Tải bản đầy đủ

nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của cây lá ngón gelsemium elegans benth., logania

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Mục

lục
Trang
Đặt vấn đề 1
Phần I.Tổng quan 2
1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.2. Thành phần hoá học 2
1.3. Độc tính và tác dụng sinh học 4
Phần II. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 5
2.1. Nguyên liệu 5
2.2. Phơng pháp nghiên cứu 5
Phần III. Thực nghiệm và kết quả 7
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 7
3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón
3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của rễ, thân, lá
3.1.3. Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây Lá ngón
3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học
3.2.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

3.2.3. Định lợng Alcaloid toàn phần
3.2.4. Chiết xuất và phân lập Alcaloid
Phần IV. Kết luận và đề nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
1
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Đặt vấn đề
Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) là một loài cây độc mọc hoang ở
nhiều vùng núi Việt Nam. Lá, thân, rễ đều có chất độc có thể gây chết ngời.
Gần đây có nhiều trờng hợp tử vong do sử dụng nhầm các bộ phận của cây lá
ngón [10].
Để góp phần kiểm định dợc liệu và tiến tới giám định các vụ ngộ độc do
cây lá ngón, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật và
thành phần hoá học của cây lá ngón Gelsemium elegans Benth.,
Loganiaceae với các nội dung sau:
Về mặt thực vật:
- Mô tả đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu nghiên cứu.
- Xác định đặ điểm vi phẫu: rễ, thân, lá.
- Xác định đặc điểm bột rễ, bột thân, bột lá.
Về thành phần hoá học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong rễ, thân, lá.
- Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng.
- Định lợng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá.
- Chiết xuất và phân lập alcaloid chính.
- Nhận dạng alcaloid phân lập đợc.
PHầN I Tổng quan
1.1. Đặc điểm thực vật
Cây lá ngón có tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), họ Mã
tiền (Loganiaceae). ở một số vùng của Việt Nam nó còn có tên là Co ngón
(Lạng Sơn), thuốc dút ruột, Hồ mạn đằng, Câu vẫn, Đoạn trờng thảo.
2
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Cây lá ngón là một loại cây mọc leo, thân và cành không có lông, gỗ có
màu vàng. Thân cây có khía dọc, lá mọc đối hình trứng thân dài hay hơi hình
mác, đầu nhọn, phía cuối nhọn hay hơi tù, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 7 -
12cm, rộng 2,5 - 5,5 cm. Hoa mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá. Cánh
hoa mầu vàng, đài 5, lá đài rời. Tràng gồm 5 cánh hoa nhẵn, dính thành ống
hình phễu, nhị 5 đính ở phía dới ống tràng, bầu chẵn, vòi dạng sợi. Đầu nhụy
4 thùy hình sợi. Quả nang có vỏ cứng dai, mầu nâu hình thon dài 1cm rộng
0,5cm hạt nhỏ quanh mép có rìa mỏng màu nâu nhạt, hình thận.[1],[3],[5],
[9],[12]
Cây lá ngón phân bố khá phổ biến ở nhiều miền rừng núi Việt Nam. Từ
Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Lào Cai, Lạng Sơn, Bắc Giang, Quảng
Ninh, Hoà Bình, đến các tỉnh Tây Nguyên. Ngoài ra, cây lá ngón còn mọc ở
một số nớc nhiệt đới. ở Trung Quốc, lá ngón có mặt ở các tỉnh Phúc Kiến,
Quảng Đông, Quảng Tây. ở Bắc Châu Mỹ có loài Gelsemium Sempervirens.
Art.[4],[9],[12]
1.2. Thành phần hoá học
Theo các tài liệu của Đỗ Tất Lợi [12],Võ Văn Chi [4], Vũ Văn Chuyên
[5], Trần Công Khánh [9], thì cây lá ngón có chứa nhiều alcaloid khác nhau,
