Tải bản đầy đủ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
٭٭٭٭
  
٭٭٭٭






LÊ THỊ DUNG




XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA
VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG
KỸ THUẬT REAL-TIME PCR




Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
Mã số: 60 40 60




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. CAO MINH NGA





THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010
THƯ
VIỆN
MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài:
Viêm gan (VG) còn gọi là sưng gan, là một tình trạng bệnh lý phổ biến do thương tổn ở tế bào
gan. Có nhiều nguyên nhân gây ra VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất và một vài loại thuốc cũng như vô
số loại virus, trong đó có virus viêm gan B (VRVGB) [20]. VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) là
một trong những virus tiêu biểu của họ Hepadnaviridae, một họ gây VG cho nhiều loài động vật. HBV
lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc,… Quá trình nhiễm bệnh của
HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao.
Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có hơn 2 tỷ người trên thế giới nhiễm HBV
trong thời điểm nào đó của cuộc đời, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết
vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan [6]. Đến năm 2004, số người nhiễm HBV trên
toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [28]. Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính được xem như một vấn đề y
tế mang tính chất toàn cầu. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh với tỷ lệ nhiễm
VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa là có trên 10 triệu trong tổng số khoảng 80 triệu
người bị nhiễm VRVGB [8].
Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại là thuốc uống và
thuốc tiêm. Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b và PEG Interferon alfa-2a, đây là loại thuốc vừa ức chế
siêu vi vừa tăng cường miễn dịch nhưng đắt tiền và nhiều tác dụng phụ. Còn thuốc uống gồm
Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) và Tenofovir (TDF)... được Cơ quan
Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng.
Ở Việt Nam hiện nay, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm
gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng
LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng
LAM. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm
thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm [26,29,39]. Asparagine (N) được
thay bởi Threonine (T) tại codon 236 trên vùng RT (rtN236T) và alanine (A) được thay bằng Valine
(V) hoặc Threonine (T) tại codon 181 trên vùng RT (rtA181V/T) được nhận biết là kháng ADV [38].
Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến như phương pháp dựa vào
kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen. Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai
mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays,
PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase; Karl Mullis và cộng sự,
1985), phương pháp real-time PCR,… và mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. Tuy nhiên,
do tính ưu việt của phương pháp real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác,
không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real-
time PCR để phát hiện các đột biến kháng ADV ở HBV trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm
gan B mãn.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến
rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real-
time PCR”, nhằm phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp sẽ có ý nghĩa trong
công tác theo dõi và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B.

Mục đích của đề tài: Xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV
tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát
triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai.

Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân VGB mạn đã và đang được điều trị bằng ADV.
Phạm vi nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm, các trung tâm xét nghiệm và các bệnh viện thuộc
địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (Bệnh viện Đại học Y Dược, Trung tâm Y khoa Medic, Phòng thí
nghiệm Công ty Việt Á...).

Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn của đề tài: Trong những năm gần đây, ở Việt Nam
đã có nhiều nghiên cứu của các bệnh viện và cơ sở y tế ứng dụng phương pháp giải trình tự và PCR để
phát hiện các đột biến kháng thuốc của HBV ở những bệnh nhân viêm gan B mãn đã và đang được
điều trị, trong đó có đột biến kháng ADV tại vị trí rtA181T/V và rtN236T. Tuy nhiên, giá thành cho
mỗi mẫu xét nghiệm bằng giải trình tự là khá cao. Do vậy, có một quy trình xác định kháng Adefovir
tại rtA181T/V và rtN236T đơn giản, chính xác, giá thành thấp là rất cần thiết. Để đáp ứng nhu cầu đó,
chúng tôi xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm phát hiện đột biến kháng Adefovir và đây là công
trình chưa từng được công bố trước đây tại Việt Nam.

Bố cục của đề tài:
Mở đầu
Chương 1 – Tổng quan tài liệu
Chương 2 – Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 3 – Kết quả và thảo luận
Chương 4 – Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục.





CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Bệnh VGB (VG huyết thanh) là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới với nhiều con
đường lây truyền khác nhau. Châu Á và châu Phi là những khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất
(khoảng 180 triệu dân châu Á và châu Phi đang mang mầm bệnh, chiếm 80% trong tổng số 220 triệu
người mang mầm bệnh trên toàn thế giới) [20]. Một số bệnh nhân đã nhiễm HBV sau khi lành bệnh
vẫn còn mang mầm bệnh trong một thời gian dài, một số khác trở thành VG mạn tính kéo dài nhiều
năm hay suốt đời, dẫn đến xơ gan, ung thư tế bào gan. Do vậy, nhiễm HBV được xem là một vấn đề
sức khỏe toàn cầu.
Theo Dieter Glebe và cộng sự [26,44], HBV được xếp vào 8 kiểu gen A, B, C, D, E, F, G, H phân
bố tùy theo vùng địa dư. Kiểu gen B và C chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam.
Theo Perrillo và cộng sự [34], ADV là chất tương tự nucleoside/tide, được FDA chấp thuận sử
dụng trong điều trị những bệnh nhân mang HBV mạn tính từ năm 2005. Nó đóng vai trò như chất ức
chế lên vùng reverse transcriptase (RT) của gen HBV polymerase, và trong tất cả các trường hợp đã
hoàn toàn làm giảm nồng độ của virus. Tuy nhiên, chất ức chế này chủ yếu tác động vào sự nhân lên
của virus làm cho virus không thể tăng lên được chứ không tiêu diệt virus bằng cách phá hủy cấu trúc
của virus đã được hình thành theo Pawlotsky và cộng sự [33]. Đây là nguyên nhân của sự xuất hiện các
đột biến kháng thuốc của HBV dẫn đến điều trị thất bại và diễn tiến xấu của bệnh. Hiện tượng kháng
ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở
những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm trong các nghiên cứu của Hadziyannis và cộng sự (2005)
[27], Lok và cộng sự (2007) [30], Westland và cộng sự (2003) [40].
Theo Villet và cộng sự (2008) [39], Lok và cộng sự (2007) [30], Pawlotsky và cộng sự (2008)
[33], các đột biến chính dẫn đến hiện tượng kháng ADV của HBV trong điều trị tại vị trí rt181 và rt236
thuộc dạng đột biến điểm thay thế nucleotide này thành nucleotide khác, làm biến đổi acide amine này
thành acide amine khác.
Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến kháng ADV của HBV như giải trình tự, lai
mẫu dò (line probe assay – LiPA), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Tính đa
hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), PCR (có thể kết hợp với giải trình tự), real-time PCR (PCR định
lượng)… Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng.
PCR kết hợp với giải trình tự có công trình của Yan J. và cộng sự (2006) [39] với độ nhạy là 10
3

