Tải bản đầy đủ

Ảnh hưởng của dịch chiết bạch hoa xà lên vi khuẩn aeromonas hydrophila và edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ NGÀNH: D620301

ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT BẠCH HOA XÀ
LÊN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila và
Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ

Sinh viên thực hiện
Quách Thị Thanh Tâm
MSSV: 1153040068
Lớp: NTTS K6

Cần Thơ, 2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG


BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ NGÀNH: D620301

ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT BẠCH HOA XÀ
LÊN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila và
Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Th.S. NGUYỄN LÊ HOÀNG YẾN

Quách Thị Thanh Tâm
MSSV: 1153040068
Lớp: NTTS K6

Cần Thơ, 2015


XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Khóa luận: “Ảnh hưởng của dịch chiết Bạch hoa xà lên vi khuẩn Aeromonas
hydrophila và Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá”.
Sinh viên thực hiện: QUÁCH THỊ THANH TÂM
Lớp: Đại học Nuôi trồng thủy sản K6.
Khóa luận đã được hoàn thành theo yêu cầu của cán bộ hướng dẫn và chỉnh sửa theo góp
ý của Hội đồng bảo vệ Khoá luận tốt nghiệp ngày 21 tháng 7 năm 2015.

Cán bộ hướng dẫn

Cần Thơ, ngày….tháng…. năm 2015
Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN LÊ HOÀNG YẾN

QUÁCH THỊ THANH TÂM



LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam kết khóa luận này đã được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu
của tôi và các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ khóa luận cùng
cấp nào khác.

Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2015
Sinh viên thực hiện

QUÁCH THỊ THANH TÂM

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Khoa Sinh học ứng dụng
đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt thời gian em học
tập tại trường. Đặc biệt em xin cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Lê Hoàng Yến đã chỉ bảo
và hướng dẫn tận tình cho em những kiến thức lý thuyết, cũng như các kỹ năng trong
cách làm một đề tài, cách giải quyết vấn đề, đặt câu hỏi …
Không những thế, trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài đã phát sinh không ít khó khăn
nhưng nhờ nhận được sự giúp đỡ, động viên của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho con học tập và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn để
hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.
Toàn thể các bạn lớp đại học Nuôi trồng thủy sản khóa 6 đã đồng hành và chia sẻ
trong suốt thời gian qua.
Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp, dù đã cố gắng tìm tòi, học hỏi nhưng do kiến
thức và kinh nghiệm bản thân còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất
mong nhận được sự thông cảm cũng như những ý kiến đóng góp của quý thầy cô, để đề
tài em được hoàn chỉnh hơn.
Lời cuối cùng, em xin gửi lời kính chúc đến quý thầy cô Quý thầy cô Khoa Sinh học
ứng dụng Trường Đại học Tây Đô. Đặc biệt là Cô Nguyễn Lê Hoàng Yến được dồi
dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống và tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp giáo
dục.
Em xin chân thành cảm ơn!

ii


TÓM TẮT
Thí nghiệm được tiến hành xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên 2
vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri ở các mật độ vi khuẩn 103, 106,
109 (CFU/ml), với 3 lần lặp lại. Sau thời gian tiến hành thí nghiệm, kết quả xác định
được:
Trong 3 phương pháp chiết xuất Bạch hoa xà thì phương pháp ngâm bằng cồn 70oC
trong 6 ngày cho kết quả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila cao nhất, cụ thể là: ở tỷ
lệ dịch chiết 3:1 với mật độ 109 cfu/ml thì đường kính vòng khuẩn đạt (19,8 ± 1,0 mm).
Trong 3 phương pháp chiết xuất thì phương pháp ngâm lá Bạch hoa xà trong cồn 70oC
thời gian 6 ngày cho kết quả kháng Edwardsiella ictaluri cao nhất, cụ thể là: ở tỷ lệ dịch
chiết 3:1 với mật độ 109 cfu/ml thì đường kính vòng khuẩn đạt (22,7 ± 0,5 mm).
Đường kính vòng tròn kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà kháng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri luôn cao hơn so với vi khuẩn Aeromonas hydrophila trong cùng
phương pháp chiết xuất, tỷ lệ dịch chiết và mật độ vi khuẩn.
Qua kết quả thí nghiệm cho thấy có thể sử dụng thảo dược Bạch hoa xà ức chế 2 loại vi
khuẩn Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri trong những nghiên cứu khác.

Từ khóa: Aeromonas hydrophila, dịch chiết Bạch hoa xà, Edwardsiella ictaluri, sự
kháng khuẩn.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
TÓM TẮT .................................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... vi
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... vii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu .................................................................................................................... 1
1.3 Nội dung ................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 2
2.1 Tổng quan về vi khuẩn .............................................................................................. 2
2.1.1 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ........................................................................... 2
2.1.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. ............................................................................. 3
2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do các vi khuẩn Aeromonas hydrophila; Edwardsiella
ictaluri. ........................................................................................................................... 4
2.2.1 Trên thế giới........................................................................................................... 4
2.2.3 Trong nước ............................................................................................................ 5
2.3 Bạch hoa xà .............................................................................................................. 7
2.3.1 Đặc điểm chung của Bạch hoa xà ........................................................................... 7
2.3.2 Thành phần hóa học của Bạch hoa xà ..................................................................... 7
2.4 Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản............................................. 8
2.4.1 Thế giới.................................................................................................................. 8
2.4.2 Trong nước ............................................................................................................ 9
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU ............................... 11
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 11
3.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất .................................................................................. 11
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 11
3.2.2 Dụng cụ ............................................................................................................... 11
3.2.3 Hóa chất ............................................................................................................... 11
iv


