Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH


Nguyễn Thò Thanh Bình


NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM AMYLASE CỦA
MỘT SỐ CHỦNG NẤM SI PHÂN LẬP TỪ RỪNG
NGẬP MẶN CẦN GIỜ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THANH THỦY




Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 8 - 2010
THƯ
VIỆN
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành
luận văn này.
Tôi xin ghi nhớ công ơn tất cả Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh, và trong phòng thí nghiệm Vi
sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành công việc nghiên cứu thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học,
Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành
thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luôn yêu thương và ủng hộ
tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010
NGUYỄN THỊ THANH BÌNH














LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết quả trong luận văn
này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.


Tác giả luận văn



Nguyễn Thị Thanh Bình
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT



CMC Carboxymethy cellulose
dd Dung dịch
DNS 3, 5 – dinitrosalicylic acid

amylase
Hoạt độ amylase
HST Hệ sinh thái
KL Khuẩn lạc
KS Kháng sinh
MT Môi trường
NS Nấm sợi
NXB Nhà xuất bản
OD Optical density (mật độ quang)
PTN Phòng thí nghiệm
RNM Rừng ngập mặn
SV Sinh vật
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
MỞ ĐẦU
Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học. Nó
có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm
tăng tốc độ đường hóa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời
gian hình thành sản phẩm.
Amylase thu nhận từ VSV nói chung, từ NS nói riêng có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại
amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian
thu enzym nhanh, giá thành rẻ, có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn
giản và rẻ tiền. Với những ưu thế nổi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho
ngành công nghiệp sản xuất enzym. Do đó, trong vòng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ
NS đã dần thay thế enzym từ động vật. Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae,
Aspergillus niger, Rhizopus,...
Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm, dược
phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng
năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các
chủng NS sinh amylase cao luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước.
Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luôn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt.
Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ có môi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính
cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học giúp SV thích nghi tốt với
điều kiện sống. Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá của vùng ven
biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV.
Hơn nữa, Việt Nam là nước có nguồn tinh bột và phụ phẩm nông nghiệp khá dồi dào là điều
kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm.
Có thể nói cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trò của chúng trong hệ sinh
thái này còn quá ít và chưa đầy đủ. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn enzym từ các NS,
cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài:

Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng
ngập mặn Cần Giờ”.

 Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh
α
-amylase và glucoamylase cao từ RNM
Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh
 Nhiệm vụ của đề tài
- Phân lập các chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ.
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được
- Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát
- Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn
- Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn
- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase
- Thu nhận chế phẩm amylase thô và so sánh với enzym thương mại trên thị trường.
- Khảo sát các đặc tính sinh học khác
 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ
- Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý
Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ.
 Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
- Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh



Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH
1.1.1. Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản
RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với
MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng. Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu
Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa
dạng sinh học cao [34], [39].
Hình 1.1. Rừng ngập mặn Cần Giờ
Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sông
Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp. Hồ Chí Minh. Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ
Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông. Cách trung tâm Tp. Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc
Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An,
phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đông
sang Tây là 30 km [39].
Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,8
0
C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 –
7
0
C. Khí hậu nóng ẩm và chịu sự chi phối của quy luật gió mùa xích đạo. Nhiệt độ không khí có ảnh
hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vật RNM. Chapman (1977) cho rằng RNM chỉ
phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 20
0
C, và biên độ dao động theo mùa không
quá 10
0
C [36], [34], [39].
Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng. Ở đây, mùa mưa từ
tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm
hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.Hồ Chí Minh: mùa mưa là 70 – 83%, mùa
khô là 74 – 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4. Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/
ngày và 1204mm/tháng [34].
Ngoài ra, gió cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng
tới độ thoát hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36].
Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá, quá trình nhiễm
mặn đồng thời nó được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai
mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn.
Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yếu tố như gió mùa, thuỷ triều, mưa, nước
dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt
động của hồ Trị An, Dầu Tiếng…) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ. Độ
mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%.
Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các loài cây ngập
mặn và phân bố của RNM. Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước có độ mặn từ 25% đến
50% độ mặn nước biển. Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thông qua quá
trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36].
RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông. Mỗi tháng
có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Mực
nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39]. Chế
độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng
so với vùng có nhật triều. Các dòng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm
và SV dọc theo các vùng ven biển.
1.1.2. Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ
RNM Cần Giờ có hệ SV vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài đem lại
những giá trị kinh tế cao.
Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các
loài chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang,
Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ôrô, dừa lá, ráng… Thảm cỏ
biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66].
Động vật: bao gồm động vật thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên
130 loài, 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách
đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus),
trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ [66].
Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều
loài thủy sinh, các động vật có xương sống và hệ VSV.
Vi sinh vật rất đa dạng gồm có: vi khuẩn, nấm, tảo
 Vi khuẩn
VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV
phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này. Số lượng VK
trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng
nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. Nhiều
loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt
mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36].
 Nấm
Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích
thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh
xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM:
trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai
MT trở lên [36].
Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes,
Bacidomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R.
mangle) khi còn trên cây: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và
Aureobacidium [36].
Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây
chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium và Cercospora. Hầu hết các loài nấm trên đất liền
đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước
mặn. Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các
mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36]
Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải
cellulose, lignin. Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập
mặn đồng thời phân lập được 66 chi nấm, đại diện là các chi Phycomycetes, Thraustochytrium,
Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium… Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và
cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác thực vật. Chúng còn góp phần phân huỷ cỏ
biển, bùn và đầm lầy mặn. Những loài này chịu được điều kiện mặn của RNM [36].
 Tảo
Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát
triển trên các MT: bề mặt bùn, bề mặt thân cây, rễ, những cành và tán phía trên. Trong đó trên bề
mặt bùn gồm cả tảo đơn bào, tảo đa bào mà chủ yếu là tảo xanh lục. Người ta liệt kê có khoảng 41
loài tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng không hình thành trên các vùng rõ ràng mà tùy
thuộc vào độ ngập triều [36].
Tảo bùn có tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nó làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ
quá trình quang hợp. Tảo còn tạo ra độ thoáng khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành
phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm
[36].
Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt
xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật
chất ở RNM Cần Giờ.
1.1.3. Vai trò của RNM đối với hệ sinh thái
RNM có liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần
xã cửa sông khác. Dòng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dòng nước triều từ biển lên xuống
các vùng cửa sông đều đi qua RNM. Các dòng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới
quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong
phú về thành phần SV cho nơi này [36].
Hệ thực vật RNM bao gồm các loài thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng
nước mặn, hệ rễ của cây góp phần vào việc làm giảm tốc độ dòng chảy của thủy triều, tạo điều kiện
lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng góp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về
lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đó, hệ thực vật còn đóng vai trò quan trọng
trong việc điều hòa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34].
RNM còn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như
tôm, cua, cá,... Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các
loài cá sống ở cửa sông. Khi so sánh thành phần các loài cá và tôm trong một vùng có RNM vào các
mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các loài này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở
ngoài đầm. Từ đây cho thấy RNM là nơi nuôi dưỡng chính cho con non của nhiều loài hải sản [36]
Các loài động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau
thông qua các quá trình trao đổi chất và đồng hóa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng
của hệ sinh thái này. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật
chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài
như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰
[36]
Tuy nhiên, hiện nay RNM đang có những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá,
tôm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuôi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý
không tốt thì các vùng đất RNM sẽ bị suy thoái và không thể tồn tại lâu bền.
1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI
1.2.1. Đặc điểm sinh học của NS
NS là VSV có nhân chuẩn. Hệ nấm có cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những
ống dài phân nhánh hay không phân nhánh, có hay không có vách ngăn ngang (septum), đường kính
sợi từ 3-3,5 µm. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo
thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể [58].










Cấu trúc sợi nấm gồm có thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân. Thành tế bào NS chứa
kitin-cellulose hoặc kitin-glucan [58].
Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm.
Khuẩn lạc NS thường có dạng hình tròn hoặc gần tròn.
Bề mặt KL có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những
vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa [60]
Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm.
Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt
tiết, sắc tố hòa tan [58],...
Phương thức dinh dưỡng của NS là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có
khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và
động thực vật.







