Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và Trực trùng mủ xanh Psedomonas aeruginosa. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

NGUYỄN KHẮC KHÁNH
Tên đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ
cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas
aeruginosa)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành/ngành:


Công nghệ Sinh học

Khoa

:

CNSH & CNTP

Khóa học

:

2012-2016

Thái Nguyên - 2016


i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

NGUYỄN KHẮC KHÁNH
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN
NHANH VÀ ĐỒNG THỜI TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus
VÀ TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Psedomonas aeruginosa)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành/Ngành: Công nghệ Sinh học
Lớp

: K44-CNSH


Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Giảng viên hƣớng dẫn:

BS. NGUYỄN THỊ HUYỀN
TS. NGUYỄN VĂN DUY

Thái Nguyên, năm 2016


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến BS. Nguyễn Thị Huyền,
Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên,
KTV. Nguyễn Thị Thủy, CN. Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện
Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ,giúp đỡ tôi và đã cung cấp các
chủng sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm thuộc khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn đã luôn ở bên cạnh động
viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Khắc Khánh


iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 23
Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu................................ 23
Bảng 3.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 24
Bảng 4.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng multilplex PCR trên các mẫu thu
thập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên ................................... 40


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus .................................... 5
Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa .................................. 9
Hình 4.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số của các chủng S.
aureus (A) và các chủng P. aeruginosa (B) ..................................................... 29
Hình 4.2. Kết quả điện di kiểm tra khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các
cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .................................................................. 31
Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các điều kiện phản ứng
khác nhau......................................................................................................... 33
Hình 4.4 . Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR sử
dụng khuôn của chủng S. aureus và P. aeruginosa ......................................... 35
Hình 4.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR ở
các nồng độ DNA pha loãng khác nhau.......................................................... 37
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khi sử dụng các khuôn khác
nhau ................................................................................................................. 38


v

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài.......................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài: .................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa đề tài ............................................................................................. 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1.Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa4
2.1.1. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus ........................................... 4
2.1.2. Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa .......................................... 9
2.2. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa trong nước và trên thế giới............................................................ 12
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus .................................. 12
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa .............................. 14
2.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa........................................................................................................ 17
2.3.1. Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus .................................... 17
2.3.1.3. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction). ............................... 18
2.3.2. Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa .......................... 19
2.4.Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR ...................................................... 20
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 22
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 22


vi

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 22
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu. .............................................................................. 22
3.2. Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu ................................................. 22
3.2.1.Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 22
3.2.2.Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 22
3.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 22
3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài. ......................................................... 22
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài ............................................................... 23
3.3.3. Dụng cụ thiết bị sử dụng trong qua trình thực hiện đề tài. ................... 24
3.4. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................... 24
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 25
3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA ............................................................... 25
3.5.2. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
aureus và Pseudomonas aeruginosa ................................................................ 26
3.5.3. Phương pháp xác định nồng độ tế bào .................................................. 27
3.5.3. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR
......................................................................................................................... 27
3.5.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR. ............................ 28
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 29
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu..... 29
4.2. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex PCR........................................................ 30
4.2.1. Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các cặp mồi
sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................ 30
4.2.2. Kết quả xác định điều kiện chung của phản ứng PCR sử dụng các cặp
mồi riêng rẽ ..................................................................................................... 32


vii

4.2.3. Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại của phản ứng multiplex PCR
......................................................................................................................... 35
4.2.4. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR ....... 36
4.2.5. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR ................ 38
4.3. Kết quả thử nghiệm phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa từ mẫu thu thập tại bệnh viện ....................................................... 39
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 41
5.1. Kết luận .................................................................................................... 41
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 42


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức và mối
tuân tâm hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Những nghiên
cứu gần đây cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm
viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh và tăng chi phí
điều trị. Thống kê cho thấy tỷ lNKBV khoảng 5-10% các nước phát triển và ở
một số nước đang phát triển tỷ lệ này lên đến 25% [30] và tỷ lệ này còn cao
hơn ở các khoa Hồi Sức Tích Cực. NKBV cũng làm gia tăng tỷ lệ tử vong
bệnh viện. Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng bệnh viện
là 37.000 ca/năm [14] , còn tại Mỹ tỷ lệ này lên tới 99.000 ca/năm. Các bệnh
nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao hơn với các bệnh
nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời các NKBV có thời gian nằm
viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày. Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng
gấp 2-4 lần so với các trường hợp không NKBV. Chi phí phát sinh do NKBV
tại Anh quốc là khoảng 1 tỷ USD còn tại Mỹ là 28-45 tỷ USD[11].
Staphylococcsu aureus và Pseudomonas aeruginosa đang là hai trong 6 tác
nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến hiện nay. Ngoài ra việc thực hiện
các quy trình phát hiện S. aureus và P. aeruginosa chủ yếu hiện nay bằng
phương pháp vi sinh. Phương pháp này thực hiện phức tạp qua nhiều công
đoạn nuôi cấy và kiểm tra sản phẩm thu được gặp khó khăn và có khả năng
nhầm lẫn các loại vi sinh vật với nhau. Trong khi đó việc xác định nhanh và
chính xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan trong cộng
đồng.
Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại kéo theo đó con người
ngày càng am hiểu hơn và giải thích rõ ràng các quan điểm và kỹ thuật về


2

sinh học phân tử. Qua đây việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào
các lĩnh vực của đời sống ngày càng rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử đã và
đang được ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đoán chính
xác và nhanh chóng xác định đúng vi sinh vật gây bệnh. Một số kỹ thuật sinh
học phân tử được ứng dụng rộng rãi như : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex
PCR, ELISA...trong đó kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao và thời gian cho kết
quả nhanh chóng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn và dựa trên điều kiện cơ sở vật chất của
khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông
Lâm Thái Nguyên tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu
vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas
aeruginosa).”
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
bằng kỹ thuật multiplex PCR.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài:
- Tách chiết được DNA tổng số của các chủng vi khuẩn S. aureus và P.
aeruginnosa.
- Tối ưu được phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S.
aureus và P. aeruginosa
- Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR trên các mẫu vi
khuẩn phân lập tại Bệnh viện.


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full
















Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×