Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do chlamydia trachomatis tại bệnh viện đại học y thái bình

MỞ ĐẦU
Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà
các nước trên thế giới đang đối mặt là bệnh lây truyền qua đường tình dục. Viêm
đường sinh dục do Chlamydia trachomatis được coi là bệnh lây truyền qua đường tình
dục đứng đầu trên thế giới. Nhiễm Chlamydia trachomatis thường gây viêm niệu đạo,
viêm cổ tử cung. Tuy nhiên nếu không điều trị có thể dẫn đến các biến chứng như
viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh do tổn thương ống
dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao.
Tổ chức Y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm
Chlamydia trachomatis được phát hiện mới [34]. Bệnh do Chlamydia trachomatis hay
gặp ở những người trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ.
Các nghiên cứu mới đây cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh này đang tăng lên. Tại Châu
Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis đã tăng gấp đôi,
tại Hoa Kỳ con số này cũng tăng 14% trong giai đoạn 2000-2005 [15, 18].
Ở Việt Nam trong khoảng vài năm gần đây vấn đề nhiễm khuẩn do Chlamydia
trachomatis mới được chú ý. Một vài nghiên cứu đưa ra tỷ lệ khoảng 30% các trường
hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đường âm đạo bất thường là do Chlamydia
trachomatis. Nguy hiểm nhất của nhiễm Chlamydia trachomatis qua đường sinh dục là
có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, người bệnh
hoàn toàn không biết mình nhiễm vi khuẩn [2,9].
Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis người ta thường dùng xét nghiệm

nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis. Tuy
nhiên xét nghiệm này có hạn chế là phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình
vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài.
Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật
sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của các
vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain
Reaction– PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều nghiên cứu
đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán
1


khác. Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định
sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân.
Với mong muốn đóng góp vào công tác chăm sóc sức khỏe nói chung và công
tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia
trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu:
- Chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi
khuẩn Chlamydia trachomatis.
- Xác định được tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo,
cổ tử cung.

2


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis.
Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp
Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9].
Về hình thái khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu
hoặc hình bầu dục, kích thước khác nhau, là vi khuẩn Gram âm có màng là
lipopolisaccharide. Vì thiếu một số enzyme tổng hợp các hợp chất cao năng sử dụng
cho tế bào, vi khuẩn này phải ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót
bên ngoài tế bào.
Hệ gen của Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.042.519 nucleotide
với 894 trình tự mã hóa cho protein.

Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis
( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains
among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol. 15.(9))

Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa 7 đến 10 bản sao của plasmid có
kích thước 7.5 kb. Trình tự nucleotide của plasmid là trình tự bảo thủ cao (có dưới 1%
nucleotide thay thế), chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá các gen và
các kháng nguyên. Mặc dù chức năng của plasmid còn chưa xác định hết nhưng trình
3


tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong tế bào chứng tỏ nó có vai trò quan trọng
đối với vi khuẩn C.trachomatis.
C.trachomatis được chia thành 15 loại tuýp huyết thanh khác nhau bao gồm:
Tuýp huyết thanh (A-K), L1, L2, L3, Ba, Da, Ia và L2a. Trong đó tuýp A, B, Ba và C
gây bệnh mắt hột. Tuýp D, E, F, G, H, I, J và K gây bệnh viêm đường sinh dục. Tuýp
L1, L2 và L3 gây bệnh lympho hạt, một bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu ở bẹn
[2,9].
Chu kỳ phát triển của C.trachomatis trong bào tương tế bào kéo dài 48-72 giờ
[34]. Vòng đời của C.trachomatis gồm 2 giai đoạn: Thể cơ bản và thể lưới.
- Thể cơ bản (Elementary Body- EB) là những tế bào tròn có đường kính
khoảng 0.3µm, nhân đậm. Thể này xâm nhập vào các tế bào theo kiểu thực bào.
- Thể lưới (Reticulate Body- RB): Sau khi xâm nhập vào tế bào C.trachomatis
chuyển hóa nhờ tế bào và tạo thành thể lưới (đường kính 1µm), sinh sản theo hình
thức phân đôi kiểu trực phân khoảng 2-3 giờ một lần. Sau đó thể lưới lại chuyển thành
thể cơ bản và giải phóng khỏi tế bào thông qua hình thức ngoại tiết bào (exocytosis).
Thông thường mỗi thể lưới giải phóng 100-1000 thể cơ bản rồi tiếp tục xâm nhập vào
các tế bào mới.

Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek).
4


Đường truyền bệnh:
Vi khuẩn C.trachomatis là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả
năng sống sót ngoài tế bào nên đường truyền chủ yếu là đường tình dục hoặc lây từ mẹ
sang con khi người mẹ mang thai bị nhiễm C.trachomatis.
Khả năng gây bệnh:
C.trachomatis có khả năng gây nên 2 bệnh chính ở người: Bệnh mắt hột và
bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, trong đó bệnh sinh dục tiết niệu do nhiều tuýp (D,
E, F, G, H, I, J và K) gây ra, tăng nhanh số lượng người mắc.
Trẻ sơ sinh có thể bị mắc bệnh viêm kết mạc hoặc viêm phổi do C.trachomatis
nếu bị lây từ mẹ.
Ở phụ nữ
Có tới 75% phụ nữ không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng và triệu chứng nếu
có cũng không điển hình [3], nên việc chẩn đoán và sàng lọc nhiễm C.trachomatis đơn
thuần dựa vào triệu chứng lâm sàng hoàn toàn không khả thi. Cho đến khi có biểu hiện
viêm vùng chậu hoặc khi bệnh nhân khám vô sinh phát hiện có tổn thương ống dẫn
trứng thì C.trachomatis đã gây biến chứng khó phục hồi. Vì vậy cần thiết phải có
những phương pháp chẩn đoán chính xác và phù hợp giúp phát hiện C.trachomatis
nhằm ngăn chặn những hậu quả mà nó gây ra.
Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis có thể gây viêm âm đao, cổ tử cung và niệu
đạo. Các biến chứng thường gặp ở bệnh nhân nhiễm C.trachomatis mạn tính bao gồm:
- Tắc vòi trứng ở phụ nữ: Một trong những nguyên nhân gây tắc vòi trứng là
do viễm nhiễm ở vòi trứng, buồng trứng, dây chằng quanh tử cung vòi trứng do
C.trachomatis.
- Chửa ngoài tử cung: Nguyên nhân viêm nhiễm vòi trứng do C.trachomatis
khiến phôi thai tắc ngay tại điểm hẹp. Phôi thai lớn dần lên, đến một mức nào đó sẽ
phá vỡ các mạch máu nơi nó đậu lại trên vòi trứng, gây chảy máu dữ dội trong ổ bụng,
có thể làm thai phụ tử vong nhanh chóng. Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ
nhiễm C.trachomatis bị chửa ngoài tử cung.
5