bản sao/l. Chen J.J. và cộng sự (2008) [25] sử dụng phương pháp PCR-RFLP phát hiện được virus
mang đột biến rtN236T trong thời gian điều trị bằng ADV từ 0-8 tháng.
Bộ kit INNO-LiPA HBV DR v2 (Innogenetics, 2006) sử dụng mẫu dò đặc hiệu với nhiều vị trí
đột biến kháng ADV và LAM. Theo Carla Osiowy và cộng sự (2006) [24], Munira Hussain và cộng sự
(2006) [31], bộ kit này có độ đặc hiệu cao, phát hiện sớm các đột biến và có độ nhạy cao hơn so với
phương pháp giải trình tự chuỗi. Ưu điểm là cùng lúc có thể phát hiện được nhiều đột biến, thao tác kỹ
thuật dễ thực hiện nhưng giá thành quá đắt không phù hợp trong phát hiện và chẩn đoán, phục vụ cho
quá trình theo dõi và điều trị nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam.
Trong công trình nghiên cứu của mình, Julien Lupo và cộng sự (2009) [28] đã chứng tỏ rằng việc
phát hiện đột biến kháng ADV và LAM bằng phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao hơn cả so
với phản ứng lai mẫu dò (sử dụng bộ kit INNO-LiPA DR v2, Innogenetics) và giải trình tự. Bằng cách
pha trộn chủng đột biến và chủng hoang dại, real-time PCR với mẫu dò phát huỳnh quang có khả năng
phát hiện 0,1% bản sao mang đột biến trong tổng số 10
5
bản sao. Phương pháp này có ưu điểm là định
lượng được nồng độ virus mang đột biến trong quần thể nên giúp hiểu rõ hơn sự phát triển tự nhiên của
các dạng virus kháng thuốc trong suốt quá trình điều trị.
1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Việt Nam nằm trong vùng dịch lưu hành cao với tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng từ 10-20%
dân số [6,20]. Trong một số nghiên cứu y học [1,9], ở Việt Nam, HBV có 3 kiểu gen A, B và C. Trong
đó, hai kiểu gen B và C là chủ yếu.
Hiện nay, ở Việt Nam, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm
gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng
LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng
LAM. Hiệu quả điều trị bằng ADV là không thay đổi với các kiểu gen (genotype) của HBV. Hiện
tượng kháng ADV của HBV ở những bệnh nhân mạn tính trong thời gian điều trị thường xuất hiện
chậm với tỷ lệ thấp. Thế nhưng một khi đột biến mới xuất hiện, nó sẽ nhân lên trong quần thể và ảnh
hưởng không nhỏ đến quá trình chẩn đoán và chi phí điều trị.
Các phương pháp áp dụng phát hiện các dạng đột biến kháng thuốc của HBV hiện nay là PCR,
giải trình tự, PCR-RFLP, real-time PCR… Một số cơ sở y tế hiện đang sử dụng một số bộ kit của nước
ngoài kết hợp với giải trình tự bằng hệ thống máy tự động.
LAM (1998) được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng điều trị sớm hơn so với ADV (2002), do vậy
ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu và phát hiện tính kháng LAM của HBV trong điều trị.
Công ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) sử dụng phương pháp giải trình tự trên máy CEQ8000
(Beckman Coulter) để phát hiện kiểu gen và các đột biến kháng LAM, ADV của HBV. Phát hiện đột
biến tại rt180 và rt204 kháng LAM của HBV sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP có đề tài nghiên cứu của
Nguyễn Chí Vinh [22]; sử dụng phương pháp real-time PCR có công trình nghiên cứu của Nguyễn Sử
Minh Tuyết và cộng sự [19], Nguyễn Thành Khôi và Hồ Huỳnh Thùy Dương [10].
Sử dụng phương pháp PCR và đọc kết quả qua điện di trên gel agarose 3% trong đề tài của Trần
Thiện Toàn (Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) [18]. Trong nghiên cứu này,
tác giả sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu hoang dại tại vị trí rt181, bản mẫu mang đột biến sẽ
cho kết quả âm tính (không xuất hiện vạch) trên gel dưới tia UV. Trong khóa luận tốt nghiệp, Huỳnh
Trường An (Đại học Mở, Tp. Hồ Chí Minh) [2], sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu đột biến tại
rt236 và mẫu dò phát huỳnh quang đọc tín hiệu qua mỗi chu kỳ khuếch đại.
Trên thực tế, việc lựa chọn phương pháp nào cho đúng đắn để đưa vào chẩn đoán thường quy là
không dễ. PCR kết hợp với giải trình tự hay PCR-RFLP đều là những phương pháp đòi hỏi kỹ thuật
viên có trình độ tay nghề cao, thao tác khéo léo, thời gian cho kết quả lâu, thiên về nghiên cứu nhiều
hơn là áp dụng vào thực tiễn và nhược điểm lớn nhất là độ nhạy không cao bằng real-time PCR. Với ưu
điểm trên và có thể phát hiện chính xác nồng độ virus đột biến trong quần thể, real-time PCR được xem
là công cụ hữu hiệu nhất với giá thành thấp, dùng để phát hiện các đột biến kháng ADV tại rt181 và
rt236 của HBV ở những bệnh nhân mạn tính.