3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 12
3.3.1 Sơ đồ tổng quát các bước về tiến trình thực hiện .................................................. 12
3.3.2 Phương pháp chiết xuất Bạch hoa xà .................................................................... 12
3.3.3 Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà ................................ 13
3.4 Các bước tiến hành xác định vòng kháng khuẩn ...................................................... 13
3.5 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 14
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 15
4.1 Tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà chiết xuất bằng phương pháp đun với
nước cất ở 98oC trong 3 giờ. ......................................................................................... 15
4.1.1 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ................................. 15
4.1.2 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. ................................... 16
4.2 Tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà bằng phương pháp ngâm với cồn 70o
ngâm trong 3 ngày. ....................................................................................................... 17
4.2.1 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila .................................. 17
4.2.2 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. ................................... 19
4.3 Tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà bằng phương pháp ngâm với cồn 70o
ngâm trong 6 ngày. ....................................................................................................... 20
4.3.1 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ................................. 20
4.3.2 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri..................................... 22
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 25
5.1 Kết luận .................................................................................................................. 25
5.2 Đề xuất ................................................................................................................... 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 26
PHỤ LỤC A ................................................................................................................. A
PHỤ LỤC B.................................................................................................................. A
PHỤ LỤC C ................................................................................................................. A
PHỤ LỤC D ................................................................................................................. A

v


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Theo dõi tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi khuẩn
Aeromonas hydrophila; Edwardsiella ictaluri bằng bằng 3 phương pháp khác nhau..... 13
Bảng 3.2: E. coli and other enteric gram - negative rods (Nguồn: microbelibrary.org) . 14
Bảng 4.1: Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi
khuẩn Aeromonas hydrophila ....................................................................................... 15
Bảng 4.2 Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri. ......................................................................................... 16
Bảng 4.3 Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi
khuẩn Aeromonas hydrophila ...................................................................................... 18
Bảng 4.4: Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri .......................................................................................... 19
Bảng 4.5 Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi
khuẩn Aeromonas hydrophila ....................................................................................... 21
Bảng 4.6: Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri .......................................................................................... 22

vi


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (nguồn: tự chụp) ......................................... 2
Hình 2.2: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (nguồn: tự chụp)............................................ 4
Hình 2.3: Bạch hoa xà (nguồn: hocvienquany.vn) .......................................................... 7
Hình 3.1: Sơ đồ tổng quát các bước về tiến trình thực hiện........................................... 12
Hình 4.1: Kết quả vòng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch chiết Bạch hoa
xà bằng phương pháp đun với nước cất ở 98oC. ............................................................ 16
Hình 4.2: Kết quả vòng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của dịch chiết Bạch hoa
xà bằng phương pháp đun với nước cất ở 98oC. ............................................................ 17
Hình 4.3: Kết quả vòng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch chiết Bạch hoa
bằng phương pháp ngâm cồn 70o trong 3 ngày.............................................................. 19
Hình 4.4: Kết quả vòng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của dịch chiết Bạch hoa
bằng phương pháp ngâm cồn 70o trong 3 ngày.............................................................. 20
Hình 4.5: Kết quả vòng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch chiết Bạch hoa
bằng phương pháp ngâm cồn 70o trong 6 ngày. ............................................................. 22
Hình 4.6: quả vòng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của dịch chiết Bạch hoa bằng
phương pháp ngâm cồn 70o trong 6 ngày. ...................................................................... 23

vii


CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam đang trên đà phát triển và chiếm vị trí quan trọng
trong chiến lược phát triển kinh tế. Theo thống kê của Tổng cục thủy sản, năm 2014 xuất
khẩu thủy sản lần đầu vượt mốc 7 tỷ USD, dự báo đạt mức kỷ lục với giá trị xuất khẩu
đạt 7,84 tỷ USD, tăng 16,5% so với năm 2013. Đến quý (I/2015), ước tổng sản lượng
thủy sản đạt trên 1,2 triệu tấn, tăng 3,2% so với quý I/2014. Trong đó, sản lượng khai
thác đạt 711 nghìn tấn (tăng 3,5%), sản lượng nuôi trồng đạt 512 nghìn tấn (tăng 2,8%)...
Bên cạnh những thành công trên, ngành thủy sản nước ta vẫn đối mặt với một số khó
khăn như tình hình dịch bệnh diễn biến thất thường, dư lượng hóa chất, kháng sinh trong
các mặt hàng xuất khẩu làm ảnh hưởng đến uy tín và gây thiệt hại về kinh tế của Việt
Nam.
Ở Việt Nam, hiện tượng kháng thuốc đã được một số tác giả ghi nhận trên vi khuẩn gây
bệnh cũng như vi khuẩn trong môi trường nuôi tôm cá. Trong đó bệnh gan thận mủ do vi
khuẩn E. ictaluri gây ra đang rất phổ biến, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn cá hương, cá
giống, và cả cá nuôi thương phẩm với tỷ lệ chết cao, có thể đến 90%, gây thiệt hại lớn
cho người nuôi (Từ Thanh Dung và ctv., 2004). Trước tình hình đó, các ngành có liên
quan đã chỉ đạo nghiêm cấm sử dụng một số hóa chất, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng
thủy sản, đồng thời khuyến cáo người dân khi nuôi nên dùng các chế phẩm sinh học, vi
sinh và thuốc phòng trị bệnh bằng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản là cần thiết. Do
đó, việc sử dụng các dòng thuốc để điều trị bệnh được chiết xuất từ các dòng thảo dược
cũng đang được khuyến khích dùng thay thế thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản.
Chính vì thế đề tài: “Ảnh hưởng của dịch chiết Bạch hoa xà lên vi khuẩn Aeromonas
hydrophila và Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu
Đánh giá tính kháng khuẩn của bạch hoa xà trên các vi khuẩn Aeromonas hydrophila;
Edwardsiella ictaluri nhằm đáp ứng nhu cầu ứng dụng thực tế trong ương nuôi cá.
1.3 Nội dung
Xác định tính kháng khuẩn Aeromonas hydrophila; Edwardsiella ictaluri bằng dịch chiết
Bạch hoa xà.