- Viêm vùng chậu: Phần lớn, viêm vùng chậu do vi khuẩn lậu và C.trachomatis
gây ra. Viêm vùng chậu là một bệnh thầm lặng, nhiều tác giả thống kê cho thấy có tới
40% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị viêm nhiễm vùng tiểu khung, trong số đó có 20%
bị vô sinh làm ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng cuộc sống.
- C.trachomatis có thể kết hợp cùng với HPV (Human papilloma virus) – một
virus gây u nhú có khả năng đưa đến ung thư cổ tử cung.
Ở nam giới
Ở nam giới triệu chứng lâm sàng của nhiễm C.trachomatis càng mờ nhạt hơn,
biểu hiện đầu tiên là viêm niệu đạo có mủ mà giới chuyên khoa gọi là viêm niệu đạo
không do lậu, sau đó có thể dẫn đến viêm mào tinh hoàn. Tại túi tinh, vi khuẩn gây
độc cho tinh trùng, làm giảm số lượng tinh trùng, đời sống tinh trùng ngắn lại, chất
lượng giảm xuống. Đây chính là lý do gây vô sinh nam.
Tuy nhiên, vì C.trachomatis lây qua đường tình dục nên nam giới nhiễm bệnh
nếu không được phát hiện và điều trị sẽ là nguồn tái nhiễm cho bạn tình. Ngoài ra, một
số nghiên cứu còn cho thấy C.trachomatis ở nam giới có khả năng bám vào tinh trùng
và theo tinh trùng đi qua cổ tử cung lên ống dẫn trứng, giúp phát tán C.trachomatis
trong vòi trứng của phụ nữ.
1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32]
1.2.1. Nuôi cấy
Để phát hiện C.trachomatis, người ta có thể dùng biện pháp nuôi cấy để chờ vi
khuẩn gia tăng số lượng. C.trachomatis không phát triển ngoài tế bào sống được nên
không thể nuôi cấy theo phương pháp thường dùng mà phải tiến hành nuôi cấy trên
các tế bào như McCoy hoặc Hela 229, tế bào nhau thai...
- Đối với bệnh mắt hột, người ta lấy nang bằng cách nạo các nang rồi cấy vào
các tế bào nhau thai người để phát hiện các hạt vùi trong nguyên sinh chất của tế bào.
- Đối với bệnh viêm sinh dục– tiết niệu: lấy mủ chất tiết niệu đạo (nam giới);
chất tiết cổ tử cung, âm đạo (nữ giới) nuôi cấy trong môi trường có chứa tế bào
McCoy hoặc Hela 229 ở 370C- 5% CO2. Quan sát tính chất xâm nhiễm sau 48 giờ nuôi
6


cấy và phát hiện C.trachomatis bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: ủ với kháng thể
đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide (LPS) hoặc
protein màng (major outer membrane protein- MOMP).
Xét nghiệm này được đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong nhóm xét nghiệm vì có
độ đặc hiệu rất cao (100%), cho phép lưu giữ vi khuẩn làm kháng sinh đồ phát hiện
chủng kháng thuốc. Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thời gian dài, phải
bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, đội ngũ
cán bộ thành thạo về nuôi cấy tế bào. Bên cạnh đó xét nghiệm này có độ nhạy thấp
(70-85%), thấp hơn so với khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests–
NAATs) [32].
1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays– EIAs)
Phương pháp này dựa trên phản ứng hóa miễn dịch giúp phát hiện kháng
nguyên LPS của C.trachomatis bằng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng được đánh dấu
bằng enzyme, phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hoạt hóa enzyme chuyển cơ chất
không màu thành có màu, phát hiện được bằng phản ứng tạo màu hay đo bằng quang
phổ kế.
Khi mẫu xét nghiệm được thêm vào màng, kháng nguyên của C.trachomatis sẽ
gắn với kháng thể được phủ sẵn trên màng. Sau đó bổ sung kháng thể đặc hiệu với
C.trachomatis liên kết với kháng nguyên đã được bắt giữ bởi kháng thể trên màng.
Dung dịch enzyme được thêm vào sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu của
C.trachomatis. Bước tiếp theo là rửa để loại bỏ các thành phần không gắn với màng.
Bổ sung cơ chất đặc hiệu với enzyme vào màng. Nếu có kháng nguyên, cơ chất phản
ứng với enzyme tạo sự thay đổi màu sắc phát hiện và đo được bằng máy quang phổ kế.
Xét nghiệm này có hiệu quả với quy mô sàng lọc lớn, không đòi hỏi vi khuẩn
còn sống, rẻ tiền hơn nuôi cấy và yêu cầu kỹ năng xét nghiệm vừa phải. Tuy vậy nó có
nhược điểm là không sử dụng được với nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp
và âm đạo do giảm độ nhạy và độ đặc hiệu với các mẫu này, được sử dụng sàng lọc
quần thể có tỷ lệ dương tính thấp (≤ 5%) [32]. Xét nghiệm này có độ nhạy thấp hơn
NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào.

7


1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody- DFA)
Phương pháp này sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu được đánh
dấu huỳnh quang để phát hiện trực tiếp kháng nguyên vỏ LPS hay kháng nguyên mã
hóa protein màng MOMP.
Mẫu bệnh phẩm được thu thập, mẫu được đánh dấu tên và địa chỉ bệnh nhân. Sau
đó, mẫu được phết nhẹ nhàng lên lam kính và được cố định ngay lập tức bằng
methanol. Sau khi được làm khô trong không khí từ 2 đến 3 phút, lam kính được vận
chuyển đến phòng thí nghiệm, nhuộm bằng kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu
với C.trachomatis. Kháng thể liên kết đặc hiệu với C.trachomatis có trong mẫu. Tiếp
đó là bước rửa để loại bỏ những kháng thể không liên kết. Quan sát dưới kính hiển vi
huỳnh quang, mẫu dương tính C.trachomatis dạng cơ bản màu xanh táo tương phản
với màu đỏ đất của tế bào.
Xét nghiệm áp dụng được cho nhiều loại mẫu khác nhau, không yêu cầu vi khuẩn
còn sống, đòi hỏi kỹ năng xét nghiệm vừa phải, thích hợp chẩn đoán trên các đối
tượng có nguy cơ cao. Sự thành công của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc
vào nhiều yếu tố: Có kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis, đủ
kháng thể để kết hợp, kính hiển vi huỳnh quang chất lượng tốt. Kỹ thuật này không
thích hợp cho số lượng mẫu lớn và đối tượng có nguy cơ thấp, độ nhạy thấp hơn
NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào [32].
1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs).
NAATs là kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong y học để
phát hiện sự tồn tại của các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm, độ nhạy trên 90%,
độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào. Kỹ thuật NAATs có ưu điểm là có thể áp
dụng ở những nơi không có khả năng nuôi cấy, xét nghiệm không đòi hỏi vi khuẩn còn
sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày).
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là xét nghiệm có
độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho sự phát hiện C.trachomatis [21]. Nhiều
nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm
chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác
8


định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch quết cổ tử cung hoặc trong mẫu nước tiểu của
bệnh nhân với các cặp mồi trên plasmid, trên gen mã hóa protein màng hoặc trên
rRNA. Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể giảm độ nhạy do sự có mặt các chất ức chế
có trong mẫu hoặc không đủ độ nhạy để phát hiện mẫu chứa quá ít dạng cơ bản của vi
khuẩn C. trachomatis. Do vậy có thể tạo ra sản phẩm âm tính giả. Theo Saiki và cộng
sự (1985) [23], để phát hiện 25 ng DNA trên gel agarose nhuộm ethidium bromide sau
35 chu kỳ khuếch đại từ 10 phân tử ban đầu ở mẫu cần hiệu quả khuếch đại cao hơn
90%.
Nested PCR là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi thay vì một cặp mồi như kỹ thuật
PCR cổ điển. Cặp mồi thứ hai được thiết kế nằm trong đoạn gen mà cặp mồi thứ nhất
khuếch đại. Quá trình chạy PCR lần đầu không khác gì PCR thông thường. Sản phẩm
của phản ứng PCR lần đầu sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai cùng với cặp
mồi thứ hai. Kết quả sau hai lần PCR thu được sản phẩm đặc hiệu hơn nhiều. Kỹ thuật
này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện vi khuẩn ở mật độ rất thấp mà các phương
pháp thông thường khó có thể phát hiện được (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu). Đây được
xem là “tiêu chuẩn vàng” mới trong phát hiện vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm do
độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó. Theo Pamela Cribb và cộng sự (2002) [22], xét
nghiệm này có thể phát hiện DNA tương ứng với nhỏ hơn 10 dạng cơ bản (EB) của vi
khuẩn C.trachomatis trong hỗn hợp phản ứng, cho phép phát hiện kết quả âm tính giả
và đáp ứng được với sự thay đổi ở các phòng thí nghiệm khác nhau.
Mẫu được xử lý để tách DNA của C.trachomatis. Các thành phần của phản ứng
PCR được thiết lập gồm primer, dNTP, Taq polimerase, MgCl 2. Các primer liên kết
với DNA đích đặc hiệu của C.trachomatis. Enzym Taq polymerase kéo dài mỗi trình
tự DNA sử dụng các nucleotide tự do để tạo trình tự DNA bổ sung. Quá trình khuếch
đại này xảy ra khi hỗn hợp phản ứng được ủ trong máy luân nhiệt. Mỗi chu kỳ làm
tăng số lượng DNA đích theo hàm mũ. Sau khi khuếch đại, sản phẩm lần 1 được sử
dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Sau phản ứng PCR lần 2, sản phẩm được
điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và phân tích trên hệ thống chụp
ảnh gel .