cụ thể là: Từ loài cây ngón mọc ở Bắc châu Mỹ, G. Sempervirens đã chiết ra
đợc nhiều loại alcaloid nh: gelsemin (C
20
H
22
O
2
N
2
), gelmixin
(C
19
H
24
O
3
N
7
), chất sempervirin và sempervin tất cả đều có độc tính rất
mạnh.
ở Trung Quốc năm 1931 ngời ta đã nghiên cứu rễ, thân rễ, cành của cây lá
ngón Trung Quốc (Gelsemium elegans) đã chiết xuất đợc 4 loại alcaloid có
tính chất và đặt tên là:
+ Kumin (C
20
H
22
ON
2
): dễ tan trong cồn, khó tan trong ether, không tan
trong nớc. Tan trong nớc acid. Đây là thành phần chủ yếu của cây chất
này không độc lắm.
+ Kuminin: vô định hình không màu, dễ tan trong ether và nhiều dung
môi hữu cơ, khó tan trong nớc, tan trong nớc acid.
+ Kuminixin: là chất vô định hình.
+ Kuminidin: có tinh thể hình trụ, không màu, tan nhiều trong các dung
môi hữu cơ và nớc.
Tỷ lệ cả 4 loại alcaloid trên là 0,3%.
3
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Vào năm 1936 F.Guichard nghiên cứu từ cây lá ngón mọc ở Việt Nam đã
chiết từ lá, vỏ thân và rễ đợc những chất giống nh lá ngón Trung Quốc. Tác
giả đã thấy chất kumin có cả trong quả và hạt, ngoài ra còn tìm thấy một chất
có huỳnh quang dới đèn tử ngoại, không tan trong acid và ghi là chất thuộc
nhóm esculetin. [12]
Năm 1953 M.M Janot xác định lá ngón Việt Nam có chứa gelsemin ở
lá, kumin ở thân, rễ và sempervinrin ở các bộ phận của cây. Năm 1971 Phan
Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi và Lơng Văn Thịnh chiết đợc kumin từ rễ cây lá
ngón mọc ở Hoà Bình.[1]
Hoàng Nh Tố đã phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thấy có 15 vết
Alcaloid ở cây lá ngón trong đó đã tách đợc gelsemin và kumin.[1]
N
O
O
N
CH
3
H
N
N
H
+
Gelsemin Sempervirin
1.3. Độc tính và tác dụng sinh học
Cây lá ngón là một loại cây rất độc, không đợc nhân dân ta dùng làm
thuốc mà chỉ dùng với mục đích tự tử hay đầu độc. Nhng ở Trung Quốc ngời
dân lại hay dùng làm thuốc chữa hủi hay chữa bệnh nấm tóc [12].
Theo Võ Văn Chi, [4], thì cây lá ngón có thể dùng làm thuốc, bộ phận
dùng là rễ, thân, lá. Nó có vị cay, đắng, tính nóng, rất độc có tác dụng thanh
nhiệt, tiêu thũng, hạt có độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa. Có công dụng
là: điều trị eczema, nấm ở chân, ở thân, đòn ngã tổn thơng, đụng giập, trĩ,
tràng nhạc, đinh nhọt và viêm mủ da, điều trị phong hủi. Giã cây tơi đắp
ngoài hoặc nấu nớc rửa ngoài mà không đợc dùng uống trong.[4]
Trong cây lá ngón mọc ở Bắc Mỹ: thành phần chủ yếu là chất gelmixin,
có độc tính rất mạnh. Với liều thấp trên động vật có vú, trớc khi thấy hiện t-
ợng ức chế hô hấp thờng thấy một thời kỳ hng phấn ngắn.[12]
Trong cây lá ngón của ta và Trung Quốc có thành phần khác nhng so
với tác dụng của những alcaloid của cây lá ngón Bắc Mỹ thì nhiều phần giống
4
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
nhau. Chất kumin và kuminin ít độc hơn, gần giống tác dụng của gelsemin.
Chất kuminixin rất độc, nhng chất gelsemixin lại độc hơn nữa. Nhỏ dung dịch
gelsemin và gelsemixin lên mắt thì thấy hiện tợng giãn đồng tử còn kumin và
kuminin không làm giãn đồng tử.[12]
Ngoài thành phần hoá học, Hoàng Nh Tố còn kiểm tra truyền thuyết
dân gian nói: chỉ ăn 3 lá là đủ chết ngời" đồng thời tìm cơ chế tác dụng của
lá ngón để tìm cách chống độc có hiệu quả đã đi tới một số kết luận sau:
- Liều độc: LD50 đối với chuột nhắt trắng của rễ là 102mg/kg thể
trọng (chiết bằng cồn 90
0
), của lá là 600mg/kg (dợc liệu tơi chiết bằng nớc),
200mg/kg (lá khô chiết bằng nớc), 150mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 70
0
),
89mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 90
0
),

