Tải bản đầy đủ

Tách dòng Gene SBgLR Mã hóa Protein giàu LYSINE từ khoai tây. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

ĐINH THẾ ANH
Tên đề tài:
TÁCH DÒNG GENE SBgLR MÃ HÓA PROTEIN GIÀU LYSINE
TỪ KHOAI TÂY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K 44 - CNSH


Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 – 2016

Thái Nguyên - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

ĐINH THẾ ANH
Tên đề tài:
TÁCH DÒNG GENE SBgLR MÃ HÓA PROTEIN GIÀU LYSINE
TỪ KHOAI TÂY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K 44 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học


: 2011 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. PGS.TS: Nguyễn Đức Thành
2. TS: Phạm Bằng Phƣơng

Thái Nguyên - 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt
nghiệp này tôi đã nhận đƣợc sự quan tâm, hƣớng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy
cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS. Nguyễn Đức Thành –Phòng
Di Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa
Học Và Công Nghệ Việt Nam _ T.S. Phạm Bằng Phƣơng, Bộ Môn Công Nghệ
Sinh Học - Khoa Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm – Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên
Th.S. Trần Thị Lƣơng Cán bộ Phòng Di Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện
Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam ngƣời
đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
để tài cũng nhƣ trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Trƣởng phòng Phòng Di Truyền Tế Bào Thực
Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt
Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –
Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Phòng Di
Truyền Tế Bào Thực Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Và
Công Nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn
động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Đinh Thế Anh


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Năng suất protein và năng lƣợng của một số loài cây lƣơng thực .............4
Bảng 3.1: Danh mục các thiết bị ...............................................................................18
Bảng 3.2. Thành phần và nồng độ các chất cho phản ứng nhân gen SBgLR. ...........22
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme ...................................................24
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI và SacI ..........................26


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1. Hai dạng đồng phân quang học của lysine. [8]. ..........................................6
Hình 2.2. Cấu trúc không gian của L-lysine. [8].........................................................7
Hình 3.1 Kết quả tách DNA tổng số từ giống khoai tây Arkisigen đƣợc điện di trên
gel agarose 1%. (Giếng 1-3: DNA tổng số từ giống khoai tây Arkisigen; ...............28
M: Marker 1Kb). .......................................................................................................28
Hình 3.2 Kết quả nhân gen SBgLR từ DNA tổng số của giống khoai tây rkisigen
với cặp mồi đặc hiệu. (Giếng 1-3: gen SBgLR nhân từ 3 mẫu DNA của giống khoai
tây Arkisigen; M: Marker 1Kb). ...............................................................................29
Hình 3.3 Kết quả biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E. coli khả biến ...................30
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony PCR trên gel agarose 1% ......................31
Hình 3.5 Kết quả cắt plasmit bằng enzyme giới hạn BamHI và SacI đƣợc điện di
trên gel agarose 1% ...................................................................................................32
Hình 3.6 Trình tự gene SBgLR khi giải hai chiều ....................................................35
Hình 3.7 Trình tự gene SBgLR khi so sánh trên ngân hàng gen Quốc tế .................37
Hình 3.8 Kết quả dịch mã gene SBgLR tách dòng ...................................................38
Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự protein .................................................................39


iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kcalo

Kilocalo

PCS

polycloning site-vùng nhân dòng đa điểm cắt

X –gal

5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside

DNA

Deoxyribonucleic axit

dNTP

Deoxynucleotide Triphotphate

E. coli

Escherichia coli

BLAST

Basic Local Aligenment Search Tool

DHPS

dihydropicolinate synthase

Bp

Base pair – cặp base nitơ

Kb

Kilo base –kilo base nitơ

LB

Lauria Broth

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

PCR

Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng
trùng hợp

TAE

Tris- acetate- EDTA

EDTA

Etilenduamin tetraacetic acid

TE

Tris- EDTA

AK

Aspartate kinase


v

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2
1.3 Yêu Cầu. ...................................................................................................... 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 2
Ý nghĩa khoa học............................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY KHOAI TÂY ........................................ 3
2.1.1. Một số nghiên cứu về nguồn gốc cây khoai tây ...................................... 3
2.1.2. Một số nghiên cứu về giá trị dinh dƣỡng của cây khoai tây .................... 4
2.1.3 Protein trong khoai tây ............................................................................. 5
2.2 Tổng quan về Lysine ................................................................................... 5
2.2.1 Đặc tính lysine......................................................................................... 5
2.2.2. Cấu tạo của lysine ................................................................................... 6
2.2.3. Vai trò và ứng dụng của lysine ............................................................... 7
2.2.4 Các phƣơng pháp thu nhận lysine hiện này [22]. .................................... 8
2.3 Gene SBgLR ............................................................................................... 9
2.3.1 Cấu trúc của gene SBgLR ........................................................................ 9
2.3.2 Vai trò của gen SBgLR ............................................................................ 9
2.4 Tình hình nghiên cứu gen mã hóa protein giàu lysine ở Việt Nam và trên
Thế giới ............................................................................................................. 9
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới ......................................................... 9
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ......................................................... 11
2.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử sử để tách dòng gene ........................... 12
2.5.1 Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 12
2.5.2 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E. coli .................................................... 13
2.5.3 Kỹ thuật tách dòng gene......................................................................... 14


