Tải bản đầy đủ

Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. (khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

NGUYỄN MINH THÀNH
Tên đề tài:
THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG
GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học


Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

NGUYỄN MINH THÀNH
Tên đề tài:
THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG
GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Lớp

:

K44 - CNSH



Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn:1. TS. Nguyễn Văn Hạnh
Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. ThS. Vi Đại Lâm
Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo,
bạn bè và người thân.
Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường
Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm, tập thể cán bộ Phòng Công nghệ phôi – Viện
Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
cùng toàn thể các thầy, cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ
năng quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học
Nông lâm Thái Nguyên.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS. Nguyễn Văn Hạnh – Phòng Công
nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học, ThS. Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn trực tiếp đề tài, các thầy đã
tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề
tài này.
Tôi xin được cảm ơn nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên, cùng các anh,
chị và các bạn sinh viên tham gia nghiên cứu tại – Phòng Công nghệ phôi –
Viện Công nghệ Sinh học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, thầy cô, bạn bè đã
ủng hộ về mặt vật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Minh Thành


ii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ARN

Acid ribonucleic – Một trong hại loại acid nucleic

CTAB

Cetyltrimethyl Amonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic Acid – Một trong 2 loại nucleic acid

DOX

Doxycycline

dsRNA
E.coli
LB
MLPA

Double strand RNA – RNA sợi đôi
Escherichia coli
Lauria Broth
Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification
(khuếch đại phụ thuộc mẫu dò)
Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi tổng hợp

PCR

chuỗi polymer (Phản ứng khuếch đại DNA trong ống
nghiệm)

µl
PCMV IE

PTGS
TeT-on

Microlit ( 1 µl = 10-3 ml)
Promoter encephalomyocarditis virus internal ribosome
entry site
Posttranscriptional gene silencing ( làm bất hoạt gene sau
phiên mã)
Vector pTet – DualON

TRE

Tetracycline -responsive

RNAi

RNA interference

SiRNA

Small interfeing RNA

RISC
IRES2
RNP

RNA-induced silencing complex ( phức hợp làm câm lặng
do RNA)
Internal ribosome entry site 2
Ribonucleoprotein


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1:Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài ..................................... 19
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-1.............................................. 24
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng cắt PJET1.2-2 ............................................. 24
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 26
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 27
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 27
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 28
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 29
Bảng 3.9: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 29
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng cắt.............................................................. 30
Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối ............................................................. 31


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của vector Tet- On ............................................................ 10
Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của vector Tet-On .............................................. 12
Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7].................................................. 13
Hình 3.1: Cấu trúc vector pJET1.2 ................................................................. 20
Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau khi được cắt bởi 2 enzyme HinIII và
Acc65I ............................................................................................................. 32
Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau khi được cắt bởi 2 enzyme HindIII
và Acc65I ........................................................................................................ 33
Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene 1 .................................................. 34
Hình 4.4: Kết quả so sánh với đoạn gene tra-2 ............................................... 34
Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 và đoạn DNA 2 trước khi nối T4 ....... 35
Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi được cắt bởi 2 enzyme 2)
BamHI và HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn 2 sau khi nối (Đường chạy 1 và 36
Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi được cắt bởi 2 enzyme
BamHI và HinIII sau khi được tinh sạch (đường chạy 1 và 2) ....................... 37
Hình 4.8: Kết quả vector pTRE – Tight – BI được tạo rỗng bằng 2 enzyme
BamHI và HindIII ........................................................................................... 38
Hình 4.9: Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight –
BI được cắt bởi 2 enzyme BamHI và HinIII (đường chạy số 2) .................... 39
Hình 4.10: Kết quả cắt vector pTet – DualON bằng 2 enzyme NsiI và XhoI
(Đường chạy số 1 và 2) ................................................................................... 40


v

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................... 3
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 3
1.2.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 4
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 4
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 4
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 5
2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 5
2.1.1 Muỗi biến đổi gene................................................................................... 5
2.1.2. Công nghệ RNAi ..................................................................................... 6
2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti
(Transformer-2 RNAi) ...................................................................................... 8
2.1.4. Vector Tet – On ..................................................................................... 10
2.1.5. Vector pTRE-Tight-BI .......................................................................... 13
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước ..................................... 15
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................... 16
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 17
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 17
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 17
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 17
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 17


vi

3.2.2. Thời gian tiến hành ............................................................................... 17
3.3. Hóa chất, thiết bị và vật liệu .................................................................... 17
3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 17
3.3.2. Thiết bị .................................................................................................. 19
3.3.3. Dụng cụ ................................................................................................. 19
3.3.4. Vật liệu .................................................................................................. 20
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 21
3.5.1. Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính trên muỗi Aedes
aegypti ............................................................................................................. 21
3.5.2. Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào
vector pTRE – Tight – BI ............................................................................................ 26
3.5.3. Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh............................................................ 29
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 32
4.1. Kết quả tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi
Aedes aegypti .................................................................................................. 32
4.1.1. Kết quả tạo đoạn DNA 2 từ vector pJET1.2-2...................................... 32
4.1.2. Kết quả tạo vector pJET1.2-1 rỗng ....................................................... 33
4.2. Kết quả chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới
tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector ........................................................ 35
4.2.1. Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau khi nối
đoạn DNA 2 .................................................................................................... 35
4.2.2. Kết quả vector pTRE – Tight – BI được nhân với số lượng lớn, cắt bằng
enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy
định tính trạng giới tính ................................................................................... 37
4.2.3. Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính trên muỗi
Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI ................................................. 38


vii

4.3. Kết quả tạo vector Tet – on hoàn chỉnh .............................................................. 40
4.3.1. Kết quả vector pTet – DualON được nhân với số lượng lớn, cắt bằng
enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi........................................................ 40
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 42
5.1. Kết luận .................................................................................................... 42
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Theo tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng
2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt
vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue). Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh do
muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes
aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do
muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lây lan trên 100 nước khu vực có khí hậu
nhiệt đới, cận nhiệt đới. Châu Mỹ cao nhất là 42 nước, châu Phi 20 nước, khu
vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đông Nam Á 7 nước và Địa Trung Hải 4
nước [1].
Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành. Từ những
năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển với số mắc bệnh
và chết ngày một tăng. Bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở
Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và
tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch [4], [5]. Dịch bệnh không
có chu kì rõ rệt, giữa các đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch vẫn xảy ra rải rác.
Để giải quyết vấn đề trên nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp
dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi
biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi biến đổi gene sẽ
được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tạo ra thế hệ muỗi con
bị khuyếm khuyết và chết trước khi trưởng thành. Các nhà khoa học Mỹ tại
Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu đã biến đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự
nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không có khả năng
tìm kiếm mục tiêu để hút máu. Nhóm nghiên cứu cho rằng muỗi có cơ quan
thụ cảm khứu giác gọi là orco, được xem là bộ phận cần thiết để phối hợp với


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full
















Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×