1.2 Đại cương về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B

1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B [6,7]
Lịch sử của các loại VGVR thực ra là lịch sử của các bệnh vàng da (hoàng đảm), vì hội chứng
này đã được ghi nhận rất lâu trong lịch sử loài người với nhiều bệnh khác nhau có thể gây nên vàng da.
Vàng da có thể chỉ là một dấu hiệu của một bệnh toàn thân, hay là một bệnh chủ yếu ở lá gan. Bệnh ở
gan gây nên vàng da cũng có nhiều nguyên nhân, trong đó tác nhân virus là chủ yếu. Sau đây là lịch sử
của VG được ghi nhận theo kinh biểu niên.
Vàng da nhiễm khuẩn được biết từ thời Hippocrates. Tuy người ta không biết rõ nơi nào và khi
nào trận dịch VGVR đầu tiên xảy ra.
Luerman (1883) mô tả một trận dịch tại xưởng đóng tàu Bremen ở những người được chủng ngừa
vaxcin đậu mùa có bạch cầu người. Cùng năm này, một trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy ra ở
Merzig. Do vậy, sự hiện diện của một thể VGVR lây nhiễm trực tiếp từ máu người hoặc các dẫn xuất
từ máu đã được nghĩ đến.
Virchow (1885) đã mô tả bệnh gan là bệnh “vàng da xuất tiết” (catarrhal). Ông cho rằng vàng da
xuất tiết có nguyên nhân là viêm đường mật do chất nhầy dính làm tắc đường mật, từ đó gây viêm ở
chỗ nối đường mật – tá tràng và bệnh do vi khuẩn gây ra. Quan niệm này của Virchow gây ảnh hưởng
lâu dài và đã cản trở quan điểm tiến bộ về nguyên nhân và sinh bệnh học VGVR cho mãi đến nửa đầu
thế kỷ XX (Thế chiến thứ II).
McDonald (1908) cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là do virus.
Lindstedl (Thụy Điển, 1919) đã tiên phong trong việc đặt ra thuật ngữ VG cho bệnh vàng da xuất
tiết và đã chẩn đoán phân biệt hai dạng VG dịch tễ và VG huyết thanh.
Năm 1943 – 1946, các nghiên cứu ở Anh và Quân Y Mỹ cho rằng VRVGB hiện diện trong huyết
thanh gây vàng da và thường được mang bởi những người khỏe mạnh bình thường và không vàng da.
Nhưng chỉ đến các trận dịch VG trên toàn thế giới trong Thế chiến thứ II mới đưa đến nhận thức
tổng quát về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết của Virchow.
Năm 1947, MacCallum đề nghị gọi tên bệnh VG nhiễm huyết thanh là VGB. Cuối cùng, các thuật
ngữ này được Ủy Ban của Tổ chức Y tế Thế Giới về VGVR chấp thuận.
Năm 1963, Blumberg, trong một nghiên cứu các protein huyết thanh đa hình (polymorphic), đã
phát hiện một protein trong máu của một thổ dân Australia trước đó chưa từng biết. Năm 1965, protein
Australia được gọi là kháng nguyên Australia (hiện nay được gọi là kháng nguyên bề mặt hoặc
HBsAg). Vào lúc này, xét nghiệm miễn dịch men (EIA) đối với các dấu ấn miễn dịch của các loại
VGVR trong huyết thanh vẫn còn là cơ sở chính trong chẩn đoán lâm sàng. Sau khi khám phá ra kháng
nguyên Australia trong huyết thanh, Blumberg và cộng sự nhận xét rằng kháng nguyên này hiện diện
với nồng độ cao ở bệnh nhân ung thư máu và ở các trẻ bị bệnh Down.
Năm 1968, các nhà nghiên cứu khác, nhất là Prince, Okochi và Murakami, đã xác định kháng
nguyên Australia chỉ được tìm thấy trong huyết thanh người nhiễm VRVGB, từ đó VRVGB mới được
nhận biết và được xác lập đặc điểm.
Blumberg nhận giải Nobel Y học vào năm 1976 nhờ phát hiện này.
Từ năm 1942-1967, các nghiên cứu thực nghiệm viêm gan được thực hiện trên chính con người
(Đức và Mỹ) đã bị nhiều người phê phán do vấn đề y đức. Nhưng cũng nhờ đó mà các đặc điểm dịch
tễ, bệnh sử và phòng ngừa của hai loại VG A và B được hiểu biết rõ hơn.
Năm 1970, hạt tương tự virus được phát hiện (gọi là hạt Dane) mang trên bề mặt của nó kháng
nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân VGB và những hạt này được cho là VRVGB.
Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngoài của các hạt Dane.
Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã
nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao
chép trong môi trường nuôi cấy mô. Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản
chất đậm đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù
rằng virion chứa chủ yếu DNA. Do phát hiện này, VRVGB người trở thành kiểu nguyên sinh của họ
hepadnavirus, Hepadnaviridae.
Năm 1972, Magnus phát hiện ra HBeAg.
Mullis K.B. (1983) đã tìm ra phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Đây là một
phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao của một chuỗi mã nhất định.
Nhờ phát minh này, Mullis nhận giải Nobel (1993) và sinh học phân tử có những bước tiến bộ mới. Sự
khuếch đại virus bằng PCR giúp phát hiện trực tiếp và rất nhạy HBV DNA trong huyết thanh, tế bào và
các mô, hơn là phát hiện nhiễm HBV gián tiếp qua đáp ứng miễn dịch ký chủ đối với kháng nguyên
virus.
Nhờ đó trong thập kỷ vừa qua, nhiều tiến bộ đã đạt được về sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh
bệnh học, chẩn đoán, điều trị và dự phòng của HBV.
1.2.2 Phân loại và các kiểu gen HBV
1.2.2.1 Phân loại HBV
Hiện nay, virus có tính hướng gan được xếp vào một danh sách ngày càng dài, thường xếp theo
thứ tự mẫu la tinh từ A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) , E (HEV), G, TTV (đến nay đã có 16
kiểu huyết thanh TTV), virus SENV (phát hiện năm 1999, đến nay đã có 9 kiểu gen), virus SANBAN,
virus nhỏ giống TTV, virus YONBAN, virus Sentinel… [6,7] Trong đó, chỉ có virus A và E là truyền
theo đường tiêu hóa (thường gặp trong các vụ dịch ở Châu Á, Bắc Phi và Mexico); các virus khác (B,
C, D) truyền theo đường máu; còn VRVG G cũng được cho là có thể truyền qua đường máu, là tác
nhân gây bệnh nhưng hiếm, nếu có thì thường gây VG rõ rệt. Năm 1994, VRVG F được báo cáo,
nhưng hiện nay, VRVG F được xem là thể biến dị của HBV gặp ở Nhật Bản [6,16].
Dựa theo sự xuất hiện ngoài tự nhiên: HBV thuộc virus động vật có xương sống. Dựa theo các
nhóm acide nucleic của virus động vật, HBV nằm trong nhóm 1, chứa 2 sợi DNA có cấu trúc xoắn
vòng, chỉ một mạch phiên mã tạo mRNA (dịch mã tạo protein vỏ capsid). HBV có cấu trúc 20 mặt, 42
capsomer, có vỏ ngoài, trọng lượng phân tử là 1,6kD, sợi thứ hai chưa hoàn chỉnh và có khác về chiều
dài. Dựa theo khả năng gây bệnh: HBV là virus gây viêm gan (viêm nhiễm các tuyến) [4].
Hệ thống phân loại HBV:
Họ Hepadnaviridae
Chi Orthohepadnavirus
Hepatitis B virus [20].

1.2.2.2 Các kiểu gen HBV
Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự các nucleotide, hiện nay người ta chia HBV thành 8 kiểu
gen (genotype) được gọi theo thứ tự mẫu la tinh: A, B, C, D, E, F, G, H [44]. Các kiểu gen HBV này
khác nhau ít nhất 8%. Bên cạnh đó, chúng còn rất đa dạng, trong mỗi kiểu gen lại được chia ra thành
nhiều phân týp (subgenotype) và các phân týp này khác nhau ít nhất 4% [26].
Các kiểu gen HBV khác nhau phân bố ở các vùng địa lí đặc trưng khác nhau: kiểu gen A phổ
biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, và Ấn Độ; kiểu gen B và C thì phổ biến ở Châu Á; kiểu gen D phổ
biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi; kiểu gen E phổ biến ở Tây
Phi; kiểu gen F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska; kiểu gen G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ;
kiểu gen H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ và Nhật Bản [37].



Hình 1.1: Sự phân bố các kiểu gen của HBV trên thế giới
Nguồn: Marion Peters MD (2008), Hepatitis B - Diagnosis, Serology, Virology, UCSF.

1.2.3 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam
Nhiễm HBV là một bệnh thường gặp nhất trên thế giới gây VG mạn ở người. VGB mạn tính có
thể dẫn đến xơ gan và chết do suy gan; đây là nguyên nhân chính yếu của ung thư tế bào gan trên thế
giới.

1.2.3.1 Thế giới
Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế giới, hơn 350 triệu người
mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan.
Ngày nay, dù đã có các vacxin hiệu quả chống lại VGB, HBV cũng gây ra khoảng 1,2 triệu cái chết
hàng năm trên toàn thế giới. Đến năm 2000, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu
người [1].
Tỷ lệ người mang HBsAg thay đổi khác nhau trên thế giới từ 0,1% đến 0,2% ở Anh, Mỹ và
Scandinavia, đến hơn 3% ở Hy Lạp và miền Nam nước Ý và có thể lên đến 10% - 11% hoặc hơn nữa ở
Châu Phi và Viễn Đông trong đó có Đông Nam Á. Người mang HBsAg có thể có tỷ lệ rất cao trong vài
cộng đồng sống biệt lập như người Eskimo Alaska và người dân bản xứ Australia.
HBV lưu hành trên toàn thế giới. Người ta ước tính trên thế giới có hơn 50 triệu người nhiễm
HBV mới xảy ra hàng năm [1].