của alcaloid toàn phần chiết từ lá khô là
200mg/kg, trong khi đó của gelsemin là 140mg/kg và kumin thì không độc.
Nh vậy, lá ngón có độc nhng không đến mức 3 lá đủ chết ngời nh dân gian th-
ờng nói.
- Tác dụng độc của lá ngón không đặc hiệu trên hệ thống thần kinh,
gây nên co giật và chết do ngừng hô hấp trong một trạng thái thiếu oxy rõ rệt.
- Nghiêu cứu về mặt chống độc, cho phép kết luận cơ chế tác dụng
của các hoạt chất cây lá ngón chủ yếu đánh vào các men hô hấp, gây sự rối
loạn trong tế bào dẫn tới sự thiếu oxy nghiêm trọng gây nên tình trạng co giật
cơ và liệt cơ. Phơng hớng dùng các thuốc ngăn cản sự ức chế men và bảo trợ
men đã dẫn tác giả tìm ra đợc tính chống độc của ATP. Khi dùng ATP để ngăn
ngừa cũng nh để điều trị ngộ độc bằng lá ngón đã giảm tỷ lệ chết của chuột
nhắt trắng từ 58% xuống còn 25%, đã cứu đợc tất cả các thỏ làm thí nghiệm
khi đã bị ngộ độc bằng liều chết của lá ngón.[12]
Dù đã nghiên cứu nh vậy nhng việc phát hiện các chất độc trong cơ thể
khi bị ngộ độc lá ngón còn rất khó khăn, vì phản ứng đợc tiến hành trên những
chất lấy đợc ở cơ thể ngời bị ngộ độc là một việc không phải dễ dàng.[12]
Chất độc chính trong cây lá ngón là các alcaloid nh gelsemin, kumidin
và kumin có trong toàn cây, độc nhất là ở rễ và lá non. Ngộ độc với triệu
chứng nh khát nớc, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt răng cắn
chặt, sùi bọt mép, hạ thân nhiệt, hạ huyết áp, hô hấp chậm rồi chết. Cách giải
5
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
độc: Phải nhanh chóng loại chất độc ra khỏi cơ thể bằng cách gây nôn và rửa
ruột (nôn ra sớm thì sống, chậm thì chết).[9]
Theo kinh nghiệm truyền thống thì cho uống thật nhiều nớc sắc cam
thảo. Tiêm truyền huyết thanh mặn hay ngọt, giữ cơ thể ấm. Nếu hạ huyết áp
thì dùng ephedrine, khó thở thì dùng niketamid cho thở oxy hoặc hô hấp nhân
tạo, đau bụng thì dùng thuốc giảm đau.[9]
Phần II
Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu là rễ, thân và lá của cây lá ngón có hoa thu hái tại xã An
Châu, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang vào tháng 02/2003.
- Nguyên liệu sau khi thu hái đợc thái nhỏ sấy khô ở nhiệt độ 40-50
0
C
sau đó đợc bảo quản trong túi bóng lớn, kín.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
6
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
2.2.1. Nghiên cứu về mặt thực vật học
- Quan sát hình thái bên ngoài bằng cảm quan theo tài liệu [1],[2],
[12].
- Cắt và quan sát vi phẫu: Rễ, thân, lá trên kính hiển vi quang học tại
bộ môn dợc liệu theo tài liệu thực tập [2],[8].
- Soi bột và mô tả các đặc điểm của bột rễ, thân, lá theo tài liệu [2],
[8],[13].
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học trong cây lá ngón
- Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá cây. [1],[2]
- Định lợng alcaloid trong cây theo phơng pháp acid base.[2]
- Xác định độ ẩm trên máy Sartorius ( Germany) tại bộ môn dợc liệu.
- Đo phổ UV trên máy tại Viện kiểm nghiệm Bộ y tế.
- Đo phổ IR trên máy tại Phòng Hoá, Viện khoa học hình sự.
- Đo phổ khối trên máy 5989B MS tại Phòng cấu trúc Viện hoá học.
- Đo phổ cộng hởng từ hạt nhân trên máy tại
- Đo độ chảy trên máy GALLENKAMP tại bộ môn hoá hữu cơ.
PHầN iii
Thực nghiệm và kết quả
3.1. Đặc điểm thực vật
3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón
Cây bụi leo mọc ở ven rừng, thân nhỏ hoặc vừa không có lông, lá mọc đối,
hình trứng thuôn dài hay hơi hình mác, đầu nhọn phía cuống lá nhọn, mép
nguyên, bóng, nhẵn, dài 10cm, rộng 5cm, mặt trên của lá mầu sẫm, mặt dới
mầu nhạt hơn, gân lá hình lông chim, có từ 4-7 cặp gân phụ, cuống lá dài
1cm. Hoa nhỏ mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá, bao hoa mầu phớt tím,
cánh hoa mầu vàng.
Mẫu chúng tôi nghiên cứu đã đợc GS. Vũ Văn Chuyên định tên khoa
học là:
Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae.
7
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá, thân và rễ
Cấu tạo giải phẫu lá:

Hình 2

Mặt cắt ngang có dạng đối xứng hai bên, lá đợc chia làm hai phần
chính, phiến lá và gân lá.
- Gân lá: Mặt dới lồi, mặt trên phẳng hơi lõm.
Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình trứng kích thớc tơng đối lớn xếp đứng,
biểu bì dới tế bào có dạng hình tròn và nhỏ hơn.
Mô dày gồm những lớp tế bào tròn, thành dày xếp sát biểu bì trên và biểu bì
dới.
Mô mềm cấu tạo từ những tế bào tròn hình mỏng xếp lộn xộn.
Cung libe gỗ ở giữa gân lá. Có libe bao quanh cung gỗ.
8
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
- Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dới cấu tạo bởi những tế bào tròn xếp
đều đặn thành hàng, tế bào ở phía trên to hơn ở phần biểu bì dới. Hầu nh
không quan sát thấy mô dậu. Ngay dới lớp biểu bì là mô khuyết, các tế bào
xếp lộn xộn có nhiều khuyết nhỏ.
Cấu tạo giải phẫu thân:
Hình 3
Mặt cắt ngang thân hình tròn, từ ngoài vào trong có:
- Lớp bần: Gồm một đến hai hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành dãy.
- Mô mềm vỏ: Gồm nhiều tế bào thành mỏng, phía ngoài dẹt, phía trong
hình trứng. Trong mô mềm vỏ có các tế bào hoá gỗ và các sợi gỗ xếp riêng lẻ,
hoặc thành từng đám.
- Libe: xếp thành từng bó, phía ngoài libe có các sợi thành dầy, xếp thành
từng đám.
- Gỗ: Mô gỗ khá dầy có các mạch gỗ lớn xếp trong mô gỗ, bị các tia ruột
thành dầy hoá gỗ chia ra tầng bó. Mô gỗ liên tục càng vào phía trong các
mạch gỗ nhỏ dần, phần ngoài tia ruột có nhiều tinh thể canxi oxalat hình khối.
- Libe quanh tuỷ tạo thành một cung liên tục nằm ở giữa gỗ và mô mềm
ruột.
- Mô nềm ruột: Gồm các tế bào thành mỏng xếp lộn xộn tạo nhiều chỗ
khuyết.
* Cấu tạo giải phẫu rễ:
9
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Hình 4
Mặt cắt rễ tròn từ ngoài vào trong có:
- Lớp bần: Gồm ba đến bốn hàng tế bào xếp thành dẫy đồng tâm và
xuyên tâm, có nhiều chỗ đã bị bong ra.
- Mô mềm vỏ: Phần này của rễ mỏng hơn so với ở thân, đợc cấu tạo bởi
những tế bào có thành mỏng. Không có các bó sợi và tế bào hoá gỗ trong mô
mềm vỏ.
- Libe: Xếp thành từng bó, bên ngoài libe không có các sợi thành dầy
hoá gỗ nh ở phần thân cây.
- Gỗ: Có các mạch gỗ lớn, xếp trong mô gỗ bị các tia ruột thành dầy
hoá gỗ chia ra tầng bó vào gần đến tâm. Mô gỗ phía trong liên tục và không
có mô mềm ruột.
3.1.3. Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón
Hình 5
Bột lá: mầu xanh lục, mùi hắc. Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc
điểm sau:
- Các mảnh mô mềm
- Các mảnh mạch
- Các mạch xoắn
- Các mảnh biểu bì có lỗ khí
- Tinh thể Canxi Oxalat hình khối.
10
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Bột thân cây: mầu vàng nhạt. Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc
điểm sau:
- Có rất nhiều các mảng mạch điểm
- Các tế bào màng hoá gỗ.
- Các sợi gỗ
- Các mảnh mô mềm
Bột rễ cây: mầu vàng đậm có mùi hắc. Soi dới kính hiển vi có các điểm
sau:
- Tế bào màng hoá gỗ.
- Có nhiều các mảng mạch điểm
- Các bó sợi và sợi gỗ
- Có rất nhiều các hạt tinh bột đứng riêng lẻ hay thành từng đám hai đến
ba hạt.
- Có các mảnh mô mềm.
Nhận xét:
Các bộ phận của cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trng:
- Giải phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng,
xếp đứng, kích thớc lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó
gỗ. Bột lá có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào tạo
thành khối giống tinh thể canxi oxalat.
- Giải phẫu thân và rễ: Mô mềm vỏ của thân có nhiều sợi gỗ thành dầy,
khoang hẹp, còn ở rễ thì hầu nh không có sợi gỗ ở mô mềm vỏ. Các tia ruột
màng hoá gỗ chia gỗ ra từng bó ở phía ngoài, mô gỗ ở phía trong liên tục, tinh
thể canxi oxalat hình khối phân bố nhiều ở phần tia ruột cạnh libe của thân.
Bột thân và rễ có nhiều tế bào màng hoá gỗ kích thớc lớn và các sợi gỗ.
3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học
3.2.1. Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá của cây lá ngón
Định tính alcaloid
Cân khoảng 10 gam bột dợc liệu đã đợc sấy khô cho vào bình nón
dung tích 250ml. Thấm ẩm đều bằng dung dịch NH
4
OH 10%. Để yên 60 phút.
Thêm vào 50ml CHCl
3
,