9


Xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên mẫu nước tiểu
(độ nhạy của mẫu này thấp hơn mẫu dịch phết), nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ
quan hô hấp và âm đạo.
Xét nghiệm này độ nhạy trên 90%, độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế
bào, có ưu điểm là có thể áp dụng ở những nơi không có khả năng nuôi cấy, không đòi
hỏi vi khuẩn còn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày) [13, 17]. Nhược điểm
của xét nghiệm này là yếu tố ngoại nhiễm cao, tuy vậy có thể tránh bằng cách sử dụng
đầu côn lọc và dùng enzyme uracil- N- glycosylase trong phản ứng.
1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nước
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Số người
nhiễm trên
100.000

Năm

Hình 1.3. Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở một số nước Châu Âu
Theo ECDC năm 2009 [15], tỷ lệ dương tính C.trachomatis ở một số nước
Châu Âu thay đổi từ năm 1998 đến năm 2007. Ở Thụy Điển và Phần Lan, nơi những
nghiên cứu được tiến hành từ đầu những năm 90, tỷ lệ này giảm ở đầu những năm 90
(tương tự với tỷ lệ các bệnh lây truyền qua đường tình dục khác ở Châu Âu) do sự thay
đổi thói quen sinh hoạt tình dục và mối lo từ hiểm họa AIDS. Tỷ lệ này tăng lên từ
năm 1995. Tại Anh và Đan Mạch, tỷ lệ này tăng dần theo mỗi năm, nguyên nhân có
10


thể do không được nghiên cứu từ đầu những năm 90, sử dụng các chẩn đoán có độ
nhạy cao hơn, đối tượng nghiên cứu nằm trong các nhóm có nguy cơ cao.
Theo một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này tại Châu Âu [20] cho thấy:
Phần Lan
Nghiên cứu 298 phụ nữ tuổi từ 18 đến 40, từ năm 1977 đến năm 1980 tại một
trung tâm y tế sinh viên tại Đại học Helsinki. Những phụ nữ trên được chăm sóc y tế
về các biện pháp tránh thai, vấn đề nội tiết và vô sinh hoặc đã được kiểm tra dịch phết
cổ tử cung định kỳ (đối với bệnh nhân có triệu chứng). Các xét nghiệm được sử dụng
là nuôi cấy dịch niệu đạo và dịch phết cổ tử cung. Bỏ qua mô tả về cách lựa chọn, tỷ lệ
đáp ứng, lý do đáp ứng và loại trừ. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis là 6%.
Thụy Điển
Nghiên cứu thứ nhất (Persson et al., 1991) liên quan đến 306 phụ nữ tuổi từ 12
đến 25 (trung bình 22 tuổi) tại một phòng khám thai từ năm 1989 và 1990. Nuôi cấy
được sử dụng làm phương pháp xét nghiệm, tỷ lệ dương tính C.trachomatis là 6%.
Nghiên cứu thứ hai (Svensson et al., 1994) đã so sánh hai nhóm phụ nữ nghiên cứu
vào năm 1991- 1992. Nhóm A bao gồm 751 học sinh trung học với độ tuổi 16 đến 20
năm (trung bình 18 tuổi). Các tỷ lệ đáp ứng là 77%. Nhóm B bao gồm 619 phụ nữ đến
khám tại phòng khám kế hoạch hóa gia đình thanh thiếu niên và độ tuổi phù hợp với
nhóm A. Cả hai nhóm đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng xét nghiệm EIA. Tỷ lệ
dương tính C.trachomatis là 2% trong nhóm A và 6% trong nhóm B.
Vương quốc Anh
Nghiên cứu được tiến hành đầu tiên (Smith et al., 1991) liên quan đến 197 phụ
nữ tuổi từ 19 đến 58 (trung bình 30 tuổi) tại một phòng khám soi cổ tử cung. Nghiên
cứu cho thấy không có sự khác biệt giữa phụ nữ có dịch phết cổ tử cung bình thường
và bất thường. Bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung được sử dụng để nuôi cấy. Tỷ lệ
dương tính C.trachomatis là 12%. Nghiên cứu thứ hai (Thompson và Wallace, 1994)
liên quan đến 287 phụ nữ từ 15 tuổi đến 40. Các mẫu dịch phết cổ tử cung đã được xét
nghiệm bằng kỹ thuật DFA. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ nhỏ hơn 30 tuổi là
3.5% (5/145). Tỷ lệ dương tính C.trachomatis chung là 1.7%. Nghiên cứu thứ ba
11


(Hopwood và Mallinson, năm 1999) đánh giá trên các phụ nữ 16 đến 25 tuổi bằng xét
nghiệm DFA. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis là 3.9%. Nghiên cứu thứ tư (Kirkwood et
al., 1999) nghiên cứu phụ nữ độ tuổi nhỏ hơn 20 tại phòng khám kế hoạch hóa gia
đình. Các mẫu được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Cỡ mẫu là 97 với 65 phụ nữ đến từ
thành phố. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này ở phụ nữ thành phố là 3% và thị trấn nông thôn
12.5%. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis tổng thể là 6.2%.
Sự phổ biến của C.trachomatis phụ nữ không có triệu chứng ở Châu Âu dao
động từ 1.7 đến 17% tùy thuộc vào bối cảnh và quốc gia. Tỷ lệ dương tính C.
trachomatis là 6% ở phụ nữ sử dụng biện pháp tránh thai và 4% với đ ối tượng phụ nữ
xét nghiệm dịch phết cổ tử cung [15].
James B. Mahony và cộng sự (1992) nghiên cứu tỷ lệ dương tính C.trachomatis
ở nam giới ở những địa điểm được lựa chọn tại Hoa Kỳ [18]. Sự sàng lọc phụ thuộc
một phần vào chi phí sàng lọc C.trachomatis cũng như phương pháp sàng lọc. Sàng
lọc ở những địa điểm có tỷ lệ nam giới dương tính cao sẽ nâng cao chất lượng chương
trình kiểm soát C.trachomatis. Đánh giá các chương trình sàng lọc vi khuẩn này trong
số những người đàn ông không có triệu chứng tại các phòng khám từ năm 1995 đến
tháng 6 năm 2007, thông qua PubMed thu được kết quả: Tỷ lệ dương tính trung bình
tổng thể là 5.1%. Mức cao nhất được quan sát thấy ở nam giới thử nghiệm tại các cơ
sở giam giữ trẻ vị thành niên (7.9%) và người lớn (6.8%), ở người da đen (6.7%), 1519 tuổi (6.1%) và 20-24 tuổi (6.5%). Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis trên nam giới cao ở
những địa điểm nhất định.
C.trachomatis là bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất ở Canada
[27]. Có gần 63.000 trường hợp nhiễm C.trachomatis được báo cáo vào năm 2004,
con số cao nhất kể từ khi vi khuẩn này được đề cập vào năm 1990. Tỷ lệ nhiễm
C.trachomatis ở Canada đã tăng hơn 70% từ năm 1997. Tuy nhiên, những con số này
đánh giá thấp gánh nặng thực sự của bệnh như một số bệnh nhiễm trùng (40% đến
70% các bệnh nhiễm trùng) là không có triệu chứng nên không bị phát hiện. Có một sự
khác biệt giới tính trong tỷ lệ nhiễm C.trachomatis, phụ nữ chiếm hơn hai phần ba các
trường hợp được báo cáo vào năm 2004. Trong khi số lượng các bệnh nhiễm trùng
C.trachomatis báo cáo ở phụ nữ cao hơn nam giới, tỷ lệ lây nhiễm đang gia tăng
nhanh hơn ở nam giới. Từ năm 1997, tỷ lệ ở nam giới nhiều hơn gấp đôi, từ 59 đến
12


