Tải bản đầy đủ

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: "ĐIỀU TRA, NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT VÀ KHÁNG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ TỪ XẠ KHUẨN" pot

ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
========000========
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN
ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA
Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật
và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn
Mã số: QG. 09. 48
Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học









Hà Nội, năm 2011


1

MỤC LỤC
PHẦN I. BÁO CÁO TÓM TẮT 3
Bằng tiếng Việt 3
Bằng tiếng Anh 8
PHẦN II. BÁO CÁO TỔNG KẾT 12
Giải thích chữ viết tắt 13
Danh sách những người tham gia thực hiện ñề tài 13
Danh mục các bảng và hình 14
MỞ ðẦU 15
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16
1.1 Kháng sinh 16
1.1.1. Khái niệm chung 16
1.1.2. Lịch sử phát triển kháng sinh 16
1.1.3. Phân loại kháng sinh 18
1.1.4. Kháng sinh kháng khối u 21
1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 21
1.2 Xạ khuẩn 22
1.2.1. Các ñặc ñiểm chung 22
1.2.2. Xạ khuẩn và các chất thứ sinh 23
1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam 23
1.4 Nội dung và mục ñích của nghiên cứu 24
CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Nguyên vật liệu 25
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 25
2.1.2. Hóa chất 25
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 25
2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 25
2.2.2. Các vi sinh vật kiểm ñịnh 26
2.2.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 27
2.2.4. Chiết bằng ethyl-acetate 28
2.2.5. Sắc ký các chất chiết thu ñược 28
2.2.6. Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline 29
2.2.7. Phép thử ñộc tế bào 30

2

2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30


CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở
Vườn Quốc gia Cát Bà 32
3.2. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 33
3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 35
3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36
3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) 36
3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 38
3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 42
3.5.1. ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces 42
3.5.2. Giải trình tự rDNA 16S ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44
3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 45
3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 46
3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào 46
3.7.2. Phân tích HPLC dịch nuôi chiết trong ethyl acetate
của các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC 62

3

PHẦN I. BÁO CÁO TÓM TẮT

1. Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh
vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn
2. Mã số: QG.09.48
3. Thời gian thực hiện: 2 năm (2009 - 2011)
4. Cấp quản lý: ðại học Quốc gia Hà nội
5. Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ðHQGHN
ðiện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn
6. Cán bộ tham gia: - TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
- TS. ðinh Thúy Hằng
- CN. Lê Phương Chung
- ThS. Phan Thị Hà
- CN. Lê Hồng Anh
7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ
khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo
Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do
các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.
Cụ thể là:
- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh
giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng
- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao
- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược
- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng
(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải
trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.

4

- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của chất chiết từ dịch
nuôi của một số chủng có tiềm năng
- Phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính kháng tế bào
ung thư làm cơ sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.
8. Các kết quả ñạt ñược
8.1. Kết quả về mặt khoa học
-
424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu
thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại (bằng quan sát hình thái kết hợp với ñọc
trình tự gene rDNA 16S) cho thấy gần 70% thuộc chi Streptomyces, còn lại thuộc
nhóm xạ khuẩn hiếm. Các chi xạ khuẩn hiếm có tỷ lệ cao trong bộ sưu tập này là
Micromonospora (hơn 7% trong tổng số 424 chủng), Nonomuraea (4%) và Nocardia
(gần 3%).
-
424 chủng xạ khuẩn này ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm
ñịnh ñại diện cho 3 nhóm vi sinh vật lớn là vi khuẩn (Gram âm: Escherichia coli,
Gram dương: Micrococcus luteus), nấm men (Candida albicans) và nấm sợi
(Fusarium oxysporium).
-
115 chủng trong số 424 chủng nói trên ñã biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong
bốn vi sinh vật kiểm ñịnh.
-
Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh
vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)
kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427
và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh. Xét về ñối tượng bị kháng thì 14
chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn
Gram dương (M. luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng
có hoạt tính kháng nấm sợi (F. oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm
men (C. albicans). Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh
vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. ðiều thú vị là 17 chủng
này chỉ thuộc 2 chi Streptomyces (10 chủng) và Nonomuraea (7 chủng).
-
17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate
ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate
(từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444).

5

So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng
A396).
-
Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích
sắc ký bản mỏng (TLC) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,
erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16). Số băng
thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232,
A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ
có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390,
A1022) cho phổ 4 băng. So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi
của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi
chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có
băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin. So với dịch nuôi của
chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần
với ñối chứng này.
-
Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược ñược tiếp tục phân tích
qua sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng
sinh chuẩn. Kết quả cho thấy ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ
chloramphenicol, tất cả các mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các
kháng sinh ñối chứng.
-
Một trong những nghiên cứu nữa ñược thực hiện với 17 chủng chọn lọc ñược là thực
hiện thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc pH. ðây là phép thử ñặc hiệu ñối với các
chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Qua ñó nhận thấy có hai chủng có
biểu hiện dương tính với phép thử này là A1018 và A1073.
-
Như vậy với các bước nghiên cứu liên quan, từ 17 chủng có hoạt tính kháng sinh
tương ñối cao, 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư
người là A1018 (có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng),
A1022 (có phổ TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH).
-
Bằng thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim,
các hợp chất chiết từ dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác
dụng dương tính với cả ba dòng tế bào ung thư. So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây
chết 50% tế bào ung thư, tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn)
thì thấy trong ba mẫu nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số
này thấp nhất và thấp gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng

