Tải bản đầy đủ

Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp p24, GP41, GP120 trong chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex

1

MỤC LỤC


2

DANH MỤC BẢNG


3

DANH MỤC CÁC HÌNH


4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
HIV

Human immunodeficiency
virus
Gag
Group-associated anti- gen
Env
envelop
Pol
polymerase
RT
Reverse transcriptase
WB
Western blot
IFA
Elisa
Gp
DNA
cDNA
Trx
Trx- 120

Immunofluoresscence
Enzyme linked immune
sorbent assay
Glycoprotein
Deoxyribonucleic acid
Comlemetary DNA
A gen encodes thioredoxin A
of E. Coli, wich is available in
plasmide pET32a(+)
A recombinant fusion is
encoded by a fusion gên of trx
and gp120, produced in E. coli

Trx- gp41

A recombinant fusion is
encoded by a fusion gen of trx
and gp 41, produced in E. coli

Trx-p24


A recombinant fusion is
encoded by a fusion gen of trx
and p24, produced in E. coli

PBS
SDS
TBS
TEMED

Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfat
Tris buffered saline
N,N,N’,N’- tetramethyl
ethylenediamine
Joint United Nations
Programme on HIV/AIDS
World Health Organization
United Nations Children's
Emergency Fund

UNAID
WHO
UNICEF

Tiếng việt
virus suy giảm miễn dịch ở người
Kháng nguyên liên kết nhóm
Vỏ
Enzym kéo dài
Enzym phiên mã ngược
Kỹ thuật miễn dịch trên màng
polyvinyliden difluorit
Kỹ thuật miến dịch huỳnh quang
Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym
Glycoprotein
acid deoxyribonucleic
DNA bổ trợ
Gen mã hóa thioredoxin A của
E.coli được thiết kế sẵn trong
plasmide pET32a(+)
Protein tái tổ hợp dạng lai được
mã hóa từ gen trx dung hợp với
gen gp120, được tổng hợp trong
E.coli
Protein tái tổ hợp dạng lai được
mã hóa từ gen trx dung hợp với
gen gp41, được tổng hợp trong
E.coli
Protein tái tổ hợp dạng lai được
mã hóa từ gen trx dung hợp với
gen p24, được tổng hợp trong
E.coli
Đệm phosphat saline
Natri dodexin sulfat
Đệm saline
N,N,N’,N’- tetramethyl
ethylenediamine
Chương trình phối hợp của liên
hợp quốc về HIV/ AIDS
Tổ chức y tế thê giới
Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp Quốc


5

AIDS
CD4
BSA
mARN

acquired immunodeficiency
syndrome
cluster of differentiation 4
Bovine serum albumin
Messenger ribonucleic acid

Hội chứng suy giảm miễn dịch
mắc phải
Tế bào CD4
Huyết thanh bò
ARN thông tin


6

ĐẶT VẤN ĐỀ
HIV là virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch ở người. Từ một căn
bệnh không được ai biết đến nay đã trở thành nỗi sợ hãi, ám ảnh của hàng
triệu người trên toàn cầu. Kể từ trường hợp nhiễm đầu tiên được ghi nhận vào
năm 1981, đến nay HIV đã lan rộng ra hầu hết các nước trên thế giới. Theo
thống kê của Tổ chức y tế thế giới và Chương trình phối hợp của Liên Hợp
Quốc về phòng chống HIV/AIDS, tính đến tháng 12/2007 toàn thế giới có
33,2 triệu người nhiễm HIV/AIDS còn sống, 95% số người nhiễm ở các nước
nghèo và đang phát triển. Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh
hưởng nặng nề của đại dịch này.
Do tính chất nguy hiểm của bệnh, để đảm bảo an toàn trong truyền máu
và tầm soát bệnh, tránh lây lan, bùng phát dịch trong cộng đồng, việc phát
triển các kit chẩn đoán HIV là vô cùng cần thiết. Tuy nhiên, tại Việt Nam, tất
cả các kit đang sử dụng trong chẩn đoán đều nhập ngoại với giá thành cao, độ
đặc hiệu chưa thể đánh giá được do các hãng sản xuất giữ bí mật phân type
HIV sử dụng trong sản xuất chế phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu phát triển các
chế phẩm chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao cho các chủng HIV lưu
hành trong nước có ý nghĩa rất lớn cả về mặt thực tiễn và lâm sàng. Từ kết
quả nghiên cứu gần đây của TS. Bạch Thị Như Quỳnh và cộng sự tại viện
Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam công
bố đã biểu hiện thành công 3 kháng nguyên quan trọng của virus HIV (p24,
gp41 và gp120) dựa trên phân type HIV lai CRF01-AE lưu hành chủ yếu tại
Việt Nam là tiền đề hết sức thuận lợi để chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ứng
dụng kháng nguyên tái tổ hợp P24, GP41, GP120 trong chẩn đoán HIV
bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex”. Đề tài nhằm thực hiện 2 mục tiêu:
1. Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp p24, gp41, gp120 tạo sinh phẩm thử