1.2.3.2 Việt Nam
Trên bản đồ dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng
nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao
nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài
nước xác nhận.
Ở Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về VGB. Mức nhiễm HBV của Việt Nam
tương đối cao, tỷ lệ có HBsAg trong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên,
Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996…) cho thấy nước ta là nước có dịch HBV địa phương
cao [1].

1.2.4 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B

Căn cứ vào tần suất nhiễm HBV, tỷ lệ nhiễm virus toàn bộ, độ tuổi nhiễm virus và cách truyền
bệnh chủ yếu, người ta chia thành 3 khu vực với 3 mức độ lưu hành rõ rệt: vùng nội dịch lưu hành cao,
vùng nội dịch lưu hành trung bình và vùng nội dịch lưu hành thấp. Hơn phân nữa dân cư trên thế giới
đã từng nhiễm HBV, dù tần suất chính xác khó dự đoán và rất khác nhau giữa các khu vực. Người ta đã
tính có 45% dân số sống trong vùng dịch lưu hành cao, 43% trong vùng dịch trung bình và 12% trong
vùng dịch lưu hành thấp [1].
1.2.4.1 Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area)
Trong vùng dịch lưu hành cao có ≥ 8% người nhiễm HBV mạn và trong huyết thanh của đa số
người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm virus trước đó. Những vùng này gồm đa số các nước châu Á,
trong đó có Việt Nam (trừ Nhật và Ấn Độ), châu Phi, hầu hết vùng Trung Đông, vùng châu thổ
Amazon Nam Mỹ, hầu hết các nhóm quần đảo Thái Bình Dương và một số dân địa phương khác như
người Eskimo, thổ dân châu Úc và dân Maori. Trong các vùng dịch lưu hành như Đông Á, vùng Sahara
Hạ ở châu Phi và lưu vực sông Amazon, tỷ lệ người mang HBV từ 8% đến 25% và tần suất anti-HBs từ
60-85%. Vì thế, phơi nhiễm HBV trong các vùng dịch lưu hành cao có thể đạt đến 100% [1].
1.2.4.2 Vùng nội dịch lưu hành trung bình (intermediate endemic area)
Trong vùng dịch lưu hành trung bình, tần suất của người nhiễm HBV mạn từ 2-7% và 20-50%
người lớn đã từng nhiễm HBV. Những vùng này gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, miền Tây Á,
Nhật, Đông Nam châu Âu và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ. Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sống
trung bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20-60%. Tần suất anti-HBs hoặc anti-HBc ở
những người HBsAg(-) có nguy cơ trung bình hơi thấp và hầu hết các phơi nhiễm xảy ra ở trẻ con.
Những vùng này bao gồm 43% dân số toàn cầu [1].

Hình 1.2: Sự phân bố HBV trên thế giới
Nguồn: http://uscis.gov/graphics/shared/aboutus/statistics/yearbook/2002.pdf

1.2.4.3 Vùng nội dịch lưu hành thấp (low endemic area)
Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từng nhiễm virus dưới 20%.
Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand. Tần suất của HBsAg từ dưới 0,1%
ở Bắc Âu và 1% đến 5% ở Nam châu Âu.
Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật và Dự phòng Mỹ (CDC) ước tính ở Mỹ có 140000 đến 320000
người mới nhiễm HBV mỗi năm. Nhiễm HBV mới gây ra 8400 đến 19000 trường hợp nhập viện hàng
năm và 140 đến 320 người chết vì viêm gan kịch phát. Ở Mỹ, có từ 1 đến 1,25 triệu người mang HBV
mạn tính, nhiều người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [6].

1.2.5 Một số đặc điểm sinh học của HBV
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, một họ gây viêm gan cho nhiều loài động vật. HBV là một virus
DNA nhỏ với các đặc điểm về siêu cấu trúc, phân tử, kháng nguyên và sinh học độc đáo, khác biệt với
các thành viên của tất cả các họ virus đã được biết. DNA khá nhỏ, tròn, một phần mạch đơn (do cơ chế
sao chép của chúng và do có men phiên mã ngược). Các đặc điểm sinh học đáng chú ý là tính hướng cơ
quan (tropism) nổi bật đối với tế bào gan và có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (tình trạng người
mang mạn tính), với nồng độ cao của kháng nguyên virus gồm các thể virus toàn vẹn hay không toàn
vẹn chứa trong máu tồn tại trong nhiều tháng hoặc nhiều năm [6]. HBV là một virus bền vững, nó có
thể sống và gây nhiễm trùng trong vòng 6 tháng ở diều kiện nhiệt độ phòng [3].

1.2.5.1 Hình thái học và cấu trúc của HBV
HBV là VRVG người đầu tiên mà đặc điểm cấu trúc protein và bộ gen được nhận dạng và xác
định một cách cơ bản và đầy đủ.
 Hình thái học hạt virus hoàn chỉnh
HBV có 3 kiểu hạt hiện diện trong máu của người nhiễm virus. Virus hoàn chỉnh (virion, hạt
Dane) có hình cầu, đường kính 42-45nm; các hạt cầu và các dạng sợi nhỏ hơn có đường kính khoảng
22nm chứa các protein và lipit vỏ ngoài HBsAg [6].

Hình 1.3: Các dạng HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử
Nguồn: http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html

 Cấu trúc của HBV virion [6]
Dùng phương pháp nhuộm âm bản, virion hấp phụ vào các rây của kính hiển vi điện tử và một
cấu trúc hai vỏ của virion hiện rõ.

Hình 1.4: Cấu trúc của HBV virion
Nguồn: www.yanengbio.com/en/Product_view.asp?cp_id=72

- Vỏ protein bên ngoài hoặc màng bao kích thước 7nm, được tạo thành bởi các kháng nguyên bề
mặt HBsAg, glycoprotein, lipid. Các chi tiết cấu trúc bề mặt như núm hoặc gai, như ở nhiều virus có
màng bao khác, không thấy có trên HBV.
- Bên trong là hạt lõi hay còn gọi là capsit có đường kính 28-34nm dưới kính hiển vi điện tử lạnh.
Vỏ trong bao gói HBV DNA, có thành phần kháng nguyên HBcAg và một số enzyme quan trọng như
polymerase, protein kinase…