129.5 trên 100.000 người, trong khi tỷ lệ ở phụ nữ tăng ít hơn một nửa, từ 168 đến 263
trên 100.000. Sự chênh lệch giới tính có thể một phần là do số phụ nữ được sàng lọc vi
khuẩn C.trachomatis lớn hơn. Việc cải thiện công nghệ chẩn đoán có thể sử dụng mẫu
nước tiểu để xét nghiệm dự đoán sẽ làm tăng số lượng đàn ông kiểm tra. Tỷ lệ thanh
thiếu niên nhiễm C.trachomatis cũng không tương xứng, gần 70% của tất cả các
trường hợp được báo cáo xảy ra ở tuổi từ 15 đến 24 trong nghiên cứu. Trong năm
2004, tỷ lệ nhiễm trong thanh thiếu niên từ 15 đến 19 tuổi là 847 trên 100.000. Tỷ lệ là
1.087 trên 100.000 trong độ tuổi 20-24. Các vùng lãnh thổ phía Bắc nói riêng phải
chịu tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao, trung bình năm 2003 là gần 8 lần so với toàn
quốc. Nunavut có tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao nhất ở Canada vào năm 2003 (2.520
trên 100.000) trên 13 lần mức trung bình toàn quốc [27].
Năm 2004 ở Trinidad và Tobago bằng phương pháp nested multiplex PCR với
các cặp mồi HO1, HO3, Chlam5/Chlam3, KL1/KL2 và Gon 5/Gon 3, các tác giả đã
phát hiện đồng thời hai loại vi khuẩn lậu và C.trachomatis trong mẫu nước tiểu của
phụ nữ mang thai [19]. Các mẫu nước tiểu được thu thập từ tháng 3 đến tháng 9 năm
2004 từ 273 phụ nữ mang thai khỏe mạnh ở các phòng khám tư nhân và bệnh viện. Tất
cả phụ nữ mang thai có mặt trong phòng khám tại thời điểm lấy mẫu đã được mời
tham gia. 15-20 ml mẫu nước tiểu đầu dòng được thu thập, bảo quản ở 4°C, vận
chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ, và bảo quản ở -20°C cho đến khi
DNA được tách chiết (trong vòng hai tháng). DNA từ nước tiểu được chuẩn bị bằng
cách sử dụng Chelex 100 (Sigma Chemical Co, St Louis, Hoa Kỳ). Phản ứng PCR thứ
nhất và nested multiplex PCR được tối ưu hóa ở các nồng độ MgCl 2 1.5; 2 và 3 mM, ở
nhiệt độ thay đổi từ 45°C đến 65°C (sử dụng máy Gradient Master Cycler Eppendorf)
với mồi phát hiện vi khuẩn lậu hoặc C.trachomatis. Để tránh nhiễm, sử dụng bốn
phòng riêng biệt, một để pha mix, một để chuẩn bị mẫu và PCR lần 1, một tạo phản
ứng nested PCR và một phòng điện di. Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel
agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và quan sát. Phản ứng PCR đầu tiên dùng 0.2
mM mỗi loại dNTP; 3 mM MgCl 2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi HO1, HO3, Chlam5 (5'CATTATGT-CGGAGTCTG-AGC- 3’), Chlam3 (5'-GGATGACTCAAGGAATAGTCG- 3’), 1 µl Internal Amplification Control (IAC), 0.4 pmol/µl mồi IAC (5'TGTTTGACAGCTTATCAT), 5 µl DNA mẫu, 0.5 U Taq polymerase, và nước khử
ion đến 25 µl với chu trình nhiệt 94°C/15s, 60°C/30s, 72°C/60s, 40 chu kỳ. Phản ứng
13


nested PCR chứa 0.2 mM mỗi loại dNTP; 2 mM MgCl 2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi KL1,
KL2, Gon5 (5'-GTTCT-TGACGCTCC-ATATCG- 3’) và Gon3 (5'-ACGAGGCATTGAAGCAAAGC- 3’); 0.4 pmol/µl IAC; 1 µl sản phẩm PCR lần 1; 0.5 U Taq
polymerase, nước khử ion đến 25 µl, chu trình nhiệt 94°C /15s, 58.5°C/30s,72°C/30s,
40 chu kỳ. Kết quả ở PCR lần 1 là 21 mẫu dương tính C.trachomatis và 1 mẫu nhiễm
cả C.trachomatis và lậu. Kết quả phản ứng nested multiplex PCR thu được mẫu dương
tính C.trachomatis là 57 mẫu (20.9%), trong đó 5 mẫu nhiễm cả hai loại vi khuẩn trên.
Kết quả này chứng tỏ multiplex nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn hẳn
phản ứng PCR đơn.
Farhad B. Hashemi, Babak Pourakbari và Javad Zaeimi Yazdi [16] nghiên cứu
tổng cộng 123 phụ nữ đã kết hôn (tuổi từ 20-55) với triệu chứng viêm cổ tử cung đến
khám tại phòng khám sản phụ khoa của bệnh viện Mirza Kouchek Khan ở Tehran,
Iran, từ giữa tháng 12/2004 đến tháng 6/2005, chủ yếu do đau vùng chậu và (hoặc) tiết
dịch âm đạo. Tất cả những phụ nữ điều trị kháng sinh trong vòng ba tuần trước khi đến
khám được loại trừ khỏi nghiên cứu. Người tham gia đồng ý hoàn thành một bảng câu
hỏi về nhân khẩu học và lịch sử bệnh lây truyền qua đường tình dục trước khi kiểm tra
cổ tử cung. Sau khi loại bỏ chất nhầy cổ tử cung, mẫu dịch cổ tử cung được thu thập,
lưu trữ ở -20°C. DNA chiết xuất bằng DIAtom Prep100 kit (IsoGene Inc, Moscow,
Nga) và bảo quản tại -20°C cho đến khi sử dụng. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn 377
bp của cryptic plasmid với chu trình nhiệt: 94°C/3.5 phút; (94°C/30s, 52°C/30s,
72°C/3 phút) x 30 chu kỳ trong 25 μl đệm phản ứng PCR (bao gồm 10 mmol/l Tris,
pH 8,3; 50 mmol/l KCl; 2.5 mmol/l MgCl 2 và 0.1% gelatin); 0.2 mmol/l mỗi loại
dNTP; 2.5 U Taq DNA polymerase, và 0.5 μmol/µl mỗi loại mồi BP1 (5’AACCGTTTTTAATAGTGGCA-3’) và BP2 (5’-TTCTGGCCAAGAATTATCC-3’).
Tỷ lệ nhiễm trùng sinh dục do C.trachomatis trên phụ nữ đã kết hôn ở Iran là 17%
(cao hơn tỷ lệ 7% báo cáo tại nước này vào đầu những năm 1980). Mặc dù các bệnh
nhân trong nghiên cứu không phải là đại diện chung dân số (bao gồm cả phụ nữ không
có triệu chứng), hiện tại tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao hơn so với tỷ lệ 4-11% tại
Slovenia, Hà Lan, Colombia, Canada, và Hoa Kỳ. Sự khác biệt tỷ lệ trong nghiên cứu
này so với gần đây báo cáo từ Tehran có thể liên quan đến sự cải thiện độ nhạy của xét
nghiệm cũng như đối tượng bệnh nhân và các mẫu phân tích. Kết quả cần được khẳng
định bởi cỡ mẫu lớn hơn.
14