vi

2.5.4 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) .............................. 15
2.5.5 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit ...................................................... 16
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......17
3.1. Đối tƣợng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu ............................................ 17
3.1.1 Đối tƣợng ............................................................................................... 17
3.1.2 Hóa chất.................................................................................................. 17
3.1.3 Thiết bị ................................................................................................... 18
3.1.4. Phạm vi nghiên cứu:.............................................................................. 18
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................ 18
3.2.1. Địa điểm: ............................................................................................... 18
3.2.2.Thời gian tiến hành: ............................................................................... 19
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 19
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 19
3.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 19
3.4.2 Phƣơng pháp xác định nồng độ DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ ...... 20
3.4.3 Phƣơng pháp điện di trên gel agarose .................................................... 21
3.4.4 Phƣơng pháp nhân gen bằng PCR: ........................................................ 22
3.4.5 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ................................................................. 22
3.4.6 Phản ứng nối ghép gene vào vector tách dòng Pjet 1.2/blunt ................ 23
3.4.7 Phƣơng pháp biến nạp vector tạo dòng tái tổ hợp ................................. 24
3.4.8 Phƣơng pháp Tách chiết plasmid theo phƣơng pháp Sambrook và cộng
sự (1989).......................................................................................................... 25
3.4.9. Kiểm tra plasmit tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR .................................... 26
3.4.10 Phản ứng cắt sử dụng BamHI .............................................................. 26
3.4.11 Đọc trình tự gen đích và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen. ...... 26
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 27
4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số ............................................................... 27
4.2 Kết quả nhân dòng gen từ DNA tổng số và thiết kế cặp mồi đặc hiệu để
nhân gen SBgLR ............................................................................................. 28
4.3 Kết quả biến nạp gene vào E. coli ............................................................. 30


vii

4.3.1 Kết quả biến nạp gen SBgLR vào E. coli .............................................. 30
4.3.2 Kết quả colony PCR ............................................................................... 31
4.4 Kết quả giải trình tự .................................................................................. 33
4.4.1 So sánh sự giống nhau của gen SBgLR ở mức độ nucleotit .................. 33
4.4.2 So sánh sự giống nhau của gen SBgLR ở mức độ axit amin ................. 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................... 40
5.1. Kết luận .................................................................................................... 40
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 1


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong hơn thập kỷ qua, nhờ thành tựu to lớn của công nghệ gen, ngƣời ta đã
chuyển thành công những gen phân lập từ sinh vật vào những sinh vật khác để tạo
ra cơ thể biến đổi gen mang các đặc tính mong muốn. Sản phẩm biến đổi gen đang
đem lại những lợi nhuận kinh tế khổng lồ cho nhiều quốc gia.
Sử dụng công nghệ gen để cải tiến chất lƣợng protein ở thực vật là một ứng
dụng đầy triển vọng của công nghệ sinh học, vì các phƣơng pháp truyền thống còn
nhiều hạn chế. Việc tạo ra protein có tỷ lệ lysine cao là cách tiếp cận duy nhất để cải
tiến protein hạt [26].
Lysine là một trong 12 axit amin thiết yếu cho cơ thể con ngƣời , cần có
trong bữa ăn hằng ngày. Nó giúp tăng cƣờng hấp thụ và duy trì canxi, ngăn cản sự
bài tiết khoáng chất này ra ngoài cơ thể. Vì vậy, lysine có tác dụng tăng trƣởng
chiều cao, ngăn ngừa bệnh loãng xƣơng. Để có sức khỏe tốt protein giàu lysine rất
cần thiết, nhƣng con ngƣời và động vật đều không thể tự tổng hợp chúng mà phải
hấp thu từ chế độ ăn uống hàng ngày. Chế độ ăn uống thiếu protein trong thời gian
dài có thể dẫn đến tăng trƣởng kém, bệnh tật và trong trƣờng hợp nặng có thể gây tử
vong. Do đó, cải thiện thành phần protein trong thực vật là việc làm rất cần thiết
[26, 11].
Gen SBgLR đƣợc phân lập và tách dòng từ thƣ viện DNA genome của khoai
tây bằng việc sử dụng cDNA SB401 làm đoạn dò. Gen SBgLR có 3 exon và 2 intron
mã hóa cho protein gồm 211 amino acid, đây là gen mã hóa cho protein giàu lysine
tự nhiên với hàm lƣợng lysine lên tới 18,93%. Kết quả nghiên cứu bƣớc đầu cho
thấy chuyển các gen SBgLR, SB401 (từ khoai tây) dƣới sự điều khiển của promotor
đặc thù cho thể hiện protein dự trữ ở hạt ngô P19z đã gia tăng hàm lƣợng lysine từ
16,1 đến 54,8% [31, 17] so với đối chứng không chuyển gen. . Gần đây gen tự
nhiên mã hóa cho protein giàu lysine GhLRP (từ cây bông) cũng đƣợc phân lập, gen
này mã hóa cho protein giầu lysine (18,97% thể tích/thể tích) và cũng đã đƣợc


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full
















Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×