nghiệm chẩn đoán HIV dựa trên kỹ thuật ngưng hạt latex


7

2.

Đánh giá độ tương đồng trong khả năng phát hiện HIV giữa sinh phẩm ngưng
kết hạt latex và kit nhập ngoại trên huyết thanh bệnh nhân.


8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1

Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam và trên thế giới
1.1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới
Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới WHO, chương trình Phối hợp

của Liên Hợp Quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) và Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp
Quốc (Unicef) năm 2010, có khoảng 34 triệu người sống chung với HIV trên
toàn thế giới, trong đó có 3,4 triệu trẻ em dưới 15 tuổi. Chỉ tính riêng năm
2010 đã có thêm 2,7 triệu ca nhiễm mới HIV, 390 000 ca trong số đó là trẻ
em dưới 15 tuổi [10]. Sự phân bố tỷ lệ nhiễm mới HIV trên toàn thế giới
không đồng đều giữa các quốc gia và khu vực. Cụ thể, Sub-Saharan Châu Phi
là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất với 70% tổng số ca nhiễm mới trên
toàn thế giới, tiếp theo là khu vực Đông Nam Á (17%) và một số quốc gia
đang phát triển khác [10].
Mặc dù số trường hợp nhiễm HIV vẫn đang gia tăng nhưng tỷ lệ nhiễm
đang có xu hướng giảm trong những năm qua. Theo số liệu thống kê tại 39
quốc gia từ năm 2001 đến 2011cho thấy, tỷ lệ nhiễm HIV trong nhóm người
trưởng thành đã giảm hơn 25%. Riêng khu vực châu Phi cận Sahara, số lượng
người nhiễm HIV trong năm 2011 là 1,8 triệu người, thấp hơn đáng kể so với
2,4 triệu người vào năm 2001 [11].
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam
Tại Việt Nam, kể từ ca nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện năm 1990,
tính đến ngày 31/12/2014 toàn quốc có 226,964 trường hợp nhiễm HIV, trong
đó 71,433 người đã chuyển sang giai đoạn AIDS và có tới 71,368 người đã tử
vong do căn bệnh này. Trong những năm gần đây, số người nhiễm HIV được
phát hiện với khoảng 12,000 – 14,000 ca mắc mới mỗi năm. Tính đến 2014,
100% số tỉnh thành, 98.9% quận huyện và 80.3% xã phường đã có người
nhiễm HIV. Dịch HIV ở Việt Nam tập trung chủ yếu ở 3 nhóm quần thể có
hành vi nguy cơ lây nhiễm HIV cao là người tiêm chích ma túy, nam quan hệ


9

tình dục đồng giới và phụ nữ bán dâm [20].
1.2.

Đặc điểm chung của HIV
1.2.1. Hình thái và cấu trúc HIV

Hình 1.1. Hình thái ngoài và cấu trúc của virus HIV
Virus HIV (gồm HIV-1 và HIV-2) thuộc vào họ Retroviridae,
giống Lentivirus [1]. HIV có dạng hình cầu, đường kính hạt virus 80-100 nm
[2]. Hạt virus HIV hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3 lớp.
-

Lớp vỏ ngoài (envelop) cấu trúc bởi một màng lipid kép [7]. Trên màng

có các gai nhú glycoprotein liên kết đặc hiệu với các thụ thể trên màng sinh
chất tế bào chủ có trọng lượng phân tử 160 kDa (gp160), gồm 2 phần:
+ Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân tử 120 kDa (gp120)
+ Glycoprotein xuyên màng có trọng lượng phân tử 41 kDa (gp41) [8]
-