lắc 5 10 phút rồi để yên qua đêm, lọc. Lấy 30ml
dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 10ml HCl 5%, lắc 2 3 phút, gạn lấy phần
acid để làm phản ứng. Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết.
11
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
ống 1 : Thêm 2 3 giọt TT Mayer Có tủa trắng.
ống 2 : Thêm 2 3 giọt TT Dragendorff Có tủa đỏ gạch.
ống 3: Thêm 2 3 giọt TT Bouchardat Có tủa đỏ nâu.
Nhận xét: Qua kết quả định tính trên ta có thể sơ bộ kết luận trong rễ, thân,
lá của cây lá ngón đều có alcaloid.
Định tính flavonoid:
Lấy khoảng 10 gam dợc liệu cho vào bình nón dung tích 100ml thêm
50ml ethanol 90
0
đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc nóng. Dịch lọc dùng vào
các phản ứng sau:
+ Phản ứng cyanidin:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm thêm một ít bột Mg kim loại sau đó
cho từng giọt HCl đặc (3 5 giọt), để yên một vài phút không thấy dung dịch
chuyển màu. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng với kiềm:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac
đặc đã mở nút, màu vàng của dịch chiết không tăng lên. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng với dung dịch FeCl
3
5%:
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết thêm 3 giọt dung dịch FeCl
3
5%
không có hiện tợng tạo tủa. Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Từ kết quả trên sơ bộ kết luận trong rễ, thân, lá của cây lá
ngón không có Flavonoid.
Định tính coumarin:
Cho 5 gam bột dợc liệu vào cốc, thêm 50ml cồn 90
0
, đun cách thuỷ cho
sôi vài phút, lọc qua giấy lọc. Dịch chiết thu đợc tiến hành làm các phản ứng
sau:
+ Phản ứng mở- đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết.
- ống 1: Thêm 1ml dung dịch NaOH10%.
- ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi rồi để nguội.
Quan sát: - ống 1: Có mầu vàng
- ống 2: Vẫn trong
12
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nớc cất. Lắc đều
Quan sát: - ống 1: đục hơn ống số 2
- ống 2: vẫn trong suốt
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì thấy ống 1 vẫn đục nh ban
đầu. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, kiềm hoá bằng NaOH 10%,
đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt TT Diazo mới pha. Dung
dịch trong ống nghiệm không chuyển sang màu hồng hay tím đỏ. Phản ứng
âm tính.
+ Vi thăng hoa:
Cho một ít bột dợc liệu vào nắp chai bằng kim loại, đậy lên trên một
phiến kính nhỏ có bông tẩm nớc lạnh ở trên. Đốt nóng bằng đèn cồn trong 15
20 phút. Lấy phiến kính ra để nguội, nhỏ 1 2 giọt dung dịch KI. Soi trên
kính hiển vi không thấy tinh thể nâu sẫm hay tím. Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Từ kết quả trên sơ bộ kết luận. Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón
không có coumarin.
Định tính tanin:
Lấy 3 gam bột dợc liệu, cho vào cốc. Thêm 20ml nớc cất, đun sôi vài
phút rồi lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
+ Phản ứng với FeCl
3
5%:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 1 2 giọt FeCl
3
5%, thấy
xuất hiện tủa xanh đen. Phản ứng dơng tính.
+ Phản ứng với dung dịch gelatin 1%:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vào vài giọt dung dịch
gelatin 1% thấy xuất hiện tủa bông. Phản ứng dơng tính.
Nhận xét: Sơ bộ nhận thấy trong rễ, thân, lá của cây có chứa tanin.
Định tính acid hữu cơ:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết nớc vài tinh thể Na
2
CO
3
, thấy có
bọt khí nổi lên rất rõ.
Nh vậy trong rễ, thân, lá của cây có acid hữu cơ
Định tính antranoid:
+ Phản ứng Borntraeger:
13
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Cho 3 gam bột dợc liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 15ml
H
2
SO
4
10%. Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với
ether etylic trong 1 2 phút, để yên cho tách thành 2 lớp. Loại phần nớc, cho
vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10%. Lắc thấy lớp ether có mầu vàng
nhạt. Thêm vào đó dung dịch H
2
O
2
. Lắc đều, đun cách thuỷ vài phút dung
dịch trở nên không mầu. Phản ứng âm tính.
Vậy sơ bộ kết luận: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có
Antranoid.
Định tính saponin:
+ Quan sát hiện tợng tạo bọt:
Cho 5 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nớc, lắc mạnh trong 5
phút. Thấy có nhiều bọt xuất hiện và bền vững sau 15 phút. Phản ứng dơng
tính.
+ Phản ứng phân biệt saponin sterolic và saponin triterpenic:
Cho vào óng nghiệm lớn 0,2 gam bột dợc liệu, thêm 5 ml cồn 90
0
đun
sôi, lọc. Bố trí thí nghiệm trong 2 ống nghiệm nh sau:
ống nghiệm 1 ống nghiệm 2 Sơ bộ kết luận
Dung dịch
NaOH 0,1N
(pH=13)
5 ml 0
Dung dịch HCl
0.1N ( pH=1)
0 5 ml
Dịch chiết dợc
liệu
5 giọt 5 giọt
Lắc mạnh trong 1
phút
Hiện tợng tạo
bọt
Cột bọt cao Cột bọt thấp Saponin sterolic

