Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ TRÀ MI

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH ĐẠI GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS
KODAKARENSIS KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH - CNTP
: 2012 - 2016


Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ TRÀ MI

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS
KODAKARENSIS KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Lớp
: K44 - CNSH
Khóa học
: 2012 - 2016
Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Phạm Bằng Phƣơng

Thái Nguyên, năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của khoa Khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực
Phẩm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. Em đã thực tập tốt nghiệp
tại Phòng Nuôi Cấy Mô Tế Bào Thực Vật - Khoa Công Nghệ Sinh Học và
Công Nghệ Thực Phẩm- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài:
“Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase của vi
khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1”.
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự nỗ lực của bản thân em
còn nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ của ban giám hiệu Nhà trƣờng Đại Học Nông


Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ sinh học và công nghệ
thực phẩm, cùng sự tận tình giảng dạy của các thầy cô trong suốt 4 năm học.
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban
chủ nhiệm khoa và toàn thể các thầy cô giáo. Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ
lòng kính trọng, lòng biết ơn tới thầy giáo TS. Phạm Bằng Phƣơng ngƣời đã
tận tình hƣớng dẫn em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn chị Ma Thị Hoàn, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ tế
bào thực vật khoa Công Nghệ Sinh Học và công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại
HọcNông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực
hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tại đây.
Em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, ngƣời thân bạn bè đã động viên giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Do điều kiện và thời gian có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu
sót, kính mong các thầy cô đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài của em đƣợc
hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Trà Mi


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng ................................................................. 18
Bảng 3.2: Trình tự mồi ................................................................................... 18
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ............................................................ 27
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt PCR ...................................................................... 27
Bảng 4.1: Dải nhiệt độ chạy PCR .................................................................. 35


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Nơi phân lập ...................................................................................... 4
Hình 2.2: Vi khuẩn T. Kodakarensis kod1........................................................ 5
Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus ................................... 5
Hình 2.4: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 ........................................................................................................ 7
Hình 2.5: Enzyme protease ............................................................................. 10
Hình 2.6: Cấu trúc enzyme.............................................................................. 11
Hình 2.7: Sơ đồ phân loại enzyme protease.................................................... 12
Hình 3.1: Môi trƣờng nuôi cấy phân lập VK .................................................. 23
Hình 3.2: Phân tử Ethidium bromide .............................................................. 25
Hình 4.1a: Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn T. Kodakarensis ........................... 31
Hình 4.1b: Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số ............................ 32
Hình 4.2a: Thiết kế mồi .................................................................................. 32
Hình ảnh 4.2b: Kết quả điện di sản phẩm PCR .............................................. 33
Hình 4.3: Ảnh điện di kiểm tra nhiệt độ gắn mồi PCR ................................... 34
:


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

DNA

:Axit deoxiribonucleic

ARN

: Axit ribonucleic

ARNase : Ribonuclease
dNTP

: Deoxynucleoside triphosphate

EDTA : Ethylene diamine tetra – acetic acid
OD

: Optical Density (Mật độ quang học)

PCR

: polymerase chain reaction

SDS

: Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

: Tris- acetate- EDTA

E.coli

: Escherichia coli

Amp

: Ampicillin

EtBr

: Ethydium bromide

Bp

: base pair

Kb

: kilo base pair


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT................................................ iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
PHẦN I: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và nội dung của đề tài ................................................................ 2
1.2.1. Mục đích.......................................................................................... 2
1.2.2. Nội dung .......................................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................ 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................. 3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 4
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 .................... 4
2.1.1. Nguồn gốc ....................................................................................... 4
2.1.2. Phân loại .......................................................................................... 5
2.1.3. Đặc điểm chung về hệ gen .............................................................. 6
2.1.4. Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển ................................................. 9
2.2. Tổng quan về protein của TK 1284 ........................................................... 9
2.2.1. Enzyme proteae ............................................................................... 9
2.2.2. Hệ thống phân loại enzyme protease ............................................ 12
2.2.3. Ứng dụng ....................................................................................... 13
2.2.4. Aminopeptidase do gene Tk1284 của vi khuẩn T. Kodakarensi
KOD1 mã hóa.......................................................................................... 15