Vỏ capsid gồm 2 lớp protein:
+ Lớp ngoài hình cầu có trọng lượng phân tử 18 kDa (p18).
+ Lớp trong hình trụ có trọng lượng phân tử 24 kDa (p24).

gp120, gp41 và p24 là những kháng nguyên rất quan trọng để chẩn đoán
HIV.
-

Lõi nằm bên trong của vỏ capsid là vật chất di truyền của HIV gồm hai

phân tử ARN mạch đơn, chuỗi dương. Hệ gen HIV chứa 3 nhóm gen cấu trúc:
+ Gen gag (group specific antigen) là các gen mã hoá cho các kháng
nguyên đặc hiệu trên vỏ capsid của virus.


10

+ Gen pol (polymerase) mã hoá cho các enzyme phiên mã ngược (RT Reverse transcriptase), protease và endonuclease (còn gọi là integrase).
+ Gen env (envelop) mã hoá cho glycoprotein vỏ ngoài của HIV [2].
1.2.2. Chu trình sống HIV
Chu trình sống của virus HIV được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.

Hình 1.2: Chu trình sống của HIV
(1)

Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào: Do sự phù hợp cấu trúc giữa

gp120 với thụ thể biểu hiện trên màng tế bào, HIV có thể hấp phụ lên bề mặt
tế bào chủ. Trong đa số các trường hợp, thụ thể này là CD4 biểu hiện trên bề
mặt tế bào lympho T hỗ trợ (T-help) hoặc một số tế bào khác như bạch cầu
đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào dòng lympho B [2].
(2)

Sự xâm nhập vào tế bào: Sau khi bám vào thụ thể trên tế bào vật

chủ, gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào, nhờ đó bộ gen của HIV chui
vào bên trong tế bào. Một số tế bào không có thụ thể CD4 như tế bào thần


11

kinh đệm và tế bào sợi, gp41 đóng vai trò thay thế cho gp120 liên kết với tế
bào chủ, đồng thời giúp HIV tránh được tác dụng của kháng thể[9].
(3)

Sự phiên mã ngược: Dưới tác dụng của enzym phiên mã ngược

(Reverse transcriptase), cADN bổ sung đã được tạo thành từ khuôn ARN
mạch đơn của HIV tạo nên sản phẩm lai ARN-ADN. Sau đó dưới tác dụng
của enzym, ARN tách khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo
thành phân tử ADN chuỗi kép.[12]
(4)

Sự tích hợp: Ở giai đoạn này phân tử ADN mạch kép sẽ chuyển

sang dạng vòng khép kín, chui vào trong nhân rồi tích hợp với ADN của tế
bào chủ nhờ enzyme integrase để tránh sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc
và làm chậm quá trình diễn tiến của bệnh. Sau khi tích hợp, ADN của HIV
tồn tại ở một trong 2 trạng thái: không hoạt động và nằm im như tiền virus,
trạng thái tiềm tàng này có thể hoạt động như những virus độc lực dưới các
tác động của môi trường; hai là dạng hoạt động, ADN bổ sung của HIV được
sao chép thành các hạt virion mới.
(5)

Giai đoạn sinh tổng hợp: Giai đoạn này ADN bổ sung của HIV

được phiên mã thành ARN genome và ARN thông tin (mARN) để dịch mã
thành các protein (enzyme, protein vỏ,..) của thế hệ virus HIV mới [13].
(6)

Giai đoạn lắp ráp: Từ các thành phần đã được tổng hợp, các hạt

virus mới được lắp ráp ở bào tương tế bào chủ [14].
(7)

Giai đoạn phóng thích: Từ vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng

nguyên sinh chất, HIV nảy chồi thoát khỏi tế bào chủ. Sau đó các hạt virus
này tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới trong khi các tế bào chủ đã giúp chúng
nhân lên bị tiêu diệt [15].