Nhận xét: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón có saponin.
Định tính đờng khử:
Lấy 2 gam bột dợc liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml cồn, đun
cách thuỷ 10 phút, lọc, cho 1md dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 3 giọt
TT Feling A và 3 giọt TT Feling B. Đun cách thuỷ 10 phút thấy có tủa đỏ
gạch. Phản ứng dơng tính.
14
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Kết luận : Có đờng khử tự do trong rễ, thân, lá.
Định tính chất béo:
Nhỏ dịch chiết cloroform lên giấy lọc, hơ khô. Không để lại vết mờ trên
giấy lọc. Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Không có chất béo trong rễ, thân, lá.
Định tính sterol:
Lấy khoảng 5 g bột dợc liệu, cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm
40ml cồn 25
0
. Ngâm 24 giờ, gạn dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% đến
d, lọc bỏ tủa, lắc dịch lọc với cloroform 2 lần (mỗi lần 10ml trong một bình
gạn). Gạn lớp cloroform làm phản ứng:
+ Phản ứng Salkopski:Trong ống nghiệm nhỏ cho khoảng 2ml cloroform.
Thêm từ từ 1ml H
2
SO
4
đặc (nghiêng ống nghiệm 45
0
) cho chảy từ từ dọc theo
thành ống nghiệm để có phân lớp.Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm trên bề mặt
phân cách giữa hai lớp chất lỏng. Phản ứng dơng tính.
+ Phản ứng Liebermann: Trong ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết
cloroform. Bốc hơi cách thuỷ đến khô. Hoà cắn bằng 1ml anhydrid acetic, lắc
đều, thêm từ từ 1ml H
2
SO
4
đặc cho chảy dọc theo thành ống nghiệm để có
phân lớp.Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm trên bề mặt phân cách giữa hai lớp
chất lỏng. Phản ứng dơng tính.
Nhận xét: Dợc liệu có sterol trong rễ, thân, lá .
Định tính gly cosid tim :
Cho 10 g dợc liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 80ml cồn 25
0
ngâm 24 giờ, gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% d, lọc
bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn và lắc kỹ 2 lần với clorofrom (mỗi lần
20ml), gạn dịch cloroform vào cốc thuỷ tinh khô bốc hơi cách thuỷ đến khô.
Cắn đợc hoà tan trong cồn 90
0
, dịch chiết cồn để làm các phản ứng định tính
glycosid tim.
+ Phản ứng Legal:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch Natri
Nitroprusiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% ,không thấy xuất hiện mầu
hồng. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng Baljet:
15
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Chuẩn bị thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1ml acid picric1% và
9ml dung dịch NaOH 10% lắc đều.
Làm phản ứng:
Cho 1ml dịch chiết trong cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ, nhỏ từng giọt
thuốc thử baljet vừa mới pha vào ống nghiệm. Không thấy xuất hiện màu.
Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng Liebermann:
Trong 1 ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết trong cồn 90
0
. Cô cạn cồn,
rồi hoà tan cắn bằng 2ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt ống nghiệm nghiêng
45
0
, thêm từ từ H
2
SO
4
theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm
chia thành 2 lớp, ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có xuất hiện vòng tím đỏ.
Phản ứng dơng tính.
+Phản ứng Keller- Kiliani:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, cho vào đó 1ml FeCl
3
5% trong acid
acetic, lắc đều, nghiêng ống nghiệm, cho đồng lợng acid sulfuric đặc theo
thành ống nghiệm. Không thấy xuất hiện vòng tím đỏ giữa 2 lớp phân cách.
Phản ứng âm tính.
Kết luận: Không có glycosrd tim trong rễ, thân, lá của cây lá ngón.
Định tính acid amin:
Trong một ống nghiệm nhỏ cho 2ml dịch chiết nớc, thêm vào 3 giọt thuốc
thử Ninhydrin 3% trong ethanol. Đun cách thuỷ 5-10 phút, không thấy xuất
hiện màu xanh tím. Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Không có acid amin trong rễ, thân, lá.
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây lá ngón.
TT
Nhóm
chất
Phản ứng định tính
Kết quả
Kết luận
Rễ Thân Lá
1 Flavonoid
Phản ứng Cyanidin - - -
Không có
Phản ứng với kiềm - - -
Thuốc thử AlCl
3
3%/cồn - - -
2 Glycosid
Phản ứng Lieberman - -
Không có
Phản ứng Baljet - - -
Phản ứng Legal - - -
Phản ứng Keller-Kiliani - - -
3 Đờng khử Thuốc thử Fehling A+B + + + Có
4 Alkaloid
Thuốc thử Dragendorff
++
+
++ +

Thuốc thử Mayer ++
+
++ +
16
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Thuốc thử Bouchardat
++
+
++ +
5 Coumarin
Thuốc thử Diazo - - -
Không có
Phản ứng mở đóng vòng
Lacton
- - -
Vi thăng hoa - - -
6 Tanin
Thuốc thử Gelatin 1% + + +

Thuốc thử FeCl
3
5% + + +
7 Saponin
Phản ứng tạo bọt ++ ++ +

saponin
sterolic
Phản ứng phân biệt
Saponin Sterolic và
Triterpenic
++ ++ +
8
Acid hữu

Thuốc thử Na
2
CO
3
+ + + Có
9 Antranoid Phản ứng Borntraeger - - - Không có
10 Sterol
Phản ứng Liebermann
Phản ứng Salkopski
+
+
+
+
+
+