1.2.5.2 Thành phần cấu trúc kháng nguyên
 Hạt Dane: Huyết thanh của người bị nhiễm trùng cũng chứa một số lượng ít hơn những hạt
kích thước khoảng 42nm. Đó là những virus còn nguyên vẹn và có khả năng gây nhiễm [3].
 HBsAg: Sự hiện hữu của HBsAg là bằng chứng đầu tiên của nhiễm HBV, nó xuất hiện trước
các bằng chứng về sinh hóa của bệnh gan [16]. Huyết thanh của người mang virus nồng độ
cao chứa một lượng khá lớn các hạt không gây nhiễm là các protein HBs dư thừa (HBsAg).
Đó là các hạt hình cầu hoặc hình sợi. Các hạt hình cầu có đường kính 17-25nm, chiếm đa số;
chúng có dạng như là các túi nhỏ với thành dày độ 4nm và đường kính bên trong từ 10-
15nm. Các hạt hình sợi (hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20nm có chiều dài thay đổi.
Huyết thanh của người mang HBV với nồng độ virus huyết thấp thường các hạt cầu HBs và
các sợi HBs rất ít hoặc không có. Hai cấu trúc virus phụ này không chứa HBV DNA và vì
thế không gây nhiễm [6].
 HBcAg (các hạt lõi trong gan): Các hạt lõi HBV trống không có vỏ ngoài thường được
thấy trong nhân tế bào gan là nơi chúng được tổng hợp và dự trữ (một số hạt lõi có thể được
tổng hợp trong bào tương). Có hai loại hạt lõi: hạt lõi trống không chứa DNA và hạt lõi đầy
có chứa DNA. Tuy nhiên, không có các hạt lõi trần nào được tìm thấy ở huyết thanh của
người mang HBV dung nạp miễn dịch mà không có anti-HBc [6]. Vì vậy, HBcAg không xác
định được bằng các phản ứng huyết thanh học, nó được tách ra sau khi phá vỡ hạt Dane ở
các mẫu sinh thiết, sau đó xác định bằng phương pháp ELISA [20].
 HBeAg: Kháng nguyên này đại diện cho dạng tiết ra của HBcAg xuất hiện trong quá trình ủ
bệnh, giai đoạn tiền triệu và nhiễm trùng cấp. Xuất hiện sau HBsAg 2-4 tuần (khoảng 1,5
tháng sau khi nhiễm virus). Sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự lây
nhiễm. Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn đến tăng khả năng
viêm gan B mạn tính [6,16]. Vì hàm lượng của nó tỷ lệ thuận với lượng virus, do đó qua
kháng nguyên này có thể đánh giá được mức độ nhiễm của người bệnh [20].

1.2.5.3 Cấu trúc bộ máy di truyền
 Cấu trúc của DNA virion
Dưới kính hiển vi điện tử, HBV DNA hình vòng, mạch kép không hoàn chỉnh và dài khoảng
3181-3221 base. Việc đánh số bắt đầu ở một điểm phân cắt của EcoRI. Bên trong virion, mạch DNA
mã hóa protein virus gọi là mạch (-), có chiều dài nguyên vẹn nhưng không đóng đồng hóa trị. Có một
phần dư nhỏ từ 9 đến 10 base tại đầu tận. DNA mạch (-) mang tại đầu tận 5’ phần gắn kết đồng hóa trị
của polymerase virus được gọi là protein tận cùng hoặc primase, vì cần thiết khởi động cho sự tổng hợp
mạch (-). Mạch (+) giữ mạch (-) trong cấu hình vòng vì nó tạo cầu nối cho những đoạn không liên tục
của mạch (-) [1]. Đầu tận 3’ của mạch (+) không ở một vị trí cố định và còn nối với HBV DNA
polymerase. Đa số các bộ gen HBV chứa một lỗ hổng mạch đơn có chiều dài từ 300-2000 base do
mạch (+) có chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của mạch (-) [6,20].
Mạch (-) đầy đủ có các đầu tận 5’ và 3’ xác định với một phần dư tận cùng gồm 9 base, trong
vùng mà ở đó bộ gen có mạch ba. Polymerase virus nối đồng hóa trị vào tyrosin 63 qua một cầu
phosphodieste vào đầu 5’ của mạch âm. Đầu tận 5’ của mạch DNA (+) được tạo bởi một
oligonucleotide chiều dài 18 base, được gắn chóp theo cùng một cách như RNA thông tin (mRNA). Bộ
gen chứa 2 chuỗi mã 10 hoặc 11 base được lặp lại một cách trực tiếp, được gọi là các chuỗi mã lặp lại
trực tiếp, DR1 và DR2. Cấu trúc bộ gen này là điển hình cho tất cả Hepadnaviridae, nhưng trong các
hepadnavirus gia cầm, sự gối lên nhau và khoảng cách giữa các đoạn lặp lại (DR) ngắn hơn [6].
Cấu trúc của bộ gen HBV không theo các tiêu chuẩn xếp loại thông thường của virus trong nhiều
khía cạnh: cấu trúc bộ gen có cả DNA và RNA và bộ gen chứa DNA mạch đơn, mạch kép và ngay cả
mạch ba không hoàn chỉnh. Các đặc trưng bất thường này là do hậu quả trực tiếp của cơ chế sao chép
của chúng [6].

 Cấu trúc bộ gen của HBV
Định nghĩa các khung đọc mở: Từ chuỗi mã nucleotide của một phiên bản mạch kép của bộ gen
HBV, người ta có thể nhận được 6 chuỗi mã khác nhau của bộ ba mã hóa aa của nucleotide (codon).
Nếu có một chuỗi mã của các codon không mã hóa protein, nó sẽ bị cắt đứt một cách ngẫu nhiên bởi
một trong 3 codon kết thúc, trong khi các chuỗi mã mã hóa protein thường không có codon kết thúc
trong một khoảng ít nhất 50 codon. Các quãng codon này được gọi là khung đọc mở (KĐM) [6].
Cấu trúc bộ gen của HBV:
Hầu hết KĐM chức năng của tổ chức tế bào cũng như các KĐM từ các virus lớn hơn, được xếp
theo kiểu đường thẳng trên bộ gen và mã hóa một protein. Hơn nữa, chúng nằm rải rác cạnh các vùng
rộng không mã hóa được gọi là intron (vùng không mã hóa), bị loại bỏ sau khi phiên mã bởi hiện tượng
ghép nối. Các vùng điều hòa và mã hóa protein thường khá phân tán. Tuy nhiên, bộ gen HBV có chiều
dài tối thiểu gồm: KĐM mã hóa DNA polymerase virus và các chức năng phụ; KĐM S nằm hoàn toàn
trong phạm vi KĐM P; KĐM C và X gối lên KĐM P một phần; KĐM S mã hóa 3 protein HBs có
chung một đầu tận cùng; KĐM C mã hóa cho cả 2 protein, HBe và HBc; KĐM X cũng có thể mã hóa
hơn 1 protein [6].
- Vùng S (surface): gồm 3 gen S, preS1, preS2. Gen S: Mã hóa cho protein chính. Gen S và preS2
mã hóa loại protein trung bình (M). Gen S, preS1 và preS2 mã hóa protein lớn (L) của vỏ ngoài chứa
390 acide amine, tham gia vào việc gắn virus vào tế bào gan, lắp ráp virion và giải phóng virus ra khỏi
tế bào.
- Vùng C (core): gồm gen C và preC. Gen C mã hóa cho protein lớn của lõi gồm 138 acide amine,
có khả năng gắn kết với acide nucleic, tham gia vào quá trình lắp ráp virus.

Hình 1.5: Cấu trúc bộ gen HBV
Nguồn: http://international.abbottmolecular.com/RealTimeHBV_16732.aspx


- Vùng P (polymerase): Gen P chiếm ¾ bộ gen của virus, gối lên phần cuối gen C, phần đầu gen
X và toàn bộ gen S. Gen P mã hóa một polypeptide chứa 832 acide amine rất giàu histidine, trọng
lượng phân tử khoảng 90kD, có hoạt tính DNA polymerase và enzyme phiên mã ngược (DNA
polymerase phụ thuộc RNA).
- Vùng X: Là gen có kích thước nhỏ nhất. Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác
nhưng có lẽ nó giữ vai trò là nhân tố hoạt hóa (transactivation) trong quá trình nhân đôi của siêu vi.
Virus DHBV không có vùng X [6,20].