12

1.2.3. Phân loại HIV
HIV có hai type gây bệnh trên người là HIV-1 và HIV-2. Cả hai týp đều
lây truyền qua quan hệ tình dục, qua máu và từ mẹ sang con, và dường như
bệnh cảnh lâm sàng AIDS của chúng giống nhau. Tuy nhiên, HIV-2 khó lây
truyền hơn và thời kỳ giữa sơ nhiễm HIV-2 đến biểu hiện bệnh dài hơn. Trên
thế giới, chủ yếu là nhiễm HIV-1, type HIV-2 tương đối ít gặp, tập trung ở
Tây Phi và hiếm gặp ở các châu lục khác. Riêng HIV-1 có thể được xếp lớp
vào 4 nhóm: M, O và 2 nhóm mới N và P. Bốn nhóm này có thể đại diện cho
4 sự thâm nhập riêng rẽ của virus suy giảm miễn dịch của loài linh trưởng vào
con người. Trong đó nhóm O xuất hiện giới hạn ở khu vực Tây – Trung Phi;
nhóm N –được phát hiện năm 1998 ở Cameroon – là nhóm cực kỳ hiếm;
nhóm P – phát hiện lần đầu tiên ở một phụ nữ người Cameroon năm 2009
[16]. Nhóm này có liên quan gần gũi với virus suy giảm miễn dịch ở loài khỉ
đột (gorilla); nhóm M – chiếm tới hơn 90% người nhiễm HIV-1. Trong nhóm
M, người ta biết có ít nhất 9 subtype có đặc điểm di truyền khác biệt nhau chủ
yếu ở vùng V3 của gen chi phối gpl20, kí hiệu từ A đến K [17].
Đôi khi, 2 virus thuộc các subtype khác nhau có thể gặp nhau trong tế
bào của một người nhiễm và pha trộn với nhau về vật liệu di truyền để tạo nên
một virus lai tạo mới (một tiến trình tương tự với sự sinh sản giới tính). Nhiều
chủng trong số các loại virus mới này không thể sống sót lâu dài, nhưng một
số dạng virus lai khả ổn định. Chính vì khả năng tái tổ hợp phức tạp của HIV
đang xuất hiện ngày càng nhiều và liên tục biến đổi đã làm cho việc nghiên
cứu về HIV ngày càng phức tạp và khó khăn. Trong nghiên cứu của TS. Bạch
Thị Như Quỳnh và cộng sự, CRF01-AE (là subtype lai giữa phó type A với
phó type E của thế hệ cha mẹ khác) đã được chứng minh là subtype lưu hành
phổ biến nhất ở Việt Nam [3].


13

1.2.4. Triệu chứng
Thời gian trung bình từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS
khoảng 10 - 12 năm. Mỗi giai đoạn bệnh liên quan chặt chẽ đến số lượng tế
bào CD4 [2].
(1)

Giai cấp tính: kéo dài từ 3 – 6 tháng sau hành vi nguy cơ. Ở giai

đoạn này nồng độ HIV có thể lên đến vài triệu hạt virus/ml máu. Số lượng tế
bào T-CD4+ bị giảm đáng kể nhưng có đến 80% người bị nhiễm virus hoàn
toàn không có biểu hiện gì của bệnh, 20% còn lại có một số những biểu hiện
nhiễm trùng cấp như: sốt, đau cơ khớp, nôn, tiêu chay, phát ban, hạch to…
Các triệu chứng này hiện diện trong vòng 5-10 ngày rồi tự khỏi hoàn toàn.
Trong giai đoạn này rất khó phát hiện được kháng thể kháng HIV.
(2)

Giai đoạn mạn tính: nhờ sự bảo vệ mạnh mẽ của hệ miễn dịch sẽ

làm giảm số lượng của các hạt virus trong máu, cơ thể chuyển sang giai đoạn
nhiễm HIV mạn tính. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 2 tuần-20 năm tùy theo
từng người mà không có bất kể triệu chứng gì.
(3)

Giai đoạn AIDS: số lượng các tế bào CD4+ giảm xuống dưới 200

tế bào/1ml máu, sự miễn dịch qua trung gian tế bào bị vô hiệu và xuất hiện
nhiễm trùng do một loạt các vi sinh vật cơ hội gây ra. Các triệu chứng đầu
tiên thường bao gồm giảm cân vừa phải và không giải thích được, nhiễm
trùng đường hô hấp tái phát (như viêm xoang, viêm phế quản, viêm tai
giữa, viêm họng), viêm tuyến tiền liệt, phát ban da, và loét miệng.
1.3.

Kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV
Phương pháp chẩn đoán gián tiếp sự có mặt của HIV là phương pháp

dùng kháng nguyên đã biết của HIV phát hiện kháng thể kháng HIV có trong
các dịch cơ thể (máu, dịch tiết,...). Để kiểm tra kháng thể đối với HIV cần ít


14

nhất hai kỹ thuật: kỹ thuật sàng lọc và ít nhất một kỹ thuật khẳng định. Các kỹ
thuật phát hiện sàng lọc cần độ nhạy rất cao để giảm thiểu nguy cơ cho kết
quả âm tính giả. Điều này có nghĩa rằng các xét nghiệm này phải có thể phát
hiện sự sự có mặt của kháng thể kháng HIV ở nồng độ rất thấp, ví dụ trong
giai đoạn đầu của quá trình nhiễm trùng nguyên phát. Nếu kết quả của một
xét nghiệm sàng lọc là dương tính, kết quả này phải được khẳng định bởi (ít
nhất) một xét nghiệm khẳng định khác có độ đặc hiệu cao. Không bao giờ
được chẩn đoán sự nhiễm HIV dựa trên kết quả dương tính của duy nhất một
kỹ thuật sàng lọc. Mặt khác, để loại trừ việc vô ý làm lẫn mẫu xét nghiệm,
người ta thường xét nghiệm thêm một mẫu máu thứ hai của cùng một bệnh
nhân. Chỉ khi đó, kết quả chẩn đoán HIV mới có thể cho thông báo cho bệnh
nhân. Hầu hết các kỹ thuật kiểm tra sàng lọc đều dựa trên nguyên lý của phản
ứng Elisa (enzyme linked immune sorbent assay) hoặc các xét nghiệm tương
tự (UNAIDS, 1997b).
1.3.1. Kỹ thuật ngưng kết (agglutination)
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt như
gelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho các
protein virus. Khi cho tiếp xúc với kháng thể kháng HIV, các hạt này tạo
thành một mạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường. Đây là kỹ
thuật đơn giản, nhanh, không đòi hỏi trang bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo
quản, đồng thời có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở với các xét nghiệm viên có
thể được đào tạo nhanh. Nhờ các ưu điểm ấy, kỹ thuật này có thể tiến hành
hàng loạt nên có ý nghĩa điều tra dịch tễ, sàng lọc máu tại các ngân hàng máu
nhỏ [21]. Tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật là có thể xảy ra phản ứng dương
tính giả. Hiện nay kit test nhanh dựa trên nguyên lý kỹ thuật ngưng kết sử
dụng thường quy tại các cơ sở y tế hiện nay là Serodia HIV 1/2 kit


15

(Fujirebio Inc., Tokyo, Nhật Bản). Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin
bao gồm protein tái tổ hợp gp41, p24 của HIV-1 và gp36 của HIV-2.
1.3.2. Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA
ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm
có kháng thể kháng HIV. Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do
đó có thể cho những kết quả dương tính giả. ELISA được ứng dụng để phát
hiện các kháng thể IgG anti-HIV, IgA anti-HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ
thuật sau:

Kỹ thuật ELISA gián tiếp
Kháng thể kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với
kháng nguyên HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng
trên hạt nhựa). Phức hợp kháng nguyên - kháng thể được nhận biết bởi một
cộng hợp là kháng thể kháng Ig người có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng
hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu
tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử. Đây là
xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao do thường bị dương
tính giả.[6]
Kỹ thuật ELISA Sandwich
Kháng thể kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các kháng
nguyên virus trong mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme.
Giá trị mật độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với kháng nguyên hiện
diện trong mẫu thử. ELISA sandwich thường được sử dụng để phát hiện
kháng nguyên p24 của HIV trong chẩn đoán sớm HIV [18].
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA)