Hình1.2. Cấu trúc sợi nấm













NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính.
Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong
sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59].
NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt
tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích
kinh tế cao. Bên cạnh đó, từ NS còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng
dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất [1], [57], [59].
 Khả năng sinh các enzym ngoại bào
NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, từ NS người
ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đó có 10 enzym được ứng dụng rộng rãi
trong kỹ thuật. Một số enzym ngoại bào từ NS được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến
như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase [21], [26], [29].
 Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose.
Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi-
cellulose và lignin (15-30%). Các chủng NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…có khả năng
sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ,
các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21].
 Protease là enzym thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide
ngắn. NS có khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã động vật ở RNM thường gặp
thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease còn được sử dụng nhiều trong công nghiệp bột

Hình1.3: Hình thái khuẩn ty NS Hình1.4 Hình thái khuẩn lạc NS


Hình1.5: Hình thái một số dạng bào tử của NS
giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp
thực phẩm, xử lý chất thải...[29].
 Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực
vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase)
sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm
cuối cùng là glucose. NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là những tác nhân không thể
thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… Amylase được ứng
dụng rộng rãi trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế
biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt....[21].
 Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi
mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc rất nhiều. Nhiều
loài NS thuộc chi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… có khả năng sinh chitinase, giúp tăng
cường khả năng tiêu diệt các loài nấm gây bệnh và chống các loài côn trùng có vỏ kitin. [21].
Các chủng NS thuộc chi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh các
enzym phân giải dầu góp phần xử lý ô nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM
Cần Giờ [35].
 Khả năng sinh KS của NS
KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm
trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.
Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS
được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí
chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu
thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11].
Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những
phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất KS được
sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc
sống ngày nay [11].
Ngoài ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong công nghệ thực phẩm,
công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Axit hữu cơ sản xuất từ NS
được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS
Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích
thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [29].
Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều loài NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất
lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học,... Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung
thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số NS gây bệnh cho người và động
vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ
bông ở lúa…[6], [7].
1.2.2. Vị trí phân loại
Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng
mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài.
Riêng các loài nấm thuộc lớp Nấm bất toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc
306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản [6].
Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là:
Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử
dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng
sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995). Trong luận
văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của
Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57].
Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới
cho việc nghiên cứu phân loại học. Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen
(PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nói chung và NS sinh amylase ở RNM nói
riêng.
Hiện nay có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995 ;
Jones, 1995), trong khi đó một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu
biết về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ. Có
thể nói đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C. V and Anuci, V,
1998) [43]. Sự nghiên cứu về nấm RNM chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Những
năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính đa dạng của nấm trong RNM còn rất lẻ tẻ, nhưng sau này
các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nấm toàn thế giới trong đó có nấm biển ở RNM.
Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hóa các loài
nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ. Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông 170
loài, Đài Loan 7 loài, Singapore 156 loài, Nhật 26 loài, Úc 67 loài, Mexico 94 loài, Đức 4 loài, Thái
Lan 83 loài,…[49]
Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina,
Deuteromycotina và Basidiomycotina
Năm 1987, Hype và cộng sự công bố phát hiện được 89 loài nấm từ cây Rhizophora
mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [48].
Năm 1988, Agate A. D., Subramania C. V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp
bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong
đó có sự phân loại, hệ thống hóa cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới [43].
Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó bao gồm 87 loài
thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes.
Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các loài nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ lá cây mục
ở RNM, có khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đó.
Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đóng vai trò
quan trọng đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM.
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về
nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định. Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh
enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy. Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên
cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam
Định, Thái Bình [52].
Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đó. Các nghiên cứu
VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở
các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ
khác nhau. Đó là các loài NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium,
Paecilomyces, Canninghamela có khả năng phân giải dầu DO rất mạnh
[69].