1


CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về vi khuẩn
Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước rất nhỏ (kích thước hiển vi) và
thường có cấu trúc tế bào đơn giản. Vi khuẩn thường được bao bọc nhiều lớp màng,
ngoài lớp vỏ dày hoặc lớp dịch nhầy còn có lớp thành tế bào (màng tế bào) bên trong là
tế bào chất. Thành phần chính là phức chất lipoprotein, nhân dạng nguyên thủy không
phân hóa thành khối rõ rệt như các tế bào vi sinh vật khác (nấm men, nấm mốc, tảo lục).
Vi khuẩn di động nhờ vào tiên mao là những sợi nguyên sinh chất rất mảnh chiều rộng
0,01-0,05 m, chiều dài 6-9 m có khi tới 80-90m. Một số loại vi khuẩn trong giai
đoạn phát triển nhất định có thể hình thành trong tế bào thể hình tròn hay bầu dục gọi là
bào tử thường gặp ở 2 giống: Bacillus và Clostridium.
Vi khuẩn chia làm 3 loại: cầu khuẩn, trực khuẩn và xoắn khuẩn.
Cầu khuẩn nói chung không có tiên mao, không có khả năng di động. Ở động vật thủy
sản thường gặp Streptococcus, Staphylococcus. Kích thước thay đổi 0,5-1m.
Trực khuẩn có hình que, kích thước khoảng 0,5-1x1-4 m. Ở động vật thủy sản thường
gặp Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio.
Xoắn khuẩn gồm tất cả các vi khuẩn có 2 vòng xoắn trở lên, kích thước khoảng 0,53,0x5-40 m, ít gây bệnh ở động vật thủy sản (Bùi Quang Tề 2006).
2.1.1 Vi khuẩn Aeromonas sp.
2.1.1.1 Đặc điểm chung
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Aeromonadales
Họ: Aeromonadaceae
Giống: Aeromonas

Hình 2.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
(nguồn: tự chụp)

2


Giống Aeromonas có 2 nhóm:
Nhóm 1: Aeromonas không di động (A. salamonicida) gây bệnh ở cá nước lạnh.
Nhóm 2: Aeromonas di động gồm: A. hydrophila, A. caviae, A. sobria đều di động nhờ 1
tiên mao. Vi khuẩn gram âm, dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5x1,0-1,5
m. Vi khuẩn yếm khí tùy tiện, Cytochrome oxidase dương tính, khử nitrate, không mẫn
cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129... Tỷ lệ Guanin + Cytozin trong ADN là 57-63
mol%. Các vi khuẩn Aeromonas di động đều được phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh,
thường gặp nhất là loài A. hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006).
A. salmonicida: gây bệnh nhọt ở cá; A. hydrophila, A. caviae, A. sobria: gây bệnh xuất
huyết đốm đỏ ở cá, đốm xanh ở tôm (Bùi Quang Tề, 2006).
Theo nghiên cứu của Swann et al., (1989), vi khuẩn Aeromonas sống được ở môi trường
nước ngọt, lợ, mặn vì thế chúng có thể gây ra bệnh trên một số loài cá nước ngọt, cũng
như cá da trơn, cá biển và cá cảnh như bệnh nhiễm trùng máu (Motile Aeromonas
Septicemia-MAS), bệnh lở loét (Ulcer Disease), gây ra thiệt hại nghiêm trọng cho nghề
nuôi thủy sản. Trong ao nuôi khi môi trường nước gặp bất lợi như chất lượng nước xấu,
hàm lượng oxy thấp, hàm lượng CO2 và NO2 cao sẽ tạo điều kiện rất thuận lợi cho sự
phát triển và tăng độc lực của nhóm vi khuẩn Aeromonas gây bệnh cho cá nuôi (trích dẫn
bởi Đặng Chí Công, 2009).
2.1.1.2 Phân bố
Theo Swann et al., 1989, vi khuẩn Aeromonas sp. được tìm thấy trong ao nuôi và cả ao
hồ tự nhiên (trích dẫn bởi Đặng Chí Công, 2009). Ở Đông Nam Á, vi khuẩn Aeromonas
gây bệnh trên cá trê ở Thái Lan, gây bệnh trên cá chép, cá trê ở Indonesia (Bùi Quang
Tề, 2006).
Ở Việt Nam các loài cá nuôi lồng, bè và nuôi ao nước ngọt thường gặp bệnh đốm đỏ
như: Trắm cỏ, cá Trôi, cá Chép, cá Mè, cá Ba sa, cá Bống tượng, cá He nuôi bè, cá Tai
tượng, cá Trê, cá Nheo... Vi khuẩn có thể gây bệnh ở Ba ba, cá Sấu, bệnh đỏ chân ở Ếch,
đốm nâu ở tôm Càng xanh. Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30-70%, riêng ở
cá giống có thể chết 100%.
2.1.2 Vi khuẩn Edwardsiella sp.
2.1.2.1 Đặc điểm chung
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
3


Hình 2.2: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
(nguồn: tự chụp)

Vi khuẩn Edwardsiella là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước khoảng 1x2-3µm,
không sinh bào tử chuyển động nhờ vành tiên mao, yếm khí tùy tiện, catalase dương,
Cytochrome oxidase âm, oxy hóa âm và lên men trong môi trường O/F glucose. Thành
phần Guanin và Cytozin trong ADN 55-59 mol%. Thường gặp 2 loài: E. tarda, E.
ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu E. tarda là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước
ấm, đặc biệt là cá không vảy. E. ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội
tạng gan, tụy, thận của cá không vảy (Bùi Quang Tề, 2006). Ngoài ra, các chỉ tiêu sinh
hóa của E. ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính (Từ
Thanh Dung và ctv., 2004).
2.1.2.2 Phân bố
Vi khuẩn Edwardsiella xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân và mùa thu trong ao nuôi có
mật độ cao, nuôi cá lồng bè (Bùi Quang Tề, 2006). Theo Plumb (1999), E. ictaluri tồn
tại nhiều trong môi trường nước (ao nuôi, hồ) và trong lớp bùn đáy ao (trích dẫn bởi
Đặng Chí Công, 2009).
2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do các vi khuẩn Aeromonas sp.; Edwardsiella sp.
2.2.1 Trên thế giới
E. ictaluri lần đầu tiên được phân lập bởi Hawke (1979) trên cá Nheo Mỹ (Ictalurus
punctatus). Theo Plumb et al., (1995), Austin (1987) phát hiện E. ictaluri gây bệnh
nhiễm trùng máu (enteric septicemia of catfish - ESC) cấp tính cũng ở đối tượng cá nheo
Mỹ (trích dẫn bởi Đặng Chí Công, 2009).
Theo Plumb và Bowser (1983) cho rằng vi khuẩn E. ictaluri không chỉ nhạy cảm trên cá
Nheo Mỹ mà còn có thể lây nhiễm trên cá Rô phi khi tiêm vi khuẩn. Boonyaratpalin
(1985) cũng đã phát hiện vi khuẩn E. ictaluri trên cá Trê trắng (Clarias batrachus) và
trong môi trường nước ở Thái Lan J. Kasornchandra (1987) (trích dẫn bởi Phạm Thị Mỹ
Hạnh, 2004).
Theo Keskin et al., (2002) đã phân lập được E. ictaluri gây bệnh trên cá hồi
4