vi

2.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới ................................... 15
PHẦN 3: Đối tƣợng , nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ......................... 17
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 17
3.2.Nội dung ............................................................................................ 17
3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 18
3.5. Thiết bị ..................................................................................................... 18
3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19
3.5.1.phƣơng pháp so sánh trình tự protein……………………………21
3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy ................................................................... 24
3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết AND tổng số......................................... 234
3.5.5. Phƣơng pháp PCR ......................................................................... 26
3.5.4. Phýõng pháp ðiện di ...................................................................... 24
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
4.3. Kết quả kiểm tra nhiệt độ mồi ảnh hƣởng đên phản ứng PCR. ............... 34
4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .............................................................. 31
4.2. Nhân gene TK 1284 từ chủng vi khuẩn Thermococcus kodakaren KOD1
bằng phản ứng PCR......................................................................................... 32
4.4. Kết quả so sánh trình tự TK 1284 với các protein đã biết trên ngân hàng
NCBI bằng phần mềm Runblast và bioedit .................................................... 28
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 35
5.1. Kết luận .................................................................................................... 36
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1
I. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 1
II. Tài liệu tiếng Anh ......................................................................................... 1
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 4


1

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất càng nhiều và đƣợc sử dụng trong hầu hết
các lĩnh vực nhƣ: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…[1]
Hàng năm lƣợng enzyme đƣợc sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300
nghìn tấn với giá trị trên 500 triệu USD, đƣợc phân phối trong các ngành khác
nhau[1]. Phần lớn enzyme đƣợc sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc
loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy[2]. Khoảng 75% chế
phẩm là enzyme thủy phân, đƣợc sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự
nhiên. Ngành sản xuất các hóa chất công nghiệp dựa trên xúc tác sinh học đã
cho thấy có nhiều lợi thế so với tổng hợp hóa học, ví dụ nhƣ sản xu ất có chọn
lọc các đồng phân quang học hay là sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp các
phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu[3]. Việc sử dụng enzyme chịu nhiệt nhƣ là
chất xúc tác khi thiết kế quy trình chuyển hóa, chứa toàn bộ hệ thống enzyme
chịu nhiệt, cấu tạo nên chuổi phản ứng mà chúng ta muốn, sẽ làm biến tính
các enzyme nội sinh của tế bào và vì thế chúng ta chỉ cần một bƣớc chuẩn bị
để có thể có một hỗn hợp các enzyme chịu nhiệt. Thêm vào đó, do đặc tính
bền của enzyme chịu nhiệt nên chúng ta có thể hạn chế bất lợi cơ bản của sinh
chuyển hóa in vitro, là không có khả năng tổng hợp và tái tạo protein.
Protease là enzyme đƣợc sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất nhƣ: chế biến thực phẩm (làm đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt,
bổ sung để làm tăng chất lƣợng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ
phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế. Qua
nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhƣ là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều


2

hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế
việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Protease phân bố ở thực vật, động
vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở chế phẩm thu đƣợc sau quá trình
nuôi cấy sản xuất enzyme chƣa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein
chỉ chiếm từ 20-30 %[1]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong
hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả
hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có
khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Đặc biệt là
các vi khuẩn cổ sống môi trƣờng khắc nghiệt, có tính chống chịu với cả nhiệt
hay axít và kiềm, là nguồn tạo ra các enzyme có thể hoạt động dƣới những điều
kiện khắc nghiệt. Những enzyme phát hiện đƣợc tạo ra từ các vi khuẩn có khả
năng chịu nhiệt trên 130˚C, có thể tồn tại và phát triển ở những nơi có nồng độ
acid cao…. [1]với những khả nhƣ vậy nó rất có ý nghĩa trong nghiên cứu khoa
học, cho sự phát triển của các ngành sản xuất.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu tạo enzyme từ vi khuẩn này là cấp thiết,
đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme protease trong nghiên cứu nói chung và
công nghiệp xuất nói riêng là quan trọng và cấp thiết, xuất phát từ lý do trên,
tôi xin tiến hành đề tài: “Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa
enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis
KOD1” hy vọng sẽ khuyếch đại đƣợc dòng gene Tk 1284 mã hóa enzyme
aminopeptidase của vi khuẩn T. Kodakarensis đáp ứng nhu cầu cần thiết.
1.2. Mục đích và nội dung của đề tài
1.2.1. Mục đích
 Nghiên cứu gene Tk 1284 và enzyme peptidase do gen Tk 1284 của
vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa.
 Nhân nhanh gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 bằng phản ứng PCR.


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full
















Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×