1.2.5.4 Quá trình sao chép của virus viêm gan B
Quá trình sao chép của HBV và có thể được chia làm nhiều bước:
1. Gắn kết virus vào tế bào ký chủ;
2. Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào);
3. Phóng thích bộ gen virus;
4. Biểu hiện các sản phẩm gen virus;
5. Sao chép bộ gen virus;
6. Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh);
7. Phóng thích virus.

 Gắn kết virus vào tế bào ký chủ
Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt xác định tính hướng cơ quan của
virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào [6].
Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong máu và tìm cách gắn kết vào tế bào chủ. Nhiều bằng chứng
cho thấy một vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể. Các kháng thể đối với PreS1
có thể phong tỏa sự gắn kết của virion HBV vào màng tế bào gan. Sự gắn kết cũng có thể qua trung
gian albumin huyết thanh người đã biến đổi. Vì thế, HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi
như một phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [6].

 Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào)
Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ ngoài HBV có protein dung
hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung
hợp màng virus với màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc virus nhập
nội bào qua trung gian thụ thể [6].

 Phóng thích bộ gen virus
Trước đây, người ta cho rằng toàn bộ hạt lõi được vận chuyển vào nhân. Các nghiên cứu gần đây
cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân là 25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy
nhiên, hạt lõi có thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl hóa. Vì kích
cỡ của hạt lõi, sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy ra khi bộ gen virus vào nhân, có thể qua trung
gian của polymerase virus nối đồng hóa trị [1].
 Biểu hiện các sản phẩm gen virus [20]
Sự biểu hiện các gen của virus thông qua ít nhất hai bản phiên mã không qua xử lí ghép nối.
Không có protein nào được mã hóa bởi mạch (+).
Sau khi cởi bỏ vỏ capsid, HBV DNA kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân và
chuyển thành dạng cccDNA. Dạng này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại RNA với các kích
thước khác nhau 3,5; 2,4; 2,1; và 0,7kb. Trong đó, mRNA 3,5kb gọi là RNA tiền genom, dùng làm
khuôn để tổng hợp genom. Các mRNA còn lại được gọi là dưới genom dùng để tổng hợp các protein
khác nhau trong đó có DNA polymerase (P), protein lõi C và preC, polypeptide X, protein bề mặt S và
protienkinase. Các mRNA này được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất.
Protein lõi C tạo thành nucleocapsid (HBcAg). Polypeptide tiền lõi được vận chuyển đến mạng
lưới nội chất, từ đó chúng được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyên tiền lõi (HBeAg). RNA tiền
genom được đóng gói cùng với HBV DNA polymerase và proteinkinase để tạo thành hạt lõi.
Protein X tương tác với các yếu tố phiên mã trong nhân được kích thích bởi tín hiệu từ tế bào chất.
Protein vỏ ngoài S gắn vào màng lipid của bộ mày golgi và mạng lưới nội chất để sau đó nucleocapsid
này nảy chồi vào mạng lưới nội chất và bộ máy golgi để biến chúng thành vỏ ngoài của virus tương lai.
Trong quá trình nhân lên, virus luôn tổng hợp thừa protein vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm
HBV, ngoài hạt virus hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu, hình
que hoặc hình sợi.

 Sao chép bộ gen virus
Sau khi hạt lõi được lắp ráp xong, RNA tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp chuỗi
DNA theo cơ chế sao chép ngược. Vùng primase của polymerase dùng như một đoạn mồi đối với men
phiên mã ngược. Bởi thế, mạch DNA (-) lớn lên (ở dưới bên trái) được gắn kết vào đầu tận 5’ của
primase. Sự phiên mã ngược tiến hành cho đến đầu tận 5’ của khuôn mẫu RNA được tiếp cận. Bởi thế
một phần dư ngắn được sinh ra ở mạch (-). Hoạt tính RNase H kết hợp với men phiên mã ngược làm
thoái hóa khuôn mẫu RNA và phân cắt một đoạn RNA có mũ chụp dài 18 base ở đầu tận 5’ của nó.
Đoạn này có sự đồng dạng 6 base đối với DR1 và DR2 lặp lại trực tiếp. Sự tương tác yếu này cho phép
chuyển đoạn và men phiên mã ngược /DNA polymerase từ DR1 vào DR2. Ở đây, đoạn RNA có chức
năng như một đoạn mồi tổng hợp DNA mạch (+). DNA polymerase có khả năng xuyên qua tính không
liên tục trong khuôn mẫu mạch (-) vì đoạn dư ngắn tận cùng của nó. Sau đó, cấu trúc của DNA virion
được tái sản xuất [6].

Hình 1.6: Quá trình sao chép của HBV trong tế bào gan
Nguồn: http://www1.qiagen.com/Default.aspx

Một số genom trưởng thành sau khi tổng hợp lại quay về nhân để chuyển thành cccDNA nhằm
duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã [20]. Các tế bào gan thường chỉ tích lũy khoảng 50 bản
sao HBV cccDNA cho mỗi tế bào [6].
 Lắp ráp các hạt virion
Sự tổng hợp HBV DNA chưa được hoàn tất trước khi virus trưởng thành. Tại mạng lưới nội chất,
các phân tử lõi trưởng thành được đóng gói vào trong các protein bề mặt [6,20].

 Phóng thích virus khỏi tế bào chủ
Sau khi có vỏ ngoài, virus hoàn chỉnh được tiết ra thông qua bọng vận chuyển [6,20].

1.2.6 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị HBV

1.2.6.1 Con đường lây nhiễm

Nguồn hoặc ổ chứa HBV người chính là con người. Không có ổ chứa quan trọng nào khác trên
động vật. Một vài bề mặt dụng cụ như kim tiêm, bàn chải đánh răng, dao cạo râu, đồ chơi, dụng cụ y
tế… có thể là trung gian truyền nhiễm người – người của HBV cho một số lớn bệnh nhân. HBV thường
không có trong phân và không có bằng chứng truyền nhiễm theo con đường phân – miệng như virus
viêm gan A. Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua đường ngoài tiêu hoá.
Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong các dịch tiết của bệnh nhân đã nhiễm có nồng
độ siêu vi B rất cao và khi bệnh nhân tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian
dài. Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mạn tính thường không có triệu chứng và họ không
hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những người xung quanh [6].
Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây nhiễm chính:
 Lây truyền qua đường ngoài tiêu hoá do tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu (dịch
nhiễm virus)
Đây là con đường lây nhiễm thường gặp nhất, cả ở vùng dịch lưu hành cao và thấp. Việc sàng
lọc máu hoặc các chế phẩm máu để loại HBsAg và không dùng dung môi là huyết thanh cho vacxin
hầu như đã loại bỏ nguyên nhân này ở các nước phát triển. Tuy nhiên, các bệnh nhân nhận các yếu tố
đông máu đậm đặc vẫn còn nguy cơ nhiễm virus do HBsAg ở mức độ thấp, không phát hiện được.
Trong những quốc gia mà máu chưa được sàng lọc HBsAg hoặc sàng lọc không đúng mức, nguy cơ
nhiễm HBV còn cao [6].
Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền máu nhiều lần, người
mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận... Ngoài ra bệnh còn có thể lây qua đường tiêm
chích hoặc khi sử dụng các dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hoá,
châm cứu, xỏ lỗ tai, xâm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma túy sử dụng chung ống
tiêm.

