Tải bản đầy đủ

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR (Phần phụ)

LỜI CẢM TẠ
Xin tạc dạ ghi lòng công lao biển trời của cha mẹ đã sinh thành và nuôi nấng tôi.
Tôi xin chân thành cảm tạ:
• Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
• ThS. Nguyễn Thái Thủy, ThS. Phan Thị Ngọc Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
• TS. Phạm Hùng Vân, chị Phạm Thanh Thùy Trang, chị Võ Thị Thanh Thảo đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tại công ty Nam
Khoa.
• TS. Nguyễn Hữu Thịnh đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kiến thức quý
báu.
• Ban Giám đốc công ty Nam Khoa và quý Thầy Cô, cán bộ công chức trẻ Trung
Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
• Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ sinh học khóa 27 đã chia sẻ cùng tôi
những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi
trong thời gian thực tập.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 08 năm 2005.
Phạm Thị Mỹ Hạnh

iii
TÓM TẮT
PHẠM THỊ MỸ HẠNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “PHÁT
HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM
SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR”.
Hội đồng hướng dẫn:
ThS. PHAN THỊ NGỌC THỦY
ThS. NGUYỄN THÁI THỦY
Đề tài “Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú
(Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” được thực hiện tại Công Ty Nam
Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05. Đề tài được thực hiện trên đối tượng là
virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Virus này gây dịch bệnh ảnh hưởng
nghiêm trọng đến sản lượng tôm sú nuôi (Penaeus monodon) trên thế giới và ở nước ta.
Sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú ở
các giai đoạn nuôi nhằm phát hiện nhanh, chính xác; định lượng WSSV trên các mẫu
tôm sú; góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát dịch bệnh đốm trắng.
Những kết quả đạt được:
• Xác định được quy trình ly trích ADN phù hợp cho phản ứng Real – time PCR
và Non Stop Nested PCR.
• Ứng dụng thành công phương pháp Real - time PCR để phát hiện và định lượng
số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú.
• Xác định khả năng định lượng chính xác của phương pháp Real – time với độ lặp
lại cao.
• Xác định được độ nhạy của phương pháp Real - time PCR so với Non Stop
Nested PCR
• Ứng dụng Real - time PCR để phát hiện và định lượng WSSV trên 30 mẫu tôm
sú thu từ thực tiễn ở các giai đoạn nuôi, có 22 mẫu bị nhiễm WSSV từ rất nhẹ
đến nặng và 8 mẫu âm tính về bệnh đốm trắng.
• Bước đầu đánh giá về khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm
WSSV.
iv
SUMMARY
PHAM THI MY HANH, Nong Lam University. August, 2005. “DETECTION AND
QUANTIFICATION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) IN BLACK
TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) BY USING REAL – TIME PCR”.
Guidance council:
Ms. PHAN THI NGOC THUY
Ms. NGUYEN THAI THUY
Thesis “Detection and Quantification of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in
Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) by Using Real - time PCR” was carried out in
Nam Khoa company and at Chemical & Biological Analysis and Experiment Center of
Nong Lam University from March 1
st
, 2005 to August 1
st
, 2005. The object of the thesis
is White Spot Syndrome Virus (WSSV) in black tiger shrimp. This virus has caused an
epidermic viral disease outbreak occurred on cultured black tiger shrimp (Penaeus
monodon) which had caused severe economic losses to the shrimp production in
Vietnam and around the world. Using Real – time PCR for detection and quantification
WSSV in cultured black tiger shrimp at all stages aims to rapidly, precisely detect and
quantify WSSV in cultured black tiger shrimp in order to prevent the occurrence and
outspread of the disease outbreak.
My obtained results include:
• An appropriate DNA extraction protocol for Real - time PCR and Non Stop
Nested PCR reactions.
• Successful application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in black
tiger shrimp.
• Capacity of precise WSSV quantification of Real - time PCR with highly
repeated results.
• Comparision the sensitivity of Real - time PCR with Non Stop Nested PCR.
• Application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in 30 collected
samples of cultured black tiger shrimp at all stages. The result indicated that there
are 22 samples infected with WSSV from very light to severe infection and 8
samples uninfected with WSSV.
• Preliminary evaluation of the success of cultured ponds stocked with WSSV
infected shrimp seeds or cultured shrimp infected with WSSV.
v
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ..................................................................................................................iii
Tóm tắt.......................................................................................................................iv
Mục lục......................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt..........................................................................................x
Danh sách các hình.....................................................................................................xii
Danh sách các bảng....................................................................................................xv
1. MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................1
1.2. Mục đích yêu cầu.............................................................................................2
1.2.1. Mục đích..................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu....................................................................................................2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................3
2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon).........................................3
2.1.1. Phân loại..................................................................................................3
2.1.2.Vùng phân bố............................................................................................3
2.1.3. Chu kỳ sống.............................................................................................4
2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam....................................5
2.2.1. Trên thế giới.............................................................................................5
2.2.2. Ở Việt Nam..............................................................................................5
2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm..................................................................................7
2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV).........................................................7
2.3.1.1. Định danh và phân loại...................................................................7
2.3.1.2. Đặc điểm hình thái..........................................................................8
2.3.1.3. Đặc tính sinh học.............................................................................8
2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV.............................................................9
2.3.3. Các con đường lây truyền WSSV............................................................9
2.3.4. Cơ chế xâm nhập.....................................................................................10
2.3.5. Triệu chứng của bệnh..............................................................................10
vi
2.3.6. Phương pháp chẩn đoán...........................................................................11
2.4. Phương pháp PCR và các cải tiến....................................................................12
2.4.1. Phương pháp PCR....................................................................................12
2.4.1.1. Nguyên tắc....................................................................................12
2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR..............................................13
2.4.1.3. Các bước phản ứng.......................................................................13
2.4.1.4. Ứng dụng......................................................................................14
2.4.1.5. Ưu và nhược điểm........................................................................14
2.4.2. Kỹ thuật Nested PCR...............................................................................15
2.4.2.1. Nguyên tắc....................................................................................15
2.4.2.2. Ưu và nhược điểm........................................................................16
2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR........................................................................16
2.4.3.1. Lịch sử phát triển..........................................................................16
2.4.3.2. Khái niệm.....................................................................................17
2.4.3.3. Nguyên tắc....................................................................................17
2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR............................................................17
2.4.3.5. Phương pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR.........................18
2.4.3.6. Nguyên lý định lượng của kỹ thuật Real - time PCR...................22
2.4.3.7. Ưu và nhược điểm........................................................................23
2.4.3.8. Ứng dụng......................................................................................23
3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................25
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................25
3.1.1. Thời gian thực hiện..................................................................................25
3.1.2. Địa điểm thu mẫu....................................................................................25
3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu...........................................................................25
3.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................25
3.3. Nguyên vật liệu................................................................................................25
3.3.1. Mẫu xét nghiệm.......................................................................................25
3.3.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất..........................................................26
3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ..............................................................26
3.3.2.2. Hoá chất........................................................................................27
vii

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×