Theo nhóm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hoàng Trí, những chất thải rắn
trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông
ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm
trong sạch nước biển. Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho
MT vùng ven biển” [69].
Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus
phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình. Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các
nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8].
Đến năm 2007 mới có tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng
sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1]
Năm 2009, có tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số
chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41].
Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta còn nghiên cứu các đặc tính
sinh học của chủng này. Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus. Một
số loài của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits,
Butova 1965, Fennkxova. Rư-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951. Corman Lanalu-ke, 1948)
[17].
Một số công trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy
glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới
glucose [17].
Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B.N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính
chất của amylase phân giải tinh bột sống mới từ A. cacbonarius
Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình “Nghiên cứu
về α-amylase ngoại bào của chi Aspergillus” của Baldwin, Toby M, …cho thấy sự liên quan giữa
việc sinh α- amylase và glucoamylase của chi nấm này [15].
Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D. V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ A.
niger. Năm 1977, tác giả L. V. Chứ, Đ. T. T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với
đối tượng A. awamorii .
Đến năm 1984, N. B Ngà và N. L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài A.
oryzae, A. niger, A. awamorii có hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột
sắn.
Năm 1993, có công trình : “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp. niger TH3 – 19K của Nhật
Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D. V Hợp và cộng
sự.
Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu
nhận amlyse từ nấm mốc Aspergillus sp” [2].
Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII,
BioIII… có dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase và các VSV dùng bổ sung vào
thức ăn cho cá, heo, bò. Chế phẩm có tác dụng phòng chống chứng rối loại tiêu hóa, kích thích tăng
trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[57].
Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng có những khảo sát về khả năng sinh enzym
amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10]
Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của
một số chủng NS ở RNM Cần Giờ” [15].
Có thể nói những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, còn
những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn còn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm
năng.
1.3. TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE
1.3.1. Tinh bột
Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và
amilopectin [5].
 Thành phần cấu trúc của amylose.
Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết
α−1,4 glicozit.





Hình1.6 – Phân tử Amilose
 Thành phần cấu trúc của amilopectin
Amilopectin là polyme có mạch nhánh, ngoài mạch chính có liên kết α-1,4 glucozit còn có
nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit.
Cấu tạo của amilopectin còn lớn và dị thể hơn amilose nhiều. Trong tinh bột tỉ lệ
amiloza/amilopectin khoảng ¼. Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm
sóc.






Hình1.7 – Phân tử amilopectin
Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú. Nhưng để phù
hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần

phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm [5], [23], [28].
1.3.2. Hệ enzym amylase
Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside
trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và
glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31],
[44].
Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là:
1.3.2.1. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase
Là enzym phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một cách
ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả. Việc tác dụng α – amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả
năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose.
Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose. Còn
amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose [5], [21].
α – amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và dextrin phân tử thấp không tạo
màu với iod. Chúng có ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV.
α – amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng. Tất cả các α – amylase đều chứa
từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol. Nếu tách hoàn toàn Ca
khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia
hình thành và ổn định enzym. Ca còn tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực
lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21]
α – amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường không giống nhau.
+ pH thích hợp cho hoạt động của đa số α – amylase từ NS là 4,5 – 5,5; của đại mạch nảy
mầm và thóc mầm là 4,7 – 5,4; và của VK là 5,5 – 6. pH tối thích của α – amylase từ A. oryzae là
4,8 – 5,8 [26].
+ Độ bền của α – amylase với tác dụng của axit từ NS được sắp xếp theo thứ tự sau: A.
batatae > A. usamii> A. oryzae> A. awamori> B. subtilis> thóc mầm [21].
+ α – amylase của NS rất nhạy cảm với hoạt động của nhiệt độ tối thích khoảng 40 - 50
0
C,
thóc mầm và malt là 58 – 60
0
C và VK là 70 – 75
0
C [21].
α – amylase hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột
rất nhanh. Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn:
* Giai đoạn đầu: (
Giai đoạn dextrin hóa
) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ
tinh bột giảm
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
* Giai đoạn 2: (
Giai đoạn đường hóa
) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17]
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
1.3.2.2. β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase
α-amylase

Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Chỉ phổ biến ở thực
vật, nhiều ở hạt nảy mầm. Vi khuẩn không có enzym này, còn NS chưa được chứng minh hoàn toàn
về sự hiện diện của enzym này [5], [21].
β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 70
0
C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt
độ tối thích là 60 – 65
0
C. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4. Đa số β – amylase hoạt động
mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt
tính khi không có canxi.
Điểm khác biệt của enzym này so với α-amylase là hầu như không tác dụng
lên tinh bột sống mà chỉ phân giải hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amilose và 54-58%
amilopectin thành maltose [26].
1.3.2.3. Glucoamylase hay amyloglucozidaza, còn gọi là γ-amylae
Đây là enzym đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase. Glucoamylase xúc tác thủy phân
các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo
sản phẩm cuối cùng là glucose. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,
dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44].
Trong số các VSV có khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus
là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus
niger.
Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 –
5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH
kiềm. Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH=9,
glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44].
Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 60
0
C. Tuy nhiên, cũng có trường hợp glucoamylase
hoạt động tốt nhất ở 65 – 70
0
C, ví dụ như glucoamylase của loài C. thermosaccharolytium.
Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi Hg
+
nhưng các ion Mn
2+
và Fe
2+
lại có tác dụng kích thích
sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29].
1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS
a. Giống nấm sợi
Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình
thành và hàm lượng amylase. Không phải tất cả các chủng nấm đều có khả năng tổng hợp amylase
như nhau. Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym
do chúng sản sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS có khả năng tạo nhiều amylase là
điều vô cùng quan
trọng [26], [31].
Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS có khả năng sinh amylase cao, cần
phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp
enzym cao nhất và ổn định nhất. Sau đó, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để
giữ được hoạt tính ban đầu.
b. Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym
của NS. Vì vậy, trong MT nuôi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất
dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]
 Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trong MT nuôi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải có nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và
nguồn cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat
dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hóa:
con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26].
Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành
các enzym riêng biệt của hệ amylase. Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh
bột, còn với glucoamylase là 2% [26].
Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn
gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đó cám
gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho
VSV phát triển. Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường có tính chất vật lý rất
thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong
khối nguyên liệu [26].
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuôi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vô cơ
chủ yếu là NaNO
3
hoặc NH
4
NO
3
với hàm lượng 0,91% có hiệu quả cao hơn các loại muối khác.
Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên
liệu giàu đạm như: cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô dầu,…[21], [26].
Khi sử dụng nguồn nitơ nhất định cho vào MT có thể kích thích tổng hợp
amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá
trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức
chế tổng hợp α-amylase.
Tỉ lệ giữa cacbon và nitơ trong MT có ý nghĩa rất lớn đối với sự tạo thành amylase. Chỉ khi
nào trong MT có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzym cực lớn. Trong MT
Czapeck tỉ lệ giữa tinh bột và NaNO
3
là 18:1 [21].
 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Cu…có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình
chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym,
điều hòa các chất trong tế bào…[26]
Một số chất khoáng có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym amylse như:
Canxi là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nó cần cho quá trình tổng hợp và
ổn định α-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ
bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO
4
sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova,
Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tổng hợp α-amylase và glucoamylase là
0,05%.
Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm
tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT có
nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21].
c. Điều kiện nuôi cấy
Ngoài các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH,
thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-32
0
C. Chu kỳ sinh trưởng của
NS có thể chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt
độ cần ở 23-30
0
C. Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nấm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ
phóng ở 28-29
0
C. Và ở thời kì
sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt độ 28-29
0
C [26].
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 60-65%, VK là khoảng
70%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng
khí của MT, còn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV.
- Ảnh hưởng của pH
Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh
enzym cao ở MT trung tính. pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà
còn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp. Ví dụ, A. oryzae khi MT có pH=6,5 thì ưu thế
tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH của MT là 4,5.
- Ảnh hưởng của độ mặn
Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngoài tác dụng cung
cấp nguồn ion Cl
-
còn có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho
việc tiết các chất ra MT [26].
Hầu hết các chủng nấm sợi RNM đều có khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối từ 3-5%
(Mai Thị Hằng, 2001). Một số chủng có nguồn gốc tại RNM là có khả năng chịu mặn thì sinh
trưởng tốt ở nồng độ muối 10%. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng từ 20 - 30% thì một số NS có thể
sống được nhưng mọc rất yếu [12]
- Ảnh hưởng của thời gian
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym. Trong quá trình nuôi cấy NS,
sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử. Thời gian kết thúc sự tạo
thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ. Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất là trong
khoảng từ 40 đến 50 giờ [21]
1.3.4. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận amylase
 Phương pháp nuôi cấy chìm – MT nuôi dạng lỏng.
NS được nuôi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột có bổ sung
nguồn nitơ vô cơ (NaNO
3
). Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều
amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch,
nước chiết ngô,… Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung
cấp ôxy cho NS phát triển. Để thu nhận enzym, dịch enzym được cô đặc ở nhiệt độ thấp [26], [28].
Phương pháp này có ưu điểm:
-NS được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ tiếp
xúc với dịch dinh dưỡng.
- Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa.
Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:
- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối
- Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục
- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ
- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất
cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa.
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn
Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính thường
là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo,…được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt
ngũ cốc, mạt cưa,… để làm tăng độ thoáng khí. MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng
khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1-1,5
atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào. MT đã cấy giống được tãi lên các khay
sạch với chiều dày từ 2 – 5cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian nuôi cấy,
người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 40
0
C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ. Đây chính là chế phẩm
enzym dạng thô [26].
Phương pháp này có nhược điểm là:
- Tốn diện tích mặt bằng
- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình
- Chi phí nhân công, điện nước...cho một đơn vị sản phẩm cao
Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì
NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao. Nồng độ enzym tạo
thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. MT không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm
VSV lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính
enzym. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzym tinh khiết, rất dễ thực hiện,
quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang thiết bị [28].
 Phương pháp thu nhận amylase
- Từ phương pháp nuôi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn không tan
còn khoảng 1-3% chất khô hòa tan, trong đó có enzym. Thu dịch lọc, sau đó cô đặc cho giảm thể
tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân không ở 25 – 30
0
C, rồi tiến hành tách enzym.
- Từ môi trường nuôi cấy bề mặt: Chế phẩm enzym thô được bổ sung lượng nước gấp 4 – 5
lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 10-12
0
C. Dịch
chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong.
Dịch chiết được cô đặc chân không tới 50-55% chất khô hòa tan, dịch đậm đặc này có thể
bảo quản lâu dài mà không mất hoạt lực và rất dễ hòa tan.
- Tinh sạch amylase: Sử dụng cồn lạnh (4
0
C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ
từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch lọc enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh. Sau 15 –
24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy khô nhẹ ở nhiệt
độ < 40
0
C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết [26]
1.3.4. Ứng dụng của enzym amylase
Amylase là hệ enzym thủy phân quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học. Hiện nay,
việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng trong
nhiều lãnh vực khác nhau [29].
a. Trong công nghệ rượu, cồn, bia
Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã sử dụng chế phẩm amylse từ NS A. oryzae
hay A. awamori, B. subtilis để thay thế malt trong việc đường hóa tinh bột sản xuất rượu, bia từ
nguyên liệu có chứa tinh bột. Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tấn tinh bột loại tốt,
giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất. Người Nhật đã biết sử dụng enzym của
nấm mốc trong quá trình
đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì
đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm. Còn
người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31].
Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang
mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29].
b. Sản xuất bánh mì
Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ
nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp. Nhiệt độ vô hoạt α-
amylase của NS tương đối cao (70
0
C) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà không có
hiện tượng dextrin hóa khi nướng. Hơn nữa, hoạt độ α-amylase lại cao nên có thể đạt đến độ đường
hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay. Tuy nhiên, chế phẩm enzym nấm mốc thường
là một phức hệ enzym, trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29].
c. Công nghiệp dệt
Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải thô
thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Để làm vải mềm, có khả năng nhúng nước,
tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng 1 lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nấm mốc)
khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90
0
C. Phương pháp này không
làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh.
Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản
xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở
quy mô công nghiệp [29].
d. Trong sản xuất thức ăn gia súc
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành
phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử
dụng chế phẩm amylase của A. oryzae, A. owamorii thêm enzym amylase vào khẩu phần ăn của
động vật, nhất là động vật
non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh [31].
e. Nghiên cứu sinh học, y học
Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng
của amylase. Chế phẩm amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ
nhạy cao
Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, kém khả năng
chuyển hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh,…
Ngoài ra, chế phẩm enzym được dùng để điều chế MT nuôi VSV phục vụ cho công tác
nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh [29], [31].
 Một số chế phẩm enzym amylase trên thế giới và Việt Nam
Bảng 1.1 : Một số chế phẩm enzym amylase thương mại [21]
STT Chế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất

1

α-amylase vi khuẩn
Tenase
Optiamyl
BAN
Miles lab
Miles Kali-chemie
Novo-nordisk

2

α-amylase vi khuẩn
chịu nhiệt
Termamyl
Opti-therm
Maxamyl
Novo-nordisk
Miles Kali-chemie
Gist-brocades

3

Amyloglucosidase
Diazym
AMG
Spezym
Miles lab
Novo-nordisk
Fiun Biochemical
4 β-amylase Dextrozym (chứaAMG)
Promozym
Novo-nordisk
Novo-nordisk

5
Biozym
MKC. Fugal amylase
Fungamyl clarase
Amano
Novo-nordisk
Miles lab




x

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×