(Oncorhynchus mykiss) ở Thổ Nhĩ Kỳ với những đặc điểm hình thái sinh lý và sinh hóa
tương tự nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv., (2003), (trích dẫn bởi Đặng Chí Công,
2009).
Vi khuẩn E. ictaluri đã được phân lập trên cá Trê sông nâu (Ictalurus nebulosus) và vi
khuẩn này cũng được phát hiện trên cá nheo Mỹ (channel catfish) (Hawke, 1979) (trích
dẫn bởi Trần Thị Phương Thảo, 2010).
E. ictaluri cũng gây bệnh trên một số loài cá cùng giống như cá Bông lau (I. furcatus), cá
Sọc ngựa lam (Danio devario),...và cá Trê trắng (Clarias batrachus) gây thiệt hại lớn về
kinh tế trong nghề nuôi cá công nghiệp ở Mỹ (Keskin et al., 2002). Bệnh nhiễm trùng
máu (MAS) do vi khuẩn A. hydrophila (Crumlish et al., 2010).
Theo Tanasomwang và Saitanu (1979) vi khuẩn A. hydrophila còn được xác định là tác
nhân gây bệnh xuất huyết cho cá Ba sa bố mẹ nuôi trong bè gỗ. A. hydrophila gây bệnh
lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ tử vong từ 80-90% (Angka, 1990). Theo
Saitanu và Wongsawang (1982) tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do
nhiễm trùng máu trên cá Tra (trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007).
Theo Řehulka (2002), nghiên cứu về tác nhân gây bệnh lở loét trên da cá hồi
(Oncorhynchus mykiss) đã phân lập được vi khuẩn A. sobria và A. caviae trên các mẫu
cá bệnh với các triệu chứng lở loét ở da, lồi mắt, bụng đầy dịch, bong bóng hơi và gan bị
xuất huyết nghiêm trọng (trích dẫn bởi Đặng Chí Công, 2009).
Theo Bergey (1974), bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu,
bệnh sởi…là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (Trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2008). S.
iniae lần đầu tiên được phân lập từ ổ viêm mủ dưới da của cá Heo nước ngọt sông
Amazon (Inia geoffrensis) nuôi tại San Francisco, Hoa Kỳ (Pier and Madin, 1976).
2.2.3 Trong nước
Theo Bùi Quang Tề (2001) dịch bệnh trong nghề nuôi cá Tra xảy ra quanh năm nhưng
cao và nặng nhất là trong giai đoạn giao mùa, điều kiện thời tiết, nhiệt độ thay đổi đột
ngột vào mùa mưa, mùa nước đổ. Trên cá Tra bè bệnh do vi khuẩn chủ yếu do E.
ictaluri, A. hydrophila, Pseudomnas sp. và Flavobacterium columnaris (Nguyễn Quốc
Thịnh, 2006).
Theo Ferguson et al., (2001), ở Việt Nam, bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra
xuất hiện đầu tiên vào năm 1998 trên cá Tra nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long có tên là
BNP (Bacillary Necrosis of Pangasius), (trích dẫn bởi Đỗ Tiến Hảo, 2009).
Theo Từ Thanh Dung và ctv., (2003) vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trắng gan ở cá Tra
bệnh xảy ra ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá Tra, nhưng gây thiệt hại lớn nhất ở
giai đoạn cá cỡ 300-500 g với các dấu hiệu bệnh lý như cá gầy yếu, bơi lờ đờ, có hiện
tượng xuất huyết dưới da và hậu môn. Bên trong nội quan xuất hiện những đốm trắng
đường kính 1-3 mm ở gan, thận, tùy tạng và có hiện tượng nhũn thận.
5