Theo các công trình nghiên cứu của Gaydos CA, Svensson LO [20], tần suất
nhiễm C.trachomatis cao gặp ở đối tượng trẻ dưới 25 tuổi, có lẽ do nam nữ thanh niên
các nước Châu Âu thường có quan hệ tình dục tự do ngoài hôn nhân, vì vậy họ dễ mắc
các bệnh lây truyền qua đường tình dục trong đó có nhiễm C.trachomatis. Tỷ lệ nhiễm
vi khuẩn này ở người lớn tại Nam Thái Bình Dương là 73%, Papua New Guinea là
20%, Nhật Bản 7%, Senegan 7%.
Một nghiên cứu của Achchhe L Patel và cộng sự [11] trường đại học y khoa
Indiana, Ấn Độ sử dụng các phương pháp phát hiện vi khuẩn C.trachomatis như
Roche Amplicor test, DFA và PCR. Trong suốt quá trình nghiên cứu (2003–2009), tỷ
lệ bệnh nhân nhiễm C.trachomatis dao động từ 24.0% đến 30.0%. Các phụ nữ hành
nghề mại dâm ở Surat, Ấn Độ, có tỷ lệ dương tính (xét nghiệm bằng PACE2 test) là
8.5%, trong khi ở Ahmedabad, tỷ lệ này tăng gấp đôi. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm
C.trachomatis trong quần thể nghiên cứu ở thủ đô của Ấn Độ chỉ chiếm 4.0% mặc dù
tỷ lệ mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục là 36.5%. Tỷ lệ này tương tự với các
nghiên cứu trên bệnh nhân ở Azerbaijan 3.1% và Bangladesh 3.4%. Tỷ lệ nhiễm cao
được đề cập ở Manila 23.3%, Cebu, Philippines 37.0% và 14.0% ở Nicaragoa [11] .
Anahita Jenab và cộng sự (năm 2008) [12] nghiên cứu giá trị chẩn đoán PCR và
ELISA trên vi khuẩn C.trachomatis ở phụ nữ không có triệu chứng và triệu chứng tại
Isfahan, Iran nhằm xác định sự hiện diện của C.trachomatis bằng phản ứng chuỗi
trùng hợp polymerase (PCR) và ELISA. Mẫu được thu thập sau khi có sự đồng ý bằng
văn bản từ 80 bệnh nhân khám phụ khoa tại bệnh viện Shahid Beheshti ở Isfahan, Iran.
Bệnh phẩm được thu thập từ 80 phụ nữ, 22 người trong số họ không có triệu chứng và
58 người có triệu chứng. 58 phụ nữ có triệu chứng khác nhau, từ 20-60 tuổi (có nghĩa
là 36.3 ± 8.8 năm) và 22 phụ nữ không có triệu chứng khác nhau, từ 19 đến 56 tuổi (40
± 10.5 năm). Tất cả các phụ nữ này được kiểm tra lâm sàng kỹ lưỡng. Độ tuổi trung
bình của phụ nữ ở cả hai nhóm là 37.5 ± 9.4 năm. Những người đã dùng kháng sinh
trong vòng 4 tuần qua được loại trừ khỏi nghiên cứu. Các mẫu đã được kiểm tra bằng
phương pháp PCR được thiết kế để phát hiện C.trachomatis bằng cặp mồi KL1, KL2
trên cryptic plasmid của vi khuẩn này. Huyết thanh IgG và IgA kháng thể kháng
C.trachomatis sử dụng phát hiện bằng phương pháp ELISA. Một tăm bông chứa dịch
phết cổ tử cung của mỗi bệnh nhân được đặt vào một lọ nhựa 15 ml có chứa 5 ml dung
dịch đệm (PBS) vô trùng và lưu trữ ở -70ºC cho đến khi tách chiết DNA. Ngoài ra,
15


5ml máu ngoại vi được thu thập từ mỗi bệnh nhân để điều tra huyết thanh học. Kit
ELISA được sử dụng trong nghiên cứu rất cụ thể để phát hiện C.trachomatis và không
có bất kỳ phản ứng chéo nào với các các loài khác của Chlamydia. Do đó, nó chỉ cho
phép phát hiện các kháng thể kháng C.trachomatis trong mẫu, tức là IgG, IgA. Phát
hiện C.trachomatis bằng phương pháp PCR: Để phát hiện sự hiện diện của
C.trachomatis trong mẫu dich phết cổ tử cung, đoạn gen 241 bp trên plasmid vi khuẩn
đã được khuếch đại nhờ cặp mồi KL1 (5’-TCCGGAGCGAGTACGAAGA-3’) và
KL2 (5’-AATCAATGCCCGGGATT GGT-3’). Phản ứng PCR được thực hiện trên 5
μl chiết xuất DNA mẫu trong một hỗn hợp phản ứng cuối cùng là 25 μl. Hỗn hợp phản
ứng cuối cùng có 3 mM MgCl2, 0.28 mM dNTP, 16 pmol của mỗi loại mồi và 1 U Taq
polymerase. Chu trình nhiệt đã được thực hiện như sau: (94ºC/1 phút, 55ºC/1 phút,
72ºC/1 phút) × 40 chu kỳ, 72ºC trong 8 phút. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng
điện di trên gel agarose 1.5%. Kết quả: tỷ lệ nhiễm C.trachomatis khi xét nghiệm bằng
phương pháp PCR là 27.2% ở phụ nữ không có triệu chứng và 18.9% trên đối tượng
có triệu chứng. Kiểm tra huyết thanh học được thực hiện trên tất cả các mẫu cho kết
quả nhiễm C.trachomatis là 29.4% và 17.6% tương ứng [12].
Theo CDC, số các trường hợp chẩn đoán đã gia tăng đến 19% ở đàn ông và
25% ở phụ nữ giữa năm 2008 và 2009. Theo một điều tra mới đây với quy mô lớn, các
bệnh gây nên bởi C.trachomatis có thể có một vai trò quan trọng trong nguy cơ sinh
non. Hơn 4000 phụ nữ có thai đã tham dự vào điều tra này bằng bảng câu hỏi và lấy
mẫu nước tiểu xét nghiệm C.trachomatis bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR). Kết
quả có 4% các phụ nữ dương tính với vi khuẩn này [15]. Mặc dầu có tính đến những
yếu tố khác (tuổi dưới 21, nhiều bạn tình), nhưng nguy cơ sinh non, sinh con từ 35
tuần thai nghén ở các trường hợp nhiễm trùng do C.trachomatis cao gấp đôi. Vì vậy,
điều tra phát hiện các phụ nữ có nguy cơ và sử dụng thuốc kháng sinh thích hợp trong
thời kỳ thai nghén sẽ cho phép làm giảm nguy cơ này. Nhiễm C.trachomatis có xu
hướng ngày càng tăng, tỷ lệ phát hiện tại Mỹ năm 1987 là 50.8 ca (trong 100.000 dân);
đến năm 2007 là 370.2 ca. Chi phí dành cho điều trị khoảng 3 tỷ USD/năm [18].
Hầu hết các phương pháp khuếch đại phát hiện C.trachomatis trong mẫu dịch
niệu đạo, cổ tử cung và nước tiểu đã chứng minh là có độ nhạy cao hơn so với nuôi
cấy tế bào hoặc các phương pháp phát hiện kháng nguyên (Black 1997). Các phương
16