16

Nguyên lý của IFA cũng tương tự ELISA nhưng chất gắn đánh dấu là
chất màu huỳnh quang và kết quả được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phản ứng dương tính được thể hiện bằng những tế bào bị nhiễm HIV phát
quang ở ngoại vi.
1.3.3. Kỹ thuật Western Blot (WB)
Do hạn chế của ELISA là dương tính giả nên để hạn chế nguy cơ này,
cần phải có phương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đoán của ELISA.
Western Blot (WB) là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kết
quả dương tính của ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thay
thế cho WB. Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên nguyên lý ELISA gián tiếp thực
hiện trên băng giấy, cho phép xác định kháng thể kháng các thành phần khác
nhau của protein virus. Có WB riêng cho HIV-1 và HIV-2.
HIV được ly giải và điện di trên gel polyacrilamide để phân tách các
thành phần kháng nguyên virus theo trọng lượng phân tử, sau đó được chuyển
lên màng nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) và được cắt
thành từng dải băng để sử dụng. Mỗi dải băng dùng cho một mẫu thử nghiệm.
Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy. Nếu trong mẫu thử có Kháng thể
kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là kháng nguyên tương
ứng và được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể kháng Ig người đã được
đánh dấu bằng enzyme cho màu phản ứng với cơ chất. Vị trí các băng màu
tương ứng với thành phần protein virus gắn với kháng nguyên đặc hiệu. Giá
trị: Xét nghiệm khẳng định WB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được thực
hiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọc không phù
hợp và khó biện luận.[19][20]


17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là kháng thể kháng HIV trong các mẫu huyết
thanh bệnh nhân được thu thập từ trung tâm phòng chống AIDS-Bộ Quốc
Phòng.
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2016.
Địa điểm nghiên cứu tại Labo sinh học phân tử Viện Hàn lâm và Công
nghệ Việt Nam và Labo Sinh học phân tử Trường Đại học Y Dược Hải
Phòng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

-

Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm kết hợp mô tả cắt ngang và hồi cứu.
2.2.2. Sinh phẩm, hóa chất và vật liệu, trang thiết bị
2.2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất
Bộ sinh phẩm PolyLink Protein Coupling Kit chứa các hạt beads latex

của Bangs Labroratories, Inc,
Polyacrylamide, EDTA, SDS 10%, glycerol, TEMED, APS, Tris–HCl,
ethidium bromide... đạt độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử.
2.2.2.2.
Nguyên vật liệu
kháng nguyên tái tổ hợp p24, gp 41 và gp 120 của phân type virus
CRF01-AE do phòng thí nghiệm Vi sinh – Viện Công nghệ Sinh học – Viện
Hàn lâm và Khoa học Việt Nam cung cấp.

-

2.2.2.3. Trang thiết bị
Máy ly tâm thường
Máy vortex
Máy soi chụp ảnh gel (Bio- Rad)
Bộ nguồn điện di (Bio-Rad)
Pipetman (Gilson)
Máy lắc trộn mẫu

-

Tủ âm sâu -20, -80
Máy đo quang phổ kế
Cân phân tích 10-4g
Tủ cấy vô trùng
Tủ hút khí độc
Máy nanodrops


18

-

Máy ly tâm lạnh (Sorvall Biofuge Presco)
2.3. Sơ đồ nghiên cứu

Kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp
Thực hiện quy trình gắn từng loại kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex
Phối trộn 3 loại hạt latex gắn kháng nguyên theo tỷ lệ 1:1:1
Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ngưng kết
Kiểm tra phản ứng ngưng kết với kháng thể bệnh nhân nhiễm HIV
Đánh giá độ tương đồng của chế phẩm với các kit đang lưu hành

-

2.4. Tiến trình triển khai nghiên cứu
2.4.1. Điện di kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp
2.4.1.1
Biến tính protein tái tổ hợp
Trộn từng loại protein tái tổ hợp p24, gp120 và gp41 với C1- buffer

-

theo tỷ lệ 40µl protein với 10µl C1- buffer (tỷ lệ 4:1)
Đun sôi biến tính protein ở 100ºC trong 10 phút
2.4.1.2
Chuẩn bị gel polyacrylamide %
Điện di gel polyacrylamide được tiến hành theo phương pháp
của
Laemmli U.K. (1970), thường được sử dụng để tách riêng các băng
protein có trọng lượng phân tử khác nhau. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật
này để kiểm tra các protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện.
Quy trình:
Đổ gel theo công thức :
(1) Công thức đổ gel cô

H2O
- Tris-HCl 0,5M pH=8,8
-

2,46 ml
1,25 ml


19

-

Glycerol 50%
SDS 10%
APS 10%
Bis-acrylamide
TEMED

2 ml
50 µl
50 µl
4,2 ml
8 µl

(2) Công thức đổ gel tách:
- H2O
- Tris-HCl 1M pH=6,8
- SDS 10%
- APS 10%
- Bis-acrylamide
- TEMED