Bệnh mủ gan hay còn gọi là gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri gây ra đang rất phổ
biến, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ
lệ chết cao (10-90%), gây thiệt hại lớn cho người nuôi (Từ Thanh Dung và ctv., 2004).
A. hydrophila còn gây bệnh xuất huyết ở bụng và chân, quẹo cổ, mù mắt, chân bại liệt…
trên ếch Thái Lan (Rana tigerina) (Trần Hồng Thủy, 2007); một số đối tượng nuôi kinh
tế khác như cá Chép, cá Mè, cá Trôi, cá Tai tượng nuôi trong ao; cá mè nuôi bè; kể cả
giáp xác như bệnh đốm nâu ở tôm Càng xanh ở Việt Nam (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2005).
Bệnh do ký sinh trùng: bệnh đốm đỏ, bệnh trắng da, phù đầu phù mắt, bệnh gan thận
mủ... do vi khuẩn Aeromonas, E. ictaluri, Pseudomonas và Vibrio gây ra. Gây thiệt hại
nghiêm trọng cho nghề nuôi cá Tra vùng đồng bằng sông Cửu Long (Từ Thanh Dung,
2008).
Bùi Quang Tề (2002) cho rằng A. hydrophila gây bệnh viêm ruột (đốm đỏ) trên cá trắm
cỏ (Ctenopharyngodon idellus) làm hoại tử ruột và vết loét ăn sâu vào cơ, tỷ lệ tử vong
lên đến 70%. Hiện tượng chết hàng loạt trong quá trình ương cá Tra bột có liên quan tới
việc cá bị sốc, cá cắn và ăn lẫn nhau tạo điều kiện cho vi khuẩn A. hydrophila tấn công
và làm chết cá (Từ Thanh Dung, 2003)
Bệnh xuất huyết và hoại tử đã được tìm thấy ở cá Trê trắng giống (Clarias batrachus) do
nhiễm vi khuẩn A. hydrophila. Ngoài ra, vi khuẩn A. hydrophila còn tìm thấy trên bệnh
phẩm cá trê (Clarias sp.) (Trần Anh Dũng, 2005). Theo Nguyễn Chung (2008), A.
hydrophila gây bệnh lở loét trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmorata) tỷ lệ chết có thể
lên đến 90% khi các điều kiện môi trường bất lợi cho vật nuôi.
Theo Bùi Quang Tề (2002) khi phân lập mẫu bệnh đốm đỏ trên cá trắm cỏ cũng thấy sự
hiện diện của A. caviae với tỷ lệ 25% trong số các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống
Aeromonas. Ngoài các tác nhân Aeromonas sp. kết hợp với A. punctala gây bệnh xuất
huyết ở cá kèo (Pseudapocryptes elongatus) gây tỷ lệ chết cao, đặc biệt là ở giai đoạn cá
nhỏ (Nguyễn Chung, 2008).
Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas sp. đã gây thiệt hại không kém nghiêm trọng cho
nghề nuôi thuỷ sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Bệnh
nhiễm trùng máu (bệnh đốm đỏ, xuất huyết…) do nhóm vi khuẩn này gây ra và thường
gặp ở các động vật thuỷ sản nước ngọt như: trắm cỏ, basa, chép, tai tượng,... Mặt khác,
chúng còn có thể gây bệnh ở baba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng
xanh. Tỉ lệ tử vong thường từ 30 - 70% (Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004).

6


2.3 Bạch hoa xà
2.3.1 Đặc điểm chung của Bạch hoa xà
Giới: Plantae
Ngành: Mangnoliophyta
Bộ: Plumbaginales
Họ: Plumbaginaceae
Chi: Plumbago
Loài: Plumbago zeylanica L
Tên tiếng Anh: Zeylanica White Leadwort
Tên tiếng Việt: Bạch hoa xà, bạch tuyết hoa, đuôi công hoa trắng

Hình 2.3: Bạch hoa xà
(nguồn: hocvienquany.vn)

Bạch hoa xà thân cao khoảng 0,3-0,6m, có thân, rễ cao, thân có đốt và nhẵn. Lá mọc so
le, hình trứng đầu nhọn, phần cuống hơi ôm vào thân, mép nguyên, không có lông, mặt
dưới hơi trắng nhạt. Hoa màu trắng, mọc thành bông ở đầu hay kẻ lá, đài hoa có lông
dài, nhớt. Tràng dài gấp hai đài. Màu hoa gần như quanh năm nhưng nhiều nhất vào các
tháng 5 - 6 (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Phân bố: Cây mọc hoang khắp nơi ở Việt Nam, ngoài ra còn thấy ở Ấn Độ, Malaysia,
nam Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Châu Phi.
2.3.2 Thành phần hóa học của Bạch hoa xà
Bạch hoa xà có chất Flavonoid, hợp chất phenol, triterpen, 0-cloroplumbagin, axit hữu
7


cơ, 3,3-biplumbagin, chitron, zeylenon, matrinon, 2-themy napthazarin,
plumbazeylanon, methylen 3,3-diplumbagin, các axit plumbagic và vanilic. Rễ chứa
plumbagin 0,91%. Hoa có 13 thành phần, plumbagin 81,85%. Bạch hoa xà chữa táo bón,
phong thấp, đau gan, đau dạ dày và ghẻ lở (Đỗ Tất Lợi, 1968).
Công thức hóa học Plumbagin là: metyl-2-hyddroxy-5-naphtoquinon-1-4 hay mytyl-2juglon . Plumbagin gây xuất huyết, dung dịch Plumbagin tiêm vào bụng chuột trắng có
chửa gây chết thai và rối loạn buồng trứng. Tại Ấn Độ, dịch chiết Plumbagin từ rễ Bạch
hoa xà được dùng điều trị ung thư thực nghiệm trên chuột giảm 70% (Đỗ Tất Lợi, 1968).
Theo Nguyễn Tuấn Quang (2003), bạch hoa xà có chứa nhóm chất thuộc quinon, thành
phần chính là chất Plumbagin (C11H8O3). Plumbagin bị khử hóa do SO2 thành di phenol.
Dịch chiết Plumbagin từ cồn: quinon, flavonoid, alcaloid, acid hữu cơ, sterol, đồng khử,
tanin, anthocynosid. Trong y học cổ truyền bạch hoa xà có vị cay, tính nóng, có tác dụng
thông hoạt huyết, sát khuẩn, tiêu viêm...
Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều bộ phận như rễ, lá và cành của cây được sử dụng như
nguồn dược liệu. Rễ cây chứa một acrid crystalline gọi là plumbagin, một naphtoquinone
màu vàng được sử dụng như dược chất ở Ấn Độ từ khoảng 750 năm trước công nguyên
dùng kháng ký sinh, bổ tim, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. Ngoài ra, nhiều hoạt chất
khác nhau được ghi nhận trong rễ cây này, bao gồm phenolic acids, tannins,
anthocyanin... có hoạt tính kháng khuẩn (Rang et al., 1996) được trích dẫn bởi Bùi Đình
Thạch và ctv., 2012.
2.4 Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản
2.4.1 Thế giới
Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom et al., (1996) nghiên cứu thành công khả năng
kháng khuẩn của các loài thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia,
Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanthus nutans, Andrographic
panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P. pulcher, P. acidus, P.
debelis, P. amarus, P. debelis và P. urinaria đối với vi khuẩn Vibrio sp. Tuy nhiên, chỉ
có hai cây P. guajava và M. charantina có hiệu quả ức chế đối với Vibrio sp. Nồng độ
ức chế tối thiểu của P. guajava là 0,625 mg/ml và M. charantina là 1,25 mg/ml
Dügenci et al., (2003) cho rằng một vài cây thuốc như: gừng (Zingiber officinale), cây
tầm ma (Viscum album), cây Tầm gửi (Urtica dioica) khi bổ sung vào trong thức ăn tạo
chất kích thích miễn dịch cho cá giúp ngăn ngừa một số bệnh như virus, vi khuẩn và nấm
(trích dẫn bởi Nguyễn Hồng Loan, 2010).
Immanuel et al., (2004) báo cáo rằng giàu hóa Artemia bằng butanolic chiết từ thực vật
(cây Thầu dầu (Ricinus communis), Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri), Húng cay đất
(Leucus aspera), Khoai mì (Manihot esculenta) và Rong biển ((Rong mơ (Ulva lactuca)
và Rong nâu (Sargassum wightii)) làm tăng tỷ lệ sống của tôm He Ấn Độ (Penaeus
8