pháp hiện đang có sẵn, chẳng hạn như Amplicor CT PCR, Roche phát hiện sản phẩm
khuếch đại bằng cách sử dụng peroxidase (HRP). Các phương pháp thương mại có lợi
thế quan trọng, nhưng chi phí cao, không thích hợp với nhiều phòng thí nghiệm. Một
số phương pháp khuếch đại phi thương mại cũng được mô tả. Hầu hết bao gồm một
phản ứng PCR đơn có sản phẩm được phân tích dựa vào sản phẩm điện di trên gel
agarose và nhuộm với ethidium bromide. Tuy nhiên phương pháp này giảm độ nhạy
do các chất ức chế có trong các mẫu lâm sàng. Ngay cả trong trường hợp không có
chất ức chế, phản ứng PCR có thể không đủ nhạy để phát hiện mẫu có chứa số lượng
quá ít thể cơ bản (EB) của C.trachomatis.
Theo nghiên cứu của Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini và Esteban Serra [22],
phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 và KL1/KL2) làm
mồi có trình tự bổ sung với các đoạn nằm trên cryptic plasmid của C.trachomatis và
sau hai vòng khuếch đại tạo ra một sản phẩm cuối cùng 241 bp. Ban đầu, phản ứng
đầu tiên đã được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 50 µl có chứa 10 mM Tris (pH 9,0),
50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 5 nmol mỗi loại dNTP, 20 pmol mỗi mồi KL5 (5TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGTCCTTCCTAAAAGAG-CTA-3) và
1.25 U Taq polymerase (Promega). Sau 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở
55°C, và 1 phút ở 72°C và một bước kéo dài trong 7 phút ở 72°C; 1 µl sản phẩm của
phản ứng PCR đầu tiên đã được chuyển sang một ống phản ứng thứ hai với cùng thành
phần ngoại trừ mồi là 20 pmol mỗi loại mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAGTTACTAAGA-3) và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3) đã được thêm vào
hỗn hợp phản ứng, và 35 chu kỳ mới được thực hiện. Các sản phẩm được phân tích bởi
điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide. Độ nhạy của nested PCR được
xác định bằng cách sử dụng số lượng DNA của C.trachomatis giảm dần. Khảo nghiệm
đã có thể phát hiện DNA tương ứng với một EB trong phản ứng. Tuy nhiên, độ nhạy
theo thử nghiệm lâm sàng có thể thấp hơn do chất ức chế PCR bị loại bỏ không hoàn
toàn trong quá trình tách chiết DNA. Các kết quả độ nhạy trong thực nghiệm khác
nhau dao động từ 1 đến 10 thể cơ bản (EB) mỗi phản ứng. Để tìm những điều kiện tốt
nhất cho các xét nghiệm, thử nghiệm nồng độ khác nhau cho các thành phần của phản
ứng, khối lượng và số chu kỳ khuếch đại. Kết quả tối ưu đạt được với phản ứng PCR
đầu tiên trong 30 µl thể tích cuối cùng, có chứa 2.5 nmol dNTP mỗi loại, KL5/KL6 6
pmol mỗi mồi và 25 chu kỳ, tiếp theo với 50 µl của hỗn hợp phản ứng thứ hai và 35
17


chu kỳ. Cuối cùng, để xác định xem phản ứng có là một thử nghiệm chung xác định
C.trachomatis hay không, các thí nghiệm tiến hành bằng cách sử dụng các mẫu khác
để xét nghiệm. Kiểm tra cho thấy độ nhạy tương tự đối với mẫu nước tiểu, dịch niệu
đạo, dịch nhày mũi họng, và bệnh phẩm từ mắt. Kết quả cho thấy nested PCR đối với
phát hiện của C.trachomatis trong các mẫu lâm sàng là rất nhạy, có thể phát hiện ít
hơn 10 EB mỗi phản ứng trong các mẫu sinh học khác nhau; loại bỏ đến mức thấp
nhất việc phát hiện các kết quả âm tính giả bằng cách sử dụng một kiểm soát nội bộ
khuếch đại; đủ mạnh để đối phó với các điều kiện thay đổi trong các phòng thí nghiệm
khác nhau.
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một số nghiên cứu trong cộng đồng cho thấy tỷ lệ
nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ thay đổi từ 18% đến 32.5%, trong đó một số yếu tố
nguy cơ được nhận diện như số bạn tình, độ tuổi bắt đầu quan hệ tình dục, tiền căn
bệnh phụ khoa.
Năm 1995, khảo sát tỷ lệ hiện mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục được Vụ
Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đình của Bộ Y Tế thực hiện ở Việt
Nam [29]. Đối tượng là các phụ nữ đến khám tại Trung Tâm Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em
và Kế Hoạch Hóa Gia Đình thành phố Hồ Chí Minh trong 10 tuần gồm 812 phụ nữ ở
độ tuổi 15 đến 39. Chẩn đoán bệnh lậu dựa trên nuôi cấy và xác nhận bằng một xét
nghiệm kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho N.gonorrhoea. Sự hiện diện của
C.trachomatis được xác định bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên (IDEIA)
trong bệnh phẩm nội mạc cổ tử cung. TPHA được thực hiện cho tất cả các mẫu máu để
tìm bệnh giang mai. Tỷ lệ bệnh lây truyền qua đường tình dục phát hiện được ở giang
mai 0.5%, lậu 0.7% và C.trachomatis 2.5%.
Một nghiên cứu cắt ngang về nhiễm HIV và các yếu tố nguy cơ ở phụ nữ mại
dâm tại phía nam Việt Nam đã được Nguyễn Thị Thanh Thủy, Võ Tuyết Nhung,
Nguyễn Văn Thục, Trương Xuân Liên và Hạ Bá Khiêm thực hiện vào 1995-1996 [24].
Tổng cộng 968 phụ nữ mại dâm ở thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và An Giang
được làm xét nghiệm. Các xét nghiệm bệnh lây truyền qua đường tình dục được thực
hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoeae, ELISA (Sanofi, Organon) để phát hiện
18


nhiễm HIV được xác nhận bằng Western Blot, TPHA cho giang mai, DIF cho
C.trachomatis và ELISA HBsAg cho HBV. Tỷ lệ hiện mắc của các bệnh lây truyền
qua đường tình dục được phát hiện là 40.4% cho giang mai, 3.3% cho lậu, 5.8% cho
C.trachomatis, 5.2% cho HIV và 9% cho HBV.
Trong thời gian từ tháng 2/1998 đến 3/1999, các tác giả đã khảo sát 415 phụ nữ
từ 15-49 tuổi có gia đình đang sống tại huyện Hóc Môn thành phố Hồ Chí Minh [3].
Các đối tượng được chọn một cách ngẫu nhiên, nếu có đủ điều kiện nghiên cứu thì lập
danh sách theo phương pháp ngẫu nhiên đơn, sau đó gửi thư mời đối tượng đến trạm y
tế xã khám phụ khoa và lấy mẫu. Cách xử lý bệnh phẩm cũng như cách đọc kết quả
được tuân theo quy trình hướng dẫn của bộ xét nghiệm do Bio Merieux cung cấp. Kết
luận dương tính với C.trachomatis khi có hơn 10 thể phát huỳnh quang trên quang
trường với vật kính 40; bệnh phẩm âm tính khi không có thể C.trachomatis phát huỳnh
quang và ít nhất phải có hơn 50 tế bào thượng bì trên bề mặt của giếng. Kết quả 75
nguời có hiện diện của C.trachomatis trên bệnh phẩm phết cổ tử cung, như vậy tần
suất lưu hành của viêm cổ tử cung do C.trachomatis là 18.07%.
Tỷ lệ viêm cổ tử cung do C.trachomatis ở phụ nữ đi khám phụ khoa là 32.5%
của Trần Thị Lợi tiến hành năm 1999 [8].
Năm 2001-2002, Huỳnh Thị Trọng, Nguyễn Quốc Chinh và Nguyễn Văn Tú đã
thực hiện một nghiên cứu cắt ngang với phương pháp chọn mẫu xác suất với cỡ mẫu
để xác định tỷ lệ hiện mắc các nhiễm khuẩn đường sinh sản dưới của 2234 phụ nữ đã
kết hôn, ở lứa tuổi mang thai, sống tại thành phố Hồ Chí Minh [25]. Các xét nghiệm
được thực hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoea, Smart Check Chlamydia cho
C.trachomatis. Tỷ lệ hiện mắc lậu là 0.2%, C.trachomatis là 0.6%,
Năm 2002-2003, Ủy Ban Dân Số, Gia Đình và Trẻ Em Việt Nam – Cục Phòng Chống
AIDS Bộ Y Tế và Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu bệnh
lây truyền qua đường tình dục ở phụ nữ mãi dâm tại 5 tỉnh biên giới Lai Châu, Quảng
Trị, Đồng Tháp, An Giang và Kiên Giang [26]. Có tất cả 703 phụ nữ mãi dâm của 5
tỉnh tham gia vào nghiên cứu cắt ngang này. Xét nghiệm bệnh lậu và C.trachomatis
qua mẫu nước tiểu bằng kỹ thuật Roch Amplicor. Tỷ lệ mắc lậu, C.trachomatis,
lậu/C.trachomatis tại Lai Châu 2.0%, 1.0%, 27.3%; Quảng Trị 1.0%, 12.9%, 32.7%;
19