-

1,7 ml
312,5 ml
12,5 µl
25 µl
425 µl
2 µl

2.4.1.3 Điện di protein
Gắn bản gel vào buồng điện di
Đổ dung dịch SDS-page 1X với nồng độ 10% đầy bể điện di
Tra 15 µl và 10 µl marker lần lượt từng loại protein tái tổ hợp vào mỗi giếng
điện di
Điện di 40mA trong 45 phút
- Sau khi điện di, gel được nhuộm với dung dịch Coomasie brilliant blue
(0,1% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v)
+ 40% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v)) trong 2 giờ trên máy lắc,
sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dịch tẩy, lắc trong 30 phút thì đổ dịch
tẩy đi cho nước vào.
- Có thể quan sát trực tiếp hoặc soi kiểm tra mẫu trên nguồn sáng trắng và ghi

-

lại kết quả.
2.4.2. Quy trình gắn kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex
Trước khi thực hiện quy trình, làm ấm hạt latex, Polylink Coupling Buffer và
Polylink Wash/Storeage Buffer ở nhiệt độ phòng.
Hút 130ml hạt latex (tương đương 12,5mg) vào 3 ống eppendorf 1.5ml,

-

ghi nhãn gp120, gp41 và p24
Ly tâm các ống ở tốc độ 3000vòng/phút trong vòng 5 phút, loại bỏ dịch nổi
Tái huyền phù các hạt trong 400µl Coupling Buffer
Trộn đều rồi ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 5 phút


20

-

Chuẩn bị 200mg/ml dung dịch EDAC (carbodiimide) bao gồm 10mg

-

PolyLink EDAC và 50μl Polylink Coupling Buffer trong thời gian đợi ly tâm
Hỗn hợp sau ly tâm được loại bỏ dịch nổi
Tái huyền phù các hạt trong 170µl Coupling Buffer
Thêm 20 μl dung dịch EDAC rồi đảo đều
Bổ sung từng loại protein gp120, gp41 và p24 vào các ống ghi nhãn tương
ứng với nồng độ 500µg rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Chú ý đảo đều

-

trong lúc ủ.
Ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 10 phút. Hút bỏ dịch nổi.
Tái huyền phù các hạt trong 400µl BSA 5%, ủ trong 5 giờ ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 10 phút, loại dịch
Hòa tủa trong 400µl Wash Buffer, ly tâm 3000vòng/phút trong 10 phút, loại

-

bỏ dịch nổi.
Tiếp tục hòa tủa trong 400µl Wash Buffer, ly tâm 3000vòng/phút trong 10

-

phút, loại bỏ dịch nổi.
Lưu trữ dung dịch hạt latex trong đệm Wash buffer/Storage buffer trong
-200C
2.4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện kháng thể kháng HIV của
chế phẩm
-

Chuẩn bị 3 lam kính, ghi nhãn (-),

-

Nhỏ 1 giọt huyết thanh bệnh nhân bằng pipetman (tương đương 10 µl)

lên mỗi lam kính
-

Nhỏ 1 giọt (tương đương 10 µl) dung dịch hạt latex không gắn kháng

nguyên vào lam thứ nhất
-

Nhỏ 1 giọt dung dịch latex gắn kháng nguyên HIV tái tổ hợp vào lam

thứ 2
-

Nhỏ 1 giọt hạt latex gắn kháng nguyên thioredoxin tái tổ hợp vào lam

thứ ba
-

Dùng pipet trộn đều các dung dịch trên lam kính

-

Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 10-15 phút


21

-

Đọc kết quả bằng mắt thường và soi dưới kính hiển vi quang học

-

Ghi lại kết quả
2.4.4. Pha loãng dung dịch hạt latex gắn kháng nguyên tái tổ hợp

của HIV
-

Tiến hành pha loãng chế phẩm gắn kháng nguyên HIV tái tổ hợp theo

cấp số 2 để thu được các dung dịch có độ pha loãng từ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 đến
1/32 bằng cách:
+
Hút 120μl dung dịch hạt latex trộn đều trong 120 μl dung dịch
PBS 5% để thu được dung dịch pha loãng 1/2
+
Hút 120μl dung dịch hạt latex trộn đều với 120 dung dịch PBS
5% để thu được dung dịch pha loãng 1/4
+

Với phương pháp tương tự để thu được các dung dịch pha loãng

1/8-1/32.
2.4.5. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của chế phẩm
Độ nhạy là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xét
nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh. Như vậy độ nhạy
cho cả kết quả dương tính giả.
Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết
quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp bị bệnh, độ đặc hiệu
càng cao kết quả càng chính xác.