indicus) giai đoạn giống từ 24,4 lên 43,3-58,9%, tốc độ tăng trưởng từ 1,1%/ngày lên
1,46-2,15%/ngày và giảm nồng độ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong cơ và gan
tụy từ 3,71x105 và 3,86x105 CFU/g xuống 1,36-2,03 x105 và 1,47-2,16x105 CFU/g.
(trích dẫn bởi Nguyễn Hồng Loan, 2010).
Trên cá Rô phi (Oreochromis niloticus) khi cho ăn hai loại thảo dược là Hoàng kỳ
(Astragalus membranaceus) và Kim ngân (Lonicera japonica) với hàm lượng 0,1%
trong 4 tuần. Kết quả cho thấy hệ miễn dịch của cá được tăng cường. Hoạt động của đại
thực bào, hô hấp của tế bào máu được tăng cường và tỷ lệ sống tăng lên (Ardó et al.,
2008), (trích dẫn bởi Nguyễn Hồng Loan, 2010).
Theo Yin et al., (2008) khi nuôi cá chép kết hợp tiêm vắc-xin và cho ăn 2 loại thảo dược
là Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) làm kích thích
hoạt động hô hấp, sự thực bào của bạch cầu trong máu. Cá chép được gây cảm nhiễm với
vi khuẩn A. hydrophila có tỷ lệ sống cao. Tỷ lệ sống cao nhất 60% là nhóm cá có tiêm
vắc-xin và được nuôi bằng cả 2 loại thảo dược, trong khi đó hầu như 90% cá đối chứng
(kiểm soát âm tính) và 60% cá chỉ được tiêm vắc-xin (kiểm soát dương tính) đã chết.
Theo Harikrishnan et al., (2009), cá vàng (Carassius auratus) và cá chép gây cảm nhiễm
nhân tạo bằng A. hydrophila được ăn kết hợp Probiotics (Lactobacillus sp. và Sporolac
sp.) và 3 loại thảo dược. Kết quả cho thấy probiotics và thảo dược đều có tác dụng giúp
cá hồi phục tốt sau 24 ngày (trích dẫn bởi Nguyễn Hồng Loan, 2010).
Tại Trung Quốc, Zheng et al., (2009) chứng minh tinh dầu cây lá thơm Orengano
(Origanum heracleoticum) thêm vào khẩu phần thức ăn cá Nheo bị nhiễm A. hydrophila
thì cá vẫn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,005) và chức năng
gan và các cơ quan nội tạng được cải thiện (P < 0,005).
Nghiên cứu và báo cáo khoa học trên thế giới công bố tỏi có thể loại bỏ hiệu quả các loài
vi khuẩn chủ yếu trên nước ngọt bao gồm Pseudomonas fluorescens, Myxococcus
piscicola, Vibrio anguillarum, E. tarda, A. punctata, Flexibacter intestinalis và Yersinia
ruckeri (Lee, 2012), (trích dẫn bởi Trần Hồng Thủy và ctv., 2013)
2.4.2 Trong nước
Trong lịch sử y học cổ truyền Việt Nam, từ thế kỷ 17 vấn đề nghiên cứu về cây thuốc để
trị bệnh cho người và động vật đã phát triển. Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh với hai tác phẩm “
Nam dược thần hiệu” và “Hồng nghĩa gia thủ thư” đã mô tả, tóm tắt hơn 600 vị thuốc
trong 3.873 bài thuốc dân . Lương y Lê Hữu Trác tức Hải Thượng Lãn Ông (1720 1791) là tác giả của 30 tập sách về y học cổ truyền Việt Nam. Sau đó, Đỗ Tất Lợi
(2/1/1919 - 3 /2/2008) đã nghiên cứu và biên soạn cuốn sách “Medicinal Plants and
Drugs from Vietnam” dày hơn 1.200 trang về cây thuốc, động vật và khoáng vật làm
thuốc ở Việt Nam (Đỗ Tất Lợi Và Nguyễn Xuân Dũng, 1991).