Đồng Tháp 4.7%, 11.4%, 16.0%; An Giang 7.0%, 10.7%, 11.3% và Kiên Giang 4.0%,
13.4%, 24.4%.
Năm 2003, Trung tâm phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) cùng Viện Da Liễu
trung ương tiến hành một cuộc điều tra về tỷ lệ lưu hành STI/HIV của các nhóm quần
thể dân cư khác nhau tại 5 tỉnh của Việt Nam [29]. Nhiễm C.trachomatis được phát
hiện bằng phản ứng PCR và tỷ lệ mắc là 9% trong nhóm tân binh tại Hà Nội và 0.5-5%
trong nhóm bệnh nhân đến phòng khám bệnh lây truyền qua đường tình dục. Trong
nhóm phụ nữ có thai, tỷ lệ mắc C.trachomatis từ 1.5% đến 5.8%.
Năm 2003, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh và Văn Phòng Phòng Chống
AIDS cùng Trung Tâm Phòng Chống Bệnh Xã Hội Sóc Trăng nghiên cứu về bệnh lây
truyền qua đường tình dục ở 395 phụ nữ mại dâm của tỉnh Sóc Trăng [29]. Các kỹ
thuật được sử dụng để xét nghiệm lây truyền qua đường tình dục là PCR (Amplicor
CT/NG, Roch, 2002) để tìm N.gonorrhoea và C.trachomatis trong nước tiểu. Tỷ lệ
hiện mắc lậu, C.trachomatis, lậu/C.trachomatis là 14.9%, 48.4%, 54.9%.
Tần suất nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên
cứu và đã có một số số liệu ban đầu ghi nhận tỉ lệ nhiễm C.trachomatis ở một số đối
tượng trong cộng đồng như phụ nữ đang mang thai, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ, cũng như
ở những đối tượng nguy cơ cao như phụ nữ đến khám phụ khoa và phụ nữ vô sinh do
tắc ống dẫn trứng. Tần suất nhiễm C.trachomatis thay đổi theo từng tác giả, từng
nhóm đối tượng, tuy vậy đều thống nhất trong khoảng 20 – 40% ở đối tượng trong
cộng đồng [1]. Điểm chung của các nghiên cứu trên là sử dụng kỹ thuật miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp để tìm kháng nguyên, xác định tình trạng hiện đang nhiễm
C.trachomatis.
Lần đầu tiên tại Việt Nam, xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis được sử
dụng như một xét nghiệm sàng lọc. Đối tượng nghiên cứu là tất cả các trường hợp điều
trị vô sinh có chỉ định thực hiện thủ thuật thụ tinh nhân tạo (TTNT) tại khoa Hiếm
muộn, bệnh viện Từ Dũ trong thời gian từ 20/2/2004 đến 20/7/2004 [31]. Bệnh nhân
được tư vấn về tình hình nhiễm C.trachomatis trong cộng đồng, khả năng nhiễm bệnh
của bản thân và ảnh hưởng của nhiễm C.trachomatis lên hiệu quả điều trị. Bệnh nhân
cũng được tư vấn về xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis và đồng ý tham gia
nghiên cứu. Khi được nhận vào nghiên cứu, bệnh nhân đã được ghi nhận về bệnh sử,
20


thăm khám lâm sàng, thực hiện những xét nghiệm cơ bản. Vào ngày thứ 2 hoặc 3 của
kỳ kinh, bệnh nhân được lấy máu thử kháng thể kháng C.trachomatis loại IgG và được
bắt đầu dùng toa thuốc kích thích phát triển nang noãn theo phác đồ chuẩn tại khoa.
Quy trình thực hiện thủ thuật TTNT được tiến hành theo phác đồ chuẩn tại khoa Hiếm
muộn, bệnh viện Từ Dũ. Xét nghiệm Platelia® Chlamydia IgG được thực hiện tại
khoa xét nghiệm bệnh viện Từ Dũ, sử dụng máy và bộ xét nghiệm của hãng Bio-Rad
bằng kỹ thuật ELISA. Trong thời gian từ 1/3 đến 20/7/2004 có 425 bệnh nhân điều trị
vô sinh bằng thủ thuật TTNT được nhận vào nghiên cứu. Tuổi trung bình của bệnh
nhân là 28.3 (từ 19 đến 35), thời gian vô sinh trung bình là 3.7 năm (từ 1 đến 6 năm).
Có 99 bệnh nhân cho kết quả dương tính với xét nghiệm kháng thể kháng
C.trachomatis (nhóm Ct IgG+), chiếm tỷ lệ 23.3%. Mặc dù không ghi nhận sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê về kết quả điều trị (tỷ lệ beta-hCG dương tính và tỷ lệ thai
lâm sàng) giữa hai nhóm bệnh nhân, vẫn có thể ghi nhận tỷ lệ có thai trong nhóm xét
nghiệm âm tính với C.trachomatis (nhóm Ct IgG-) cao hơn hẳn (gấp 8 lần) so với kết
quả của nhóm xét nghiệm dương tính với C.trachomatis (nhóm Ct IgG+).
Từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2006, một nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR xét
nghiệm chẩn đoán C.trachomatis được thực hiện tại Viện da liễu quốc gia trên 555
bệnh nhân [7]. Bệnh nhân là đối tượng trên 15 tuổi đến khám có biểu hiện tiết dịch
niệu đạo và tiết dịch âm đạo. Bệnh phẩm là dịch tiết niệu đạo (đối với bệnh nhân nam)
và dịch tiết cổ tử cung (đối với bệnh nhân nữ). Tiến hành tách chiết DNA bằng Qiamp
DNA Mini Kit của hãng Qiagen, chẩn đoán nhiễm C.trachomatis bằng kỹ thuật PCR
với hai cặp mồi KL1/KL2 (nhân đoạn 241 bp trên plasmid của C.trachomatis) và
T1/T2 (nhân đoạn 200 bp trên plasmid của C.trachomatis). Bệnh nhân được khẳng
định kết quả dương tính khi cả hai cặp mồi đều cho kết quả dương tính. Kết quả có 90
bệnh nhân dương tính với cả hai cặp mồi, chiếm tỷ lệ 16.2%. Trong đó tỷ lệ nhiễm
C.trachomatis ở nữ giới là 21/205, chiếm 10.2%. So sánh PCR sử dụng cặp mồi
T1/T2, phương pháp PCR sử dụng cặp mồi KL1/KL2 có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu
là 99.8%. Độ nhạy và độ đặc hiệu này cao tương đương với các kết quả đã công bố.
Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở Việt Nam năm 2007 khoảng 5897 ca. Tại Viện Da
liễu quốc gia, bằng phương pháp miễn dịch sắc ký phát hiện tỷ lệ nhiễm khoảng 10%
số bệnh nhân STI, bằng kỹ thuật PCR phát hiện 16.2%. Trong đó các yếu tố nguy cơ
21