 Lây truyền qua đường sinh dục [6]
Đây là con đường truyền nhiễm HBV đã được chứng minh và thường gặp ở các nước phát triển
nhất là trong nhóm đồng tính luyến ái. Tuy nhiên, con đường lây này không quan trọng bằng con
đường lây do phơi nhiễm với máu và dịch cơ thể ở các nước dịch lưu hành cao và trung bình.
Trong các nghiên cứu về mãi dâm, những người tiếp xúc sinh lý với người mang HBV mạn và
những người chăm sóc ở các cơ sở điều trị bệnh truyền theo đường sinh dục có tần suất của các dấu ấn
nhiễm HBV cao hơn 3-5 lần trong cộng đồng. Trong nhóm này cũng như trong cộng đồng dân cư Mỹ,
nguy cơ nhiễm HBV thường tỷ lệ thuận với số lượng bạn tình và với tình trạng nhiễm giang mai trước
đó. Sự kết hợp chặt chẽ với giang mai có thể do tính chất gây loét của giang mai, giúp nhiễm HBV hiệu
quả hơn. HBV cũng có thể là dấu ấn chỉ điểm cho những bệnh loét đường sinh dục mạn tính khác, hoặc
cho việc tiếp xúc tình dục với người có nguy cơ cao.

 Lây truyền từ mẹ sang con (truyền nhiễm chu sinh) [6]
HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau thai. Mức độ nặng và tiên
lượng của tình trạng lây nhiễm này tuỳ thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian
bị nhiễm HBV cấp tính ở mẹ.
Ở Đài Loan, người ta đã ước tính 40-50% người mang HBsAg mạn nhiễm tiên phát trong thời
kỳ chu sinh, chỉ có 5-10% có thể nhiễm trong bào thai, những trẻ khác có thể nhiễm vào lúc sổ nhau do
phơi nhiễm với máu người mẹ nhiễm virus. Vì vậy, việc cần thiết phải tiêm chủng bằng vacxin và có
thể cả globulin miễn dịch viêm gan B (HBIG) ngay sau khi bé chào đời.
Trẻ sinh ra từ người mẹ có HBsAg (+), HBeAg (+) có 60-80% nguy cơ nhiễm HBV phát triển
trong 9 tháng sau khi sinh và 90% trong số đó trở thành người mang HBV tồn tại. Các trẻ sinh ra do
người mẹ mang HBeAg (-), nguy cơ nhiễm trong năm đầu sau sinh thấp hơn (2-15%). Truyền nhiễm
HBV chu sinh thay đổi theo đặc tính lưu hành và tần số HBeAg (+) ở những người mẹ mang HBV.
Trên thế giới, truyền nhiễm chu sinh góp phần quan trọng (15-40%) vào số lượng người mang HBV
trong cộng đồng.

 Các đường lây truyền khác [6]

Nhiễm HBV ở trẻ em: Nhiều trẻ không nhiễm HBV vào thời kỳ chu sinh, sẽ bị nhiễm vào vài
tháng đầu sau sinh, có lẽ do tiếp xúc chặt chẽ với mẹ hoặc anh chị em bị nhiễm virus.

Vai trò của nước bọt: Nước bọt là một đường truyền nhiễm HBV cần được nghiên cứu, có thể
gây nhiễm do những tiếp xúc thân mật không phải tình dục. Khảo sát trên hắc tinh tinh cho thấy, nước
bọt có thể gây nhiễm nếu có dây máu nhiễm HBV. Nhưng không truyền nhiễm khi niêm mạc đường
tiêu hóa không bị tổn thương và nước bọt nhiễm HBV được phun khí dung vào mũi, khi uống nước có
nhiễm HBV, hay khi chải răng. Tuy nhiên, truyền nhiễm có thể xảy ra qua vết cắn hoặc qua cơm được
mớm từ người mẹ nhiễm virus.

Nhiễm virus qua đường miệng: HBV không lây nhiễm qua đường phân miệng vì thế phân người
không thể là nguồn lây nhiễm HBV trong cộng đồng. Gây nhiễm sau khi uống một lượng HBV đã
được chứng minh liều lượng virus cần cho việc gây nhiễm thành công qua đường uống cao hơn qua
đường máu; nhưng sự gây nhiễm qua đường uống không xảy ra qua đường tiêu hóa, mà qua những tổn
thương nhỏ thường có trong niêm mạc miệng.
Vai trò của tinh dịch và dịch tiết âm đạo: Tinh dịch và dịch tiết âm đạo chứa nồng độ virus bằng
hoặc có phần cao hơn với nồng độ virus trong nước bọt và giữ một vai trò quan trọng trong truyền
nhiễm HBV.
Đường lây nhiễm qua da: Các yếu tố nguy cơ nhiễm virus là rệp hoặc ve bét trên giường của trẻ,
muỗi truyền sốt rét, các tổn thương da, xỏ lỗ tai, cắt bao quy đầu… Tai nạn kim tiêm truyền HBV qua
da trực tiếp có thể xảy ra với kim nhiễm máu và các sản phẩm của máu hoặc xảy ra khi thẩm tách máu,
xâm mình, châm cứu…; những vật liệu gây nhiễm tiếp xúc với da hở, hoặc niêm mạc mắt… Vì sức đề
kháng của HBV khá cao và ổn định, có thể lây nhiễm do tiếp xúc với niêm mạc hoặc da bị thương tổn
như bàn chải đánh răng, chai sữa, đồ chơi, các dụng cụ ăn, dao cạo râu hoặc các bộ dụng cụ trong bệnh
viện như máy hô hấp nhân tạo, nội soi, đồ thủy tinh trong phòng thí nghiệm…

1.2.6.2 Triệu chứng lâm sàng [6,16]
Ở người lớn khi nhiễm viêm gan siêu vi B cơ thể họ thường phản ứng theo 2 cách khác nhau: thứ
nhất là bệnh xảy ra cấp tính, ít hơn 1% số người bị nhiễm có thể phản ứng nặng nề và thiệt mạng vì bị
hư gan trong vòng vài tuần sau khi nhiễm virus này. Thứ hai là bệnh chuyển thành mạn tính, khoảng
10% không loại trừ được siêu vi này và họ sẽ mang virus này trong gan suốt đời, những người này có
khả năng lây sang người khác và có nguy cơ ung thư gan hoặc xơ gan.
Trẻ sơ sinh và trẻ em có nhiều nguy cơ bị nhiễm viêm gan B mạn tính hơn sau khi bị nhiễm virus
này. Tuy vậy, hầu hết những đứa trẻ bị nhiễm này đều không có triệu chứng gì. Khoảng 90% trẻ sơ
sinh có mẹ bị nhiễm sẽ trở thành người mang virus mạn tính và chỉ 5-10% có khả năng loại trừ virus
khỏi cơ thể. Đối với trẻ em bị nhiễm HBV sau khi tiếp xúc với mầm bệnh sẽ trở thành người mang siêu
vi mạn tính, chỉ có khoảng 40% là lành bệnh nếu như được phát hiện và điều trị kịp thời.
Hầu hết trẻ em khi bị nhiễm HBV không hề có triệu chứng. Người lớn nhiễm có khoảng một phần
tư không có triệu chứng. Triệu chứng thường xuất hiện sau 4-6 tuần bị nhiễm: mức độ từ trung bình
đến nặng. Các triệu chứng thường thay đổi theo từng người, thông thường có các triệu chứng sau: chán
ăn, buồn nôn, mệt mỏi, suy nhược, nước tiểu sậm màu và nổi mẫn đỏ khắp người, đau bụng (nhất là ở
vùng quanh gan), vàng da, vàng mắt (nguyên nhân vàng da là do gan bị suy giảm chức năng đào thải
bilirubin, một sản phẩm chuyển hoá từ những tế bào hồng cầu già bị chết trong máu. Hậu quả là do
bilirubin tích tụ và lắng đọng ở da gây ra màu vàng.