9


Trong thủy sản, việc sử dụng các thảo dược trong việc phòng bệnh đã được nghiên cứu
từ lâu. Những nghiên cứu bàn về tiềm năng sử dụng kháng sinh thảo mộc trong việc
phòng và chữa trị bệnh nhiễm khuẩn mà tác giả Nguyễn Thị Vân Thái và ctv., (2006).
Một số thảo mộc có hoạt chất sinh học có thể sử dụng như: Hành (Allium fistulosum), tỏi
(Allium sativum L.) có chất alixin có tác dụng kháng khuẩn mạnh (Bùi Quang Tề và ctv.,
2006a).
Theo Abdul và Rachender, (1995). Dịch chiết xuất từ cây Bạch hoa xà có thể ngăn chặn
sự tăng trưởng của chủng E. coli và vi khuẩn Shigella với MIC: 0,64 - 10,24 ppm. Ngoài
ra, khi chiết xuất cây Bạch hoa xà bằng ethyl acetate, dịch chiết thu được có tác dụng ức
chế vi khuẩn Helicobacter pylori trong ống nghiệm (trích dẫn bởi Nguyễn Gia Hoàng
Diễm, 2012).
Chiết xuất từ lá Trầu có khả năng tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Lagenladium, chủng
nấm này gây bệnh phổ biến trên tôm nước lợ, mặn. Dịch chiết lá Trầu có khả năng ức
chế, tiêu diệt các loại vi khuẩn A. hydrophyla và Vibrio sp. (Nguyễn Ngọc Phước và ctv,
2006).
Theo Nguyễn Thế Vương (2009) 4 loại thảo dược: Tỏi (Allium sativum L.), lá Húng
(Ocimum basilicum L), cây Rau má (Centell asiatica), cây Diếp cá (Houttuynia cordata)
có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi; trong đó Tỏi có khả
năng kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng khuẩn 23,6 ± 0,89 mm, diếp cá
và rau má có đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ nhất. Bên cạnh đó các chất chiết từ nấm
Linh chi, Hoàng kỳ, Sài đất, Nhọ nồi, Tỏi, Kim ngân, lá Ổi, Gừng và Cỏ mực... đã được
nghiên cứu sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thủy sản. Phối hợp chất chiết từ
tỏi (Alltium sativum) và sài đất (Weledia calendualacea) có thể phòng trị được bệnh
mềm vỏ do Vibrio spp. (Bùi Quang Tề và ctv, 2006a). Tỉ lệ cá chết do nhiễm vi khuẩn E
.ictaluri thấp cho ăn Hoàng kỳ và tiêm vắc-xin (Nguyễn Hồng Loan, 2010).
Dịch chiết từ 3 loại thảo dược Diệp hạ châu đỏ, Diệp hạ châu xanh, Bạch hoa xà có tác
dụng kháng vi khuẩn E. ictaluri. Trong đó, lá Diệp hạ châu đỏ cho khả năng kháng
khuẩn mạnh nhất (đường kính vòng kháng khuẩn bằng 12 mm). Ngoài ra, các dịch chiết
thảo dược Diệp hạ châu đỏ, Diệp hạ châu xanh, Bạch hoa xà có tác dụng mạnh nhất tỷ lệ
chiết tách 1:1, tiếp theo là tỷ lệ 1:2 và 1:3 (Nguyễn Gia Hoàng Diễm, 2012).

10


CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015.
Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh Khoa Sinh học ứng dụng - Trường Đại học Tây Đô,
khu vực Lộ Hậu Thạnh Mỹ, phường Lê Bình, quận Cái Răng, Thành phố Cần Thơ.
3.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Nguồn vi khuẩn: bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản - Khoa Thủy sản - Trường Đại học
Cần Thơ cung cấp vi khuẩn Aeromonas sp. và vi khuẩn Edwardsiella sp.
Nguồn thảo dược: Bạch hoa xà thu thập từ Vườn thuốc Nam - Đại học Tây Đôđược xác
định thông qua hình dạng bên ngoài dựa trên sự miêu tả của Đỗ Tất Lợi (1968).
3.2.2 Dụng cụ
Nồi khử trùng bằng áp suất (Autoclauve).
Máy khuấy từ, cân điện tử 4 số lẻ.
Tủ cấy vi sinh, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh.
Bộ dao tiểu phẩu, bộ đèn cồn, dụng cụ thủy tinh (cốc đong, ống thủy tinh, chai nấu môi
trường 500 ml), đĩa petri, đũa tán thủy tinh, micropipette, que cấy đầu tròn.
Khay nhựa, giá để ống thủy tinh, giấy bạc.
Một số dụng cụ cần thiết khác.
3.2.3 Hóa chất
Môi trường Nutrient Agar (NA).
Môi trường Nutrient Broth (NB).
Môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHI).
Cồn 90o, cồn 70o, nước cất, NaCl, nước muối sinh lý.

11


3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Sơ đồ tổng quát các bước về tiến trình thực hiện
Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Aeromonas sp.; Edwardsiella sp. bằng dịch chiết
Bạch hoa xà được thực hiện theo một trình tự gồm các bước như sau:

Dự trữ vi khuẩn

Phục hồi và tách ròng vi khuẩn

Xác định nồng độ vi khuẩn

Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết thảo dược

Hình 3.1: Sơ đồ tổng quát các bước về tiến trình thực hiện
Phương pháp pha chế môi trường và kỹ thuật vô trùng (Phụ lục A).
Phương pháp cấy ria (Phụ lục A).
Phương pháp pha loãng (Phụ lục A).
Phương pháp xác định nồng độ khuẩn lạc (Phụ lục A).
3.3.2 Phương pháp chiết xuất Bạch hoa xà
Bạch hoa xà được chiết xuất bằng 3 phương pháp như sau:
Phương pháp 1: chiết xuất Bạch hoa xà với nước cất đun ở 98oC trong 3 giờ.
Bạch hoa xà được xay nhuyễn với các tỷ lệ thể tích thảo dược : nước lần lượt bằng 1:1,
2:1, 3:1. Hỗn hợp được đun sôi ở nhiệt độ 98oC trong 3 giờ, để nguội, lọc qua giấy lọc để
thu dịch chiết, định mức lại với nước cất để đạt tỷ lệ như ban đầu và bảo quản ở nhiệt độ
4 - 6oC.
Phương pháp 2: chiết xuất Bạch hoa xà với cồn 70o ngâm trong 3 ngày.
Bạch hoa xà được xay nhuyễn trong cồn 70o với các tỷ lệ thể tích thảo dược : cồn lần
lượt bằng 1:1, 2:1, 3:1. Hỗn hợp được ngâm ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày, lọc
qua giấy lọc để thu dịch chiết, định mức lại với cồn để đạt tỷ lệ như ban đầu và bảo quản
ở nhiệt độ 4 - 6oC.
Phương pháp 3: chiết xuất Bạch hoa xà với cồn 70o và ngâm trong 6 ngày.
Ngâm lá Bạch hoa xà xay nhuyễn trong cồn 70o với các tỷ lệ thể tích thảo dược : cồn lần
lượt bằng 1:1, 2:1, 3:1. Hỗn hợp được ngâm ở nhiệt độ phòng trong thời gian 6 ngày, lọc
12


qua giấy lọc để thu dịch chiết, định mức lại với cồn để đạt tỷ lệ như ban đầu và bảo quản
ở nhiệt độ 4 - 6oC.
3.3.3 Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà
Bảng 3.1: Theo dõi tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi khuẩn
Aeromonas sp., Edwardsiella sp. bằng bằng 3 phương pháp khác nhau
Tỷ lệ BHX:
dung môi

Vdịch chiết (l)

Số lần lặp lại/pp và
mật độ vk

Mật độ vi khuẩn
(cfu/ml)
Aeromonas sp. Edwardsiella sp.