bao gồm bệnh nhân nữ nhỏ hơn 25 tuổi; bệnh nhân nam có viêm đỏ quy đầu hoặc tiết
dịch đục, bệnh nhân độc thân [10].
Lấy mẫu kiểu ngẫu nhiên các đối tượng hút thai ba tháng đầu thai kỳ trong giờ
hành chính, tại khoa kế hoạch hóa gia đình Bệnh viện Từ Dũ từ 01/08/2007 đến
30/01/2008, thu thập bệnh phẩm tại kênh cổ tử cung làm xét nghiệm PCR (Amplicor ® của
hãng Roche) được thực hiện tại viện Pasteur, Phạm Văn Đức và cộng sự đã thu được kết
quả: trong 1.003 trường hợp nghiên cứu tỷ lệ nhiễm C.trachomatis là 9.2%, phần lớn rơi
vào các đối tượng trẻ dưới 30 tuổi, kinh tế trung bình [4].
Tại bệnh viện Phong-Da liễu Trung ương Quy Hoà, tác giả Nguyễn Phúc Như Hà
và cộng sự [5,30] đã sử dụng phản ứng multiplex PCR phát hiện vi khuẩn
C.trachomatis. Mẫu thử là DNA tách chiết từ các huyền dịch vi khuẩn C.trachomatis
và mẫu bệnh phẩm lâm sàng như dịch niệu đạo, nước tiểu nam giới, dịch phết cổ tử
cung. Sử dụng mồi đặc hiệu (đặt TaKaRa tổng hợp) cho đoạn DNA dài 241 bp trên
cryptic plasmid của C.trachomatis trong thể tích phản ứng là 25 µl. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, Multiplex PCR có khả năng phát hiện rất cao, có thể nói là lý tưởng đạt
mức phát hiện tối thiểu chỉ cần 1 DNA bộ gen của vi khuẩn đích có mặt trong mẫu thử
là có thể phát hiện được. Kết quả xét nghiệm bệnh nhân thu được 12.1% trường hợp
dương tính trên các tổng số các trường hợp được chẩn đoán viêm cổ tử cung.
Trong một nghiên cứu khác, bệnh nhân tiết dịch âm đạo đến khám tại bệnh viện da
liễu thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 6 năm 2007 đến tháng 6 năm 2008 được xét
nghiệm quick test và PCR [6]. 245 bệnh nhân trên 18 tuổi, chia 3 nhóm bị tiết dịch
niệu đạo (95), tiết dịch âm đạo (70), bệnh nhân nữ không triệu chứng nhưng có yếu tố
nguy cơ (80). Kết quả xét nghiệm bằng PCR: tỷ lệ dương tính với C. Trachomatis ở
nhóm bị tiết dịch niệu đạo là 26/95 (27.4%), bệnh nhân có triệu chứng tiết dịch âm đạo
là 25/70 (35.7%), bệnh nhân không triệu chứng là 21/80 (26.3%).

22


Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu DNA vi khuẩn Chlamydia trachomatis do Viện Công nghệ sinh họcViện Khoa học Việt Nam cung cấp.
- Các bệnh nhân nữ trong độ tuổi sinh sản (15-49 tuổi) có biểu hiện viêm âm
đạo, cổ tử cung đến khám tại phòng khám Sản phụ khoa - Bệnh viện Đại học Y Thái
Bình trong thời gian từ 01/04/2011 đến 10/2011.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu: từ 01/04/2011.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
+ Lấy mẫu dịch phết cổ tử cung tại phòng khám Sản phụ khoa - Bệnh viện Đại
học Y Thái Bình.
+ Chuẩn quy trình kỹ thuật, xử lý mẫu, tách chiết DNA và thực hiện phản ứng
PCR tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu
Phương pháp chọn mẫu
Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:
Bệnh nhân trong độ tuổi sinh sản, đã từng quan hệ tình dục.
Được khám và chẩn đoán là viêm âm đạo, cổ tử cung.
Đồng ý tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ:
23


Bệnh nhân đang trong giai đoạn kinh nguyệt, bị rong kinh, rong huyết.
Bệnh nhân đã từng điều trị kháng sinh trong vòng 1 tháng trước đó.
Không đồng ý tham gia nghiên cứu.
Những bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu sẽ được lấy mẫu dịch phết cổ
tử cung để tiến hành làm xét nghiệm PCR phát hiện Chlamydia trachomatis tại Trung
tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình.
Cỡ mẫu:
Để xác định cỡ mẫu cho việc ước tính tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở
những phụ nữ viêm cổ tử cung chúng tôi sử dụng công thức:
2

 1,96 
n≥
 p (1 − p )
 m 

Trong đó: n là cỡ mẫu, m là độ sai số, p là tỉ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở
phụ nữ viêm cổ tử cung.
Với p = 17% (theo nghiên cứu của Farhad B. Hashemi và cộng sự [16]) và lựa
chọn giá trị độ sai số m = 0,05 thì cỡ mẫu n tối thiểu là 217 bệnh nhân.
2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Những bệnh nhân được lựa chọn tham gia nghiên cứu đều được thăm khám bởi
các bác sĩ Sản phụ khoa để xác định tình trạng viêm âm đạo, cổ tử cung trước khi lấy
mẫu. Dùng tăm bông lau sạch dịch tiết cổ tử cung. Dùng tăm bông tiếp theo đưa sâu
vào ống cổ tử cung 2 cm, xoay tăm bông và miết tăm bông vào thành ống cổ tử cung
từ 15 đến 30 giây. Khi kéo tăm bông ra không chạm vào vách âm đạo. Mẫu phết cổ tử
cung được giữ trong tuýp Falcol 15 ml có chứa 2 ml dung dịch 2SP (2-sucrosephosphate transport medium), bảo quản ở 4oC và đưa về phòng thí nghiệm trong vòng
2- 3 giờ và thực hiện phản ứng PCR trong vòng 24 giờ.
Tại phòng thí nghiệm, bệnh phẩm được chia nhỏ vào hai tuýp eppendorf 1.5 ml
(1ml/tuýp), một tuýp được sử dụng để tách chiết DNA, tuýp còn lại được bảo quản ở
-70oC.

24


2.2.2.2. Xử lý mẫu
- Lấy 500 µl bệnh phẩm cho vào tuýp eppendorf 1.5 ml, bổ sung 500 µl dung
dịch TTE, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch
đáy.
- Bổ sung 500 µl dung dịch PBS, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch
nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy.
2.2.2.3. Tách chiết ADN
Tuýp trên được sử dụng để tách chiết theo phương pháp Boom [14].
Bước 1: Phá tế bào giải phóng DNA
- Bổ sung 1000 µl dung dịch L6, vortex, bổ sung 30 µl SiO 2, vortex đều, ly tâm
13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
Bước 2: Tinh sạch DNA
- Bổ sung 1000 µl dung dịch L2, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại
dịch nổi, thu cặn.
- Làm lại bước trên.
- Bổ sung 1000 µl dung dịch ethanol 70% lạnh, vortex tan cặn, ly tâm 13.000
rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
- Làm lại bước trên.
- Bổ sung 1000 µl dung dịch acetone 100%, vortex tan cặn, ly tâm 13.000
rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
- Làm khô cặn bằng cách sấy ở 60oC trong 10 phút, mở nắp eppendorf.
Bước 3: Thu hồi DNA
- Bổ sung 50 µl TE, ủ ở 60oC trong 10 phút, đóng nắp eppendorf. Ly tâm
13.000rmp/30s. Hút dịch nổi sang một eppendorf mới, ghi tên dán nhãn.
- Làm lại bước trên.
Dịch nổi chứa DNA thu được bảo quản ở -20oC sử dụng chạy PCR.

25


x

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×