1.2.6.3 Biện pháp phòng ngừa và điều trị

 Phòng bệnh
Miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch (Ig – Immunoglobulin) có kháng thể kháng HBs với
hiệu giá cao (Hepatitis B immune globuline, HBIG) có khả năng gây miễn dịch thụ động giúp ngăn
chặn viêm nhiễm cấp tính và mạn tính nếu chúng ta sử dụng HBIG ngay trong vòng 7 ngày sau phơi
nhiễm (liều người trưởng thành là 0,06ml/kg trọng lượng cơ thể), tiếp sau bằng bắt đầu hàng loạt mũi
vaccin HBV. Hiện nay, cách tiếp cận này được khuyến khích đối với những người đã nhiễm chất liệu ô
nhiễm kháng nguyên bề mặt viêm gan B qua niêm mạc hoặc qua vết xước ở da và cho những người có
quan hệ tình dục với những bệnh nhân nhiễm HBV. HBIG cũng có khả năng bảo vệ bệnh nhân khỏi
tình trạng tái nhiễm HBV sau quá trình cấy ghép gan. HBIG cũng được chỉ định cho những trẻ sơ sinh
của những bà mẹ mang HBsAg dương tính [16]. Các kết quả từ việc sử dụng HBIG dự phòng cho
những trẻ em có nguy cơ cao nhiễm VRVGB khá tốt nếu globulin miễn dịch được cho sớm sau sinh
ngay khi có thể, hoặc trong vòng 12 giờ sau sinh và nguy cơ đứa trẻ phát triển tình trạng mang virus
tồn tại được giảm độ 70% [6].
Miễn dịch chủ động: Miễn dịch chủ động có khả năng tạo miễn dịch cao. Vaccine VGB có thể
được sản xuất từ huyết tương của người mang HBsAg dương tính hoặc bằng phương pháp tái tổ hợp sử
dụng động vật có vú hoặc nấm men mang plasmid có chứa HBs hoặc chứa gen preS1 và preS2.
Gần đây, các nghiên cứu dùng kết hợp tiêm chủng chủ động và thụ động cho thấy hiệu quả lên tới
90%. HBIG cùng với vacxin được khuyến cáo dùng trong tất cả các trường hợp như thế nhất là đứa trẻ
của bà mẹ mang HBsAg (+) [6].
 Điều trị
Theo thông tin đăng trên tờ Informed (phát hành ngày 13/09/2001) của Tổ chức VGB phi lợi
nhuận (Mỹ), các hợp chất đã và đang phát triển trong điều trị VGB gồm: Interferon (INF), các chất
tương tự nucleotide, thuốc kháng virus không nucleotide, thuốc tăng cường miễn dịch không INF.

Interferon
Interferon là một họ các protein tự nhiên, có hoạt tính chống virus và kích thích hoạt động của hệ
miễn dịch. Điều trị VGB mạn bằng INF-α, được FDA cho phép từ năm 1991 đã là phương tiện điều trị
đầu tiên với các thuận lợi như sau: liệu trình điều trị tương đối ngắn (4 đến 6 tháng); làm chuyển huyết
thanh HBeAg lâu dài trong 30-40% bệnh nhân người lớn nhiễm virus mạn (gấp đôi nhóm chứng) trong
thời gian theo dõi 50 tháng; về lâu dài sẽ có từ 19-57% mất HBsAg ở những người đáp ứng; các chỉ số
mạnh nhất đối với đáp ứng điều trị là ALT > 150U/L, HBV DNA < 200pg/ml, thời gian nhiễm virus
ngắn; và cuối cùng INF làm thay đổi hậu quả xấu của bệnh gan mạn. Tuy nhiên, các kết quả trên là của
bệnh nhân da trắng VGB mạn có nhiều đặc thù rất khác biệt với bệnh nhân người châu Á. INF cũng có
những bất lợi sau: chỉ dùng được ở một số bệnh nhân (INF có tác dụng thấp trên bệnh nhân nhiễm virus
chu sinh, ALT thấp, bệnh nhân có biến dị HBeAg (-)); dung nạp kém (thường có các tác dụng phụ gây
khó chịu, đôi khi có tác dụng phụ nguy hiểm, làm nặng hơn tình trạng xơ gan, VGB mất bù); bệnh
nhân khó chấp nhận do thuốc cần phải tiêm và đắt tiền.
Chính vì thế, nhiều nhà khoa học cố gắng tìm các liệu pháp thay thế. Nhiều tác nhân tương tự
nucleotide có hoạt tính kháng virus mạnh không độc đang là các liệu pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các
bệnh nhân vì lý do nào đó không dùng INF để điều trị VGB mạn [6].
Thuốc tăng cường miễn dịch không INF
Tăng cường các tế bào miễn dịch chống nhiễm tế bào T và sản xuất INF tự nhiên trong cơ thể.
Bao gồm: Theradigm, Thymosin α-1 (Zadaxin), vacxin HBV DNA, vacxin preS1-S2, Hepagen,
EHT899, HBV antigen, BayHep B, Nabi-HB, Anti-Hepatitis B [6].

Thuốc kháng virus không nucleotide gồm: XTL-001 (kháng thể đơn dòng người) và IminoSugar
hay Nonyl-DNJ (ức chế tạo nếp protein) [6].

Các chất tương tự như Nucleoside
Nucleoside là thành phần cấu tạo chủ yếu của các chuỗi RNA và DNA. Những chất tương tự
nucleoside là những chất đồng phân có cấu trúc hóa học tương tự như nucleoside tự nhiên và chính vì
thế, có thể tham dự vào một số quá trình liên quan đến nucleoside. Phần lớn các cấu trúc nucleoside tự
nhiên đều là có dạng đồng phân quang học quay phải, trong khi các chất tương tự nucleoside có dạng
đồng phân quang học quay trái có hoạt tính mạnh nhưng lại rất ít độc tính.
Các chất tương tự nucleotide sử dụng điều trị cho bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chia làm 3
nhóm:
 Nhóm I: L-Nucleotide gồm lamivudine (3TC), emtricitabine (FTC), telbivudine (L-dT) và
clevudine (L-FMAU).
 Nhóm II: acyclic phosphonate gồm adefovir (PMEA), tenofovir (PMPA) và cidofovir
(HPMPC).
 Nhóm III: cyclopentane (pentene) ring gồm entercavir và abacavir (carbovir).
Các chất tương tự như nucleodide phải trải qua quá trình phosphoryl hóa và sau đó vào trong phân
tử DNA của virus, ức chế polymerase bằng cách cạnh tranh trực tiếp với chất nền tự nhiên
(Deoxyademosine triphosphate) và làm kết thúc chuỗi DNA của virus. Các nucleotide liên kết với nhau
qua cầu nối phosphodiester được thành lập giữa nhóm 3’-hydroxyl trên phân tử đường và nhóm 5’-

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×