11 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - - - Không có
12 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin 3% - - - Không có
Nhận xét:
Qua các phản ứng định tính sơ bộ thấy trong rễ, thân, lá đều có các chất
sau: alcaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, sterol, đờng khử.
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng alcaloid:
Làm định tính alcaloid trên 3 bộ phận: rễ, thân, lá của cây lá ngón bằng
sắc ký lớp mỏng.
3.2.2.1. Chuẩn bị bản mỏng
Dùng bản mỏng Silicagel 60 F
254
(Merck), hoạt hoá bản mỏng trong tủ
sấy ở 105
0
C trong 1 giờ.
3.2.2.2. Chuẩn bị dịch chấm sắc ký
Cân 10g bột dợc liệu làm ẩm bằng NH
4
OH 10% trong 1h cho vào bình
nón dung tích 250 ml, cho 50 ml CHCl
3
, ngâm qua đêm, lọc, lấy dịch lọc cô
còn khoảng 5 ml đem chấm sắc ký.
3.2.2.3. Tiến hành
Chấm lên các bản mỏng đã chuẩn bị sẵn cùng lợng dịch chiết rồi khai
triển bằng 2 hệ dung môi sau:
Hệ I - CHCl
3
: CH
3
OH: NH
4
OH đặc [50 : 9 : 1]
Hệ II- Toluen: aceton : C
2
H
5
OH : NH
4
OH đặc [ 45: 45:7:3]
Sau đó phun hiện mầu bằng thuốc thử Dragendorff. Trên bản sắc ký
xuất hiện các vết có mầu từ vàng đến vàng đậm. So sánh thấy hệ dung môi II
17
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
tách tốt vì số lợng các vết xuất hiện nhiều và khoảng cách các vết ở xa nhau
hơn.
Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi II đợc trình bày ở sắc ký đồ 1
và ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả SKLM
STT
Rễ Thân Lá
Màu R
f
Màu R
f
Màu R
f
V1 Vàng nhạt 0,045 Vàng nhạt 0,044
V2 Vàng đậm 0,270 Vàng đậm 0,270 Vàng 0,270
V3 Vàng 0,315 Vàng nhạt 0,315 Vàng 0,314
V4 Vàng nhạt 0,342
V5 Vàng 0,387 Vàng 0,384
V6 Vàng 0,423 Vàng 0,423
V7 Vàng đậm 0,459 Vàng nhạt 0,458 Vàng nhạt 0,457
V8 Vàng 0,514 Vàng 0,514 Vàng nhạt 0,513
Sắc ký đồ
Nhận xét
18
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
3.2.3. Định lợng alcaloid toàn phần:
3.2.3.1. Định lợng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá của cây lá ngón
bằng phơng pháp acid base.
Bột dợc liệu dùng để định lợng đem xác định độ ẩm trên máy xác định
độ ẩm tại bộ môn dợc liệu Trờng Đại học Dợc Hà Nội.
- Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 10g dợc liệu (đã xác định độ ẩm) thấm ẩm bằng
NH
4
OH đặc (để yên 12 giờ), cho bột dợc liệu vào túi lọc rồi đặt vào bình
soxhlet. Chiết với dung môi là CHCl
3
đến kiệt alcaloid (kiểm tra bằng TT
Dragendorff).
Cất thu hồi dung môi rồi hoà tan cắn trong HCl 5%, rửa dịch acid bằng
ether (rửa 3 lần, mỗi lần 10ml). Kiềm hoá bằng NH
4
OH đặc đến pH 10 11
rồi chiết bằng CHCl
3
(chiết 5 lần, mỗi lần 10ml) để lấy hết alcaloid. Tập trung
dịch chiết rồi rửa bằng nớc cất đến pH 7, để bốc hơi tự nhiên đến khô. Hoà tan
cắn bằng một lợng chính xác 10ml HCl 0,1 N thêm nớc cất đun sôi để nguội
và 3 giọt dung dịch đỏ metyl. Định lợng acid thừa bằng dung dịch NaOH
0,1N.
Gọi V là số ml dung dịch NaOH 0,1 N đã định lợng. (10 - v) sẽ là số ml
dung dịch acid đã tham gia bão hòa alcaloid, 1ml dung dịch HCl 0,1N tơng
ứng với 0,0306(g) alcaloid toàn phần, tính theo Kumin. Hàm lợng alcaloid
toàn phần trong dợc liệu tính theo Kumin.
(10 - V) x