22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1

Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của protein tái tổ hợp gp120,

gp41 và p24
Protein gp120, gp41 và p24 tái tổ hợp do nhóm nghiên cứu của TS. Bạch
Thị Như Quỳnh cung cấp được kiểm tra độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di và
định lượng bằng phương pháp Bradford.
3.1.1

Kiểm tra nồng độ protein tái tổ hợp
Nồng độ của các protein tái tổ hợp Gp120, Gp41 và p24 được xác định
bằng phương pháp đo mật độ quang học dung dịch bằng máy Nanodrops
(Thermo) ở bước sóng 280nm. Kết quả thu được trong bảng sau:
Bảng 3.1 Nồng độ Protein tái tổ hợp được đo bằng máy Nanodrops
Protein tái tổ hợp

Nồng độ( mg/ml)
()

Gp120

0,614

Gp41

0,630

P24

0,661

3.1.2 Kiểm tra độ tinh sạch của Protein tái tổ hợp
Để có thể ứng dụng các protein tái tổ hợp cho nghiên cứu vào ứng dụng
tạo Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex, trước tiên phải kiểm
tra độ tinh sạch của protein tái tổ hợp.
Việc kiểm tra độ tinh sạch được tiến hành bằng phương pháp điện di
protein trên gel polyaryamide.
Kết quả điện di của protein tái tổ hợp Gp120


23

Hình 3.1: Kiểm tra độ tinh sạch của GP120 tái tổ hợp sau tinh chế bằng điện
di trên gel polyacryamide . M: Thang protein chuẩn (Fermentas); 1, 2, 3: các
phân đoạn của protein tái tổ hợp đã được tinh sạch.
Kết quả cho thấy băng đậm xuất hiện ở vị trí khoảng 120kDa đúng với
dự đoán theo lý thuyết. Điều đó có nghĩa là Gp120 tái tổ hợp sau khi được
tinh sạch có độ tinh sạch cao, không có các băng tạp nhiễm.


24

Kết quả điện di của protein tái tổ hợp Gp41

kDa
66,2
45,0
35,0
25,0
18,0

Trx-gp41

Hình 3.2: Kiểm tra độ tinh sạch của GP120 tái tổ hợp sau tinh chế bằng điện
di trên gel polyacryamide . M: Thang protein chuẩn (Fermentas); 1,2,3: Các
phân đoạn của protein tái tổ hợp đã tinh sạch.
Cũng như kết quả điện di của Gp 120, kháng nguyên tái tổ hợp Gp41 có
băng điện di xuất hiện ở vị trí khoảng 40kDa, chính là kháng nguyên tái tổ
hợp Gp41. Như vậy độ tinh sạch của Gp41 là rất cao, không có tạp nhiễm.
Kết quả điện di của protein tái tổ hợp p24


25

kDa
66,2
45,0
35,0
25,0
18,0

Trx-p24

Hình 3.3: Kiểm tra độ tinh sạch của GP120 tái tổ hợp sau tinh chế bằng
điện di trên gel polyacryamide . M: Thang protein chuẩn (Fermentas); 1,2,3:
Các phân đoạn của protein tái tổ hợp đã tinh sạch.
Phân đoạn p24 được kiểm tra độ tinh sạch cũng tương ứng với thang
chuẩn trên bản gel cho thấy độ tinh sạch của kháng nguyên tái tổ hợp p24 có
độ tinh sạch cao.
3.2 Kiểm tra khả năng gắn kháng nguyên lên bề mặt hạt latex

Để đánh giá chất lượng kháng nguyên đã được gắn lên bề mặt hạt latex
chúng tôi tiến hành thử phản ứng ngưng kết trên kháng thể kháng Trx
Những hạt latex đã được gắn kháng nguyên được trộn với dung dịch
chứa kháng thể kháng HIV theo tỷ lệ 1:1 và được so sánh với chứng âm là các
hạt latex trộn với dung dịch PSB


x

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×