
- Nhóm ch th DNA d a trên ph n ng PCR
- Nhóm ch th DNA d

lai DNA

- Nhóm ch th DNA d a trên trình t DNA

+ Ph n

ng PCR d a trên các c p m i ng u nhiên (PCR by Arbitrarily

Chosen Primers

ACP PCR)
i ng u nhiên (Random

Amplified Polymorphic DNA - RAPD) và PCR các c p m i tùy ý (ArbitrarilyPrimed PCR

AP PCR)

c phát tri
d ng t p h

khu

im

n DNA khuôn,

n m i dài kho ng10 nucleotide và

-PCR s d ng c p m i dài kho ng 20 nucleotide. Các
pháp này s d

làm m i xuôi và m

cách tùy ti n có trình t ng

n m i này ng

v i DNA khuôn t i nhi u v trí khác nhau. T p h p các s n ph m khu
c s ch a các

n DNA ch khu

t các m

i thu

n khu

is t o

m là không c n bi

trình t gen c a loài c n nghiên c u
th c hi n ng

ng g n

i t m t s m u DNA h gen mà không

có m t hay v ng m t c
a các loài.

cm t

c

ng DNA cho nghiên c u c n ít, th i gian

n, chi phí th p. Tuy nhiên, k thu t RAPD có m t s
nm is d

i v i khuôn nên kh

c ng n và không th b t c p tuy t
t hi

p, k t qu phân tích không n

ng có s sai khác gi a các l n nghiên c u. Bên c
th tr i nên không th phát hi

c các cá th d h p t [36].


14

+

p l i liên ti

n (Simple Sequence

Length Polymorphism - SSLP)
Trong h gen sinh v t b c cao, ngoài các trình t mã hóa protein còn có các
y u t DNA l p l i, phân b trên nhi m s c th

c khác nhau. Tùy

vào s phân b DNA trên h gen, các y u t DNA l p l

c chia làm hai nhóm

là trình t DNA l p l i r i rác và trình t DNA l p l i n i ti p

c khác

nhau (VNTR

c chia

làm 3 nhóm bao g m: DNA v tinh, Minisatellite và các vi v tinh. DNA vi v
tinh còn g

n l p trình t

i n (SSR- Simple Senquence Repeats). SSR

có m

c hi u cao cho nên s n ph m nhân gen c a ph n ng PCR-

hi u và

nh, nh tính b o th c a vùng trình t

n mà m i c a SSR có th

s d ng chéo gi a các loài khác nhau. Ngoài ra, ch th SSR là di truy
và m

s d

d h pt

c

phát hi n các cá th

ng tr i

ng h p t và

SSR còn có th th c hi n nhanh chóng

gi

m là c n k t h p các c p m i

c

ng v

uc

n DNA ch a trình t l p l i [3].

2.5.3.2. Các
+

c c t b i enzyme gi i h n

(Restriction Fragment Length Polymorphism
Trong h gen c a các sinh v
t

RFLP)

ng x

t bi

t bi n thêm b

n trên nhi m s c th . Nh ng bi

i trình
n DNA hay s p x p l i các

i này có th

m, d ch chuy n

các v trí nh n bi t c a enzyme c t gi i h n. Khi enzyme gi i h n c t DNA h
gen, nh

i cu v trí nh n bi t s t o ra các m

c

khác nhau. RPLP d a trên s phân c t DNA h gen b ng các enzyme c t gi i h n,
các s n ph m c t có th phát hi n b ng quá trình lai Southern Blot v i các m u dò
ng v phóng x
nghiên c

ng di truy

c s d ng ph bi n nh

a th k 20


15

cho k t qu

tin c

i chuyên viên có

tay ngh cao, m t nhi u th

c h i và ph c t

d ng. Hi

c c i ti

còn g i là CAPS. Ch th
bi

cs
c g i là PCR-RFLP hay

n, nhanh chóng, chi phí th p, có th phân

c cá th d h p t . Tuy nhiên, m

n b i ch th này

ph thu c vào các v trí gi i h

ih ns d

c t s n ph m PCR [3].
+

n c t khu

phân

i (Amplified Fragment

Length Polymorphism - AFLP)
thu t k t h p gi a RFLP và PCR. AFLP s d
enzyme c t gi i h n c t DNA b gen t
oligonucleotide có trình t
gi i h

o nc

u c t so le,

ng th i hai
n v i các adapter

c thi t k d a trên trình t nh n bi t c a enzyme c t
c dùng làm khuôn cho ph n ng PCR. S khác nhau trong

chi u dài c a các s n ph m PCR t o nên s
u ít, không c n bi
p m i s d ng không c n

c trình t

c hi u cho loài (các c p m i có th dùng

cho h u h t các loài) và có th áp d ng v i các h

c l n. Tuy nhiên,

nh phân bi t cá th

c dùng làm mã v ch có th tìm th y

ng h p và d h p

t t c các sinh v t (ho c

ít nh t là trong t t c các thành viên c a m t nhóm loài), các trình t nucleotide s
gi ng nhau ho c r t gi ng nhau

các cá th trong cùng m

gi a các loài. Vì v y, khu v c này có th

c s d ng cho nh n d ng các loài b ng

cách so sánh trình t c a nó trong sinh v t th nghi m v i trình t t tài li u tham
kh o t

d li

cs d

làm DNA mã v ch

th c v t

bao g m các trình t DNA trong l p th và DNA trong nhân. Hi n nay, các ch th
d a trên trình t DNA là m
c m t cách hi u qu [46].

nh các nguyên li u thu c th o


16

2.6
Các nguyên li u th

c có th

bao g

nh b

n th

i. Tuy nhiên,

c phân t d a vào vùng DNA mã v ch th hi n nhi

c

t tr i.
n th ng nh n di n nguyên li u thu c bao g m các
nh b ng các giác quan: V giác, th giác, kh u giác,
nh d a vào hình d ng, màu s c, k t c u. P
d

m hóa h c (ví d

-UV, HPLC-MS). Tuy
nh các loài m t cách d dàng

c bi t là trong các s n ph
công nghi p, ch

bi n. Các s n ph

ng c a các y u t nhi

trà, các lo i thu c th
d

,l

i qua ch bi n
c, các ch t ph

c d ng viên, d ng l ng thì không th

m hình thái, k t c

nh n di n vì các nguyên li u th

c

nghi n thành các m nh nh ho c ch thành d ng l ng, ngoài ra các thành ph n
hóa h c có ch a trong các m u có th b
u ki

ng c a các y u t

và b o qu n. Các loài có ch a các thành ph n hóa h

nên có th b nh m l

c áp d

nh s

chính xác không cao [1, 28]. DNA là m
b i các yêu t bên ngoài, có th tìm th y
ngh mã v ch DNA có kh

ng

i phân t

nh, ít b

ng

t t c các mô trên sinh v t [53]. Công

n di n loài t m t m u r t nh , t m

n

b ph n c a m t cá th k c các m u t m t cá th còn non, t các m
h ng ho c ngay c

i qua quá trình ch bi n

chính

xác tin c y cao [61].

2.7.
B n vùng mã v ch tiêu chu n (rbcL, matK, trnH - psbA và ITS
trung ch y

cv

ng sinh h c, b o t n và

ct p
c s d ng


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×