PP1

PP2

PP3

1:1

50

50

50

3

103,106 ,109

103,106 ,109

2:1

50

50

50

3

103,106 ,109

103,106 ,109

3:1

50

50

50

3

103,106 ,109

103,106 ,109

Đối chứng

50

50

50

3

103,106 ,109

103,106 ,109

3.4 Các bước tiến hành xác định vòng kháng khuẩn
Mô tả phương pháp xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà
Sau khi thu được các dung dịch từ các phương pháp ly trích trên, tiến hành xác định hiệu
quả kháng khuẩn trên vi khuẩn theo phương pháp đục lỗ thạch (Sarkar & Banerjee,
1996). Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng theo các trình tự sau:
Bước 1: Môi trường thạch sau khi được chuẩn bị, đổ 20 ml dung dịch môi trường trên
mỗi đĩa petri và để thạch đặc lại.
Bước 2: Dàn đều 50 l dung dịch chứa vi khuẩn Aeromonas sp.; Edwardsiella sp. tương
ứng từng mật độ vi khuẩn 103, 106, 109 cfu/ml bằng que trải vi khuẩn lên mặt thạch, để
khô tự nhiên.
Bước 3: Đục lỗ thạch: tiến hành đục 4 lỗ giếng bằng đầu cone có đường kính 6
mm/giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng 50 µl dịch chiết thảo dược rồi giữ ở nhiệt độ 320 C trong tủ ấm. Sau
24 giờ mẫu được lấy ra xác định độ dài đường kính vòng tròn kháng khuẩn.
Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn.
Tiến hành đo đường kính vòng trong kháng khuẩn bằng thước nhựa 20cm (Jan Hudzicki,
2009).

13


Bảng 3.2: E. coli and other enteric gram - negative rods (Nguồn: microbelibrary.org)
Amikain (30 µg)
Amipicillin (10 µg)
Cefazolin (30 µg)
Gentamicin (10 µg)
Tetracyciline (30 µg)
Ticarcillin (75 µg)
Trimethoprim (5 µg)
Tobramycin (10 µg)

Resistant
≤ 14
≤ 13
≤ 14
≤ 12
≤ 14
≤ 14
≤ 10
≤ 12

Intermediate
15 – 16
14 – 16
15 – 17
13 – 14
15 – 19
15 – 19
11 – 15
13 – 14

Susceptible
≥ 17
≥ 17
≥ 18
≥ 15
≥ 19
≥ 20
≥ 16
≥ 15

3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập sẽ được xử lý bằng phần mềm Microsoft office Excel và SPSS.
Viết bài bằng phần mềm Microsoft Word.

14


CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà chiết xuất bằng phương pháp
đun với nước cất ở 98oC trong 3 giờ.
4.1.1 Tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch chiết từ cây Bạch hoa xà được
đun trong nước cất ở 98oC trong 3 giờ với các tỷ lệ khác nhau thì các quả vòng kháng
khuẩn khác nhau được thể hiện qua bảng 4.1
Bảng 4.1: Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà trên vi khuẩn
Aeromonas hydrophila
Tỷ lệ BHX : dung môi

1:1
2:1
3:1
Đối chứng

Trung bình đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Aeromonas hydrophila
103
106
109
10,0 ± 0,3aA
10,3 ± 0,4aA
10,0 ± 0,9aA
aA
bA
11,4 ± 1,1
11,4 ± 0,3
10,6 ± 0,5aA
12,5 ± 0,7bA
12,3 ± 0,1cA
12,3 ± 0,4bA
0
0
0

Ghi chú: Giá trị thể hiện là số trung bình và độ lệch chuẩn.
Các giá trị có chữ cái giống nhau trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Các giá trị có chữ cái giống nhau trong cùng một dòng thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P >
0,05).
Đường kính vòng vô trùng có tính đường kính miệng giếng 6 mm.

Đường kính vòng kháng khuẩn tỷ lệ thuận với tỷ lệ Bạch hoa xà : dung môi và đạt cao
nhất ở tỷ lệ 3:1. Tuy nhiên đường kính vòng tròn vô trùng không bị ảnh hưởng bởi mật
độ vi khuẩn. Tương ứng mỗi tỷ lệ Bạch hoa xà : dung môi, khả năng kháng khuẩn đều
khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Ở mật độ vi khuẩn 106, tính kháng khuẩn của dịch chiết Bạch hoa xà là tốt hơn (10,3 12,3mm) so với mật độ vi khuẩn 103, 109 cfu/ml tương ứng từng tỷ lệ dịch chiết, tuy
nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Mặc dù mật độ vi khuẩn là 103
cfu/ml, nhưng đường kính vòng kháng khuẩn ở tỷ lệ 3:1 đạt (12,5 mm) và tương đương
đường kính đạt được ở mật độ vi khuẩn 106 và 109 cfu/ml là 12,3 mm và khác biệt không
có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Ở tỷ lệ 3:1, với mật độ vi khuẩn 109 cfu/ml cho kết quả đường kính vòng kháng trên vi
khuẩn Aeromonas hydrophila là 12,3 mm không khác biệt có ý nghĩa so với các mật độ
vi khuẩn 103 và 106 cfu/ml chứng tỏ nồng độ hoạt chất kháng khuẩn của Bạch hoa xà cao
tương đương với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Minh, 2013 khi “Phối hợp dịch
chiết Diệp hạ châu đỏ và kháng sinh trong điều trị vi khuẩn Aeromonas hydrophila ” đã
cho kết quả đường kính vòng kháng khuẩn (12 mm) với các tỷ lệ 6/4 Norfloxacin. Qua
đó cho thấy dịch chiết Bạch hoa xà đượ chiết xuất bằng phương pháp đun với nước cất
15


x

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×