0,0306 x 100
X% =
P
X: Hàm lợng alcaloid toàn phần trong dợc liệu khô tuyệt đối.
V: Thể tích NaOH 0,1 N dùng để trung hoà HCl d
P: Khối lợng bột dợc liệu đã trừ độ ẩm
Tiến hành làm mỗi bộ phận 5 mẫu, kết quả đợc tính trung bình từ 5
mẫu và đợc ghi ở bảng 3.3.
19
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Bảng 3.3: Kết quả định lợng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá
TT
Hàm lợng alcaloid toàn phần (%)
Rễ Thân Lá
1 0.67 0.34 0.16
2 0.66 0.34 0.19
3 0.68 0.32 0.18
4 0.65 0.32 0.16
5 0.66 0.33 0.15
Trung bình 0.664 0.332 0.169
3.2.4. Chiết xuất và phân lập alcaloid
3.2.4.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần
Chiết xuất alcaloid bằng dung dịch acid HCl 1% qui trình chiết xuất đ-
ợc tóm tắt ở sơ đồ 1.
20
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất alcaloid toàn phần:
21
Bột d ợc liệu
Dịch chiết acid
Dịch chiết acid đã loại tạp
Dịch chiết đã kiềm hoá
Dịch chiết cloroform
Cắn alcaloid toàn phần
dung dịch acid HCl 1%
ực tiếp trên bếp . Cứ 1
tr
gạn dịch
chiết 1 lần (gạn 5 lần)
Lắc với ether
Tạp
NH
4
OH 10%
Cloroform
CHCl
3
thu hồi
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
3.2.4.2. Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột:
Căn cứ vào kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy,
trong các vết alcaloid của rễ cây lá ngón có V
2
to nhất (hàm lợng cao nhất ).
Vậy có thể sử dụng phơng pháp sắc ký cột để phân lập alcaloid V
2
.
* Dùng silicagel 60 cỡ hạt 0,036 đến 0,2mm của hãng Merck thực hiện
phơng pháp nhồi cột ớt.
Hoạt hoá silicagel ở 105
0
C trong 1 giờ, sau đó lấy silicagel hoà trong một l-
ợng cloroform rồi đem nhồi cột. Để yên cột trong 8 giờ. Cắn alcaloid toàn
phần hoà tan bằng một ít cloroform rồi cho thêm 2g silicagel vào trộn đều. Sấy
nhẹ cho cloroform bay hơi rồi đổ lên cột dàn thành lớp.
* Rửa giải cột:
Dùng hệ dung môi rửa giải là CHCl
3
: CH
3
OH (9:1) hứng mỗi ống khoảng
2 ml. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Chọn riêng những ống chỉ cho một vết
trên bản mỏng gộp lại rồi cho bốc hơi cloroform, để kết tinh tự nhiên trong
ống nghiệm. Cạo lấy phần tinh thể đem kết tinh lại nhiều lần thu đợc alcaloid
V
2
.
Kiểm tra độ tinh khiết của V
2
bằng sắc ký lớp mỏng:
Tinh thể alcaloid V
2
đợc hoà tan trong một lợng vừa đủ methanol, rồi chấm lên
ba bản mỏng và đợc khai triển bằng ba hệ dung môi khác nhau:
Hệ I- Cloroform : Methanol : Amoniac [50:9:1].
Hệ II- Toluen : Aceton : Ethanol: Amoniac [45:45:7:3].
Hệ III- Ether Ethylic : Methanol : Amoniac [50:9:1].
Kết quả cho thấy alcaloid V
2
chạy trên ba hệ dung môi khác nhau luôn cho
một vết. Điều đó chứng tỏ V
2
là đơn chất.
3.2.5 Nhận dạng chất TV
2
TV
2
là dạng tinh thể hình kim, không màu
Tan tốt trong cloroform , methanol, ethanol
Không tan trong nớc.
Độ chảy 170
0
C.
Phổ UV đo trong MeOH cho
max
: 264 nm.
22
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
Phổ IR đo dới dạng viên nén KB6 cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3447,23;
2929,28; 2864,88; 1724,85; 1628,49; 1584,87; 1446,69; 1331,09; 1214,75;
1080,55; 926,02; 776,12; 758,65 cm
-1
.
Phổ MS cho gốc [ M]
+
= 306 nm tơng ứng với công thức C
20
H
22
ON2 và
các pic mảnh:
291 nm= M
+
- 15 (CH
3
)
263 nm= 291- 28 (CO)
251 nm= 279- 28 (CH
2
=CH
2
)
234 nm= 251- 17 (OH)
267 nm (C
12
H
9
N)
Chúng tôi đã gửi đo phổ NMR nhng cha nhận đợc kết quả. Căn cứ vào phổ
UV, MS chúng tôi dự kiến nhận dạng chất V2 là kumin (C
20
H
22
ON
2
).
Phần IV - Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận
Sau một thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp, nghiên cứu alcaloid cây
lá ngón tại bộ môn dợc liệu Trờng Đại học Dợc Hà Nội. Chúng tôi đã thu
đợc kết quả sau:
* Về đặc điểm thực vật:
23
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
- Đã quan sát mô tả đợc đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu và Giáo
s Vũ Văn Chuyên đã định tên khoa học là:
Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae.
- Đã xác định đặc đIểm vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm bột rễ, thân, lá
của cây lá ngón nghiên cứu góp phần tiêu chuẩn hoá dợc liệu.
Về thành phần hoá học:
Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong ba bộ phận rễ, thân, lá
của cây lá ngón có alcaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đờng khử,
sterol.
Bằng sắc kí lớp mỏng và sử dụng hệ dung môi thích hợp đã phát hiện đợc 8
vết alcaloid trong rễ và thân, 4 vết alcaloid trong lá.
Đã định lợng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá bằng phơng pháp
acid-base. Kết quả cho thấy trong rễ có 0,588%, trong thân có 0,377%,
trong lá có 0,169% alcaloid toàn phần trong bột dợc.
Đã phân lập đợc 1 alcaloid tinh khiết trong rễ cây lá ngón. Căn cứ vào
phổ UV, phổ IR, phổ khối, phổ NMR. Chúng tôi sơ bộ nhận dạng V
2

kumin.
24
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368
4.2. Đề nghị:
Trên đây là những kết quả nghiên cứu bớc đầu.công trình nghiên cứu này
cần đợc nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoá học đặc biệt là chiết xuất, phân
lập các alcaloid, thử độc tính và tác dụng sinh học.
25

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×