6

diệt tế bào) của phép thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp
hơn ñáng kể so với hai chủng còn lại. ðây là một trong những kết quả nổi bật nhất của
ñề tài, làm tiền ñề cho các hướng nghiên cứu tiếp theo.
-
Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư
nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng
tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử,
Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka. Qua phân tích kết
quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ
chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau. Các dữ
liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói
trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó. ðây là một kết quả thể hiện sự hợp tác
quốc tế của ñề tài.
8.2. Kết quả ñào tạo
ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc
chương trình ñào tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là:
“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam”. Học viên Nguyễn Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả
xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng 2 năm 2011.
8.3. Bài báo
Kết quả của ñề tài ñã ñược ñúc kết thành 02 bài báo:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng).

Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở
vườn Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội
(ñã nhận ñăng).

9. Tình hình sử dụng kinh phí
- Tổng kinh phí của ñề tài ñược duyệt: 100.000.000 VNð
- Tổng kinh phí của ñề tài ñã quyết toán: 100.011.400 VNð, bao gồm các mục:
+ Chi phí thuê mướn: 40.000.000
+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 49.084.000
+ Photo tài liệu, văn phòng phẩm: 4.235.000

7

+ Hội họp: 1.500.000
+ Thông tin liên lạc: 442.000
+ Chi khác (lệ phí của ñơn vị DT): 4.750.000

Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài




Xác nhận của ðại học Quốc gia

8

SUMMARY
1. Project title:
Investigation and study some substances which have antibiotic
activities against microorganisms and cancer cell lines from
actinomycetes

2. Code: QG.09.48
3. Duration: 2009 – 2011
4. Organizer: Institute of Microbiology and Biotechnology,
Vietnam National University, Hanoi (VNUH)
5. Project leader: Dr. Nguyen Huynh Minh Quyen
6. Key participants:
Dr. Nguyễn Quỳnh Uyển
Dr. ðinh Thúy Hằng
BSc. Lê Phương Chung
MSc. Phan Thị Hà
BSc. Lê Hồng Anh
7. Objectives and study contents
Objective:
This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from
actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam,
named Catba National Park. The antibiotics produced by these strains were studied
further in order to find out their nature.
Study contents:
• Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai
Phong) and then evaluating their biodiversity
• Screening the strains possessing high antibiotic activities
• Primary extracting the antibiotics from these strains
• Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography
(TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC)
• Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use
their morphology and the sequences of 16S rDNA gene
• Testing cytotoxic activity of some potential strains
• HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer
agents to obtain data base in order to study their nature.
8. The obtained results

9

• 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter
samples, were collected at Cat Ba island and then were classified. As the result
through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the
genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest.
Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea
appeared about 4% and Nocardia was 3% in total.
• 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested
microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli;
Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi
(Fusarium oxysporium).
• Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at
least one of the 4 testes microrganisms.
• Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all
of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041,
A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410,
A427 và A444) against 2 testes microrganisms. Regarding the tested
microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium
(E. coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M.
luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown
activity against fungi (F. oxysporium) and just only 6 strains were shown activity
against yeast (C. albicans). In general, 17 strains in total possessing activity
against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study.
Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains)
and Nonomuraea (7 strains).
• 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were
extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds. The yeild of
extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was
variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444). In comparison with
their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154)
to 14,89% (strains A396).
• The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete
strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile
with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin,

10

erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing
anthracycline (A16). The bands obtained after chromatography were varied from 1
to 4 bands. 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were
shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45,
A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands. In
comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the
cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol;
substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were
shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar
to the bands of antibiotic kitasamycin. In comparison with cultured broth of control
strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the
chromatography profile very close with this of the control.
• The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by
high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that
of the standard antibiotics. Except strain A396, which was shown the peak similar
to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection
with the control antibiotics.
• Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the
enviromental pH. This is a specific test for strains producing antibiotic of group
anthracycline. Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this
test.
• 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour
based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is
similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with
relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human
cancer cell lines. Crude extracts of three strains above exhibited significant
cytotoxic activity against hepatocellular carcinoma, lung cancer, and
rhabdosarcoma human cell lines.
• By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human
cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains
exhibited positive results against all of these cell lines. By the comparison of IC50
value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which
means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance

11

extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very
close to that of the positive control of this test. This value is also as low as that of
the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with
the rest of the two strains. This is one of the outstanding results of the project and
this provides the base to develop further research.
• Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were
analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at
Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka
University. HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains
A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks
and 6 peaks, respectively. Their data base is going to compare with that available
at this Lab in order to find out the nature of these substances. This is one of
international collaboration of the project.
9.1. Education results
The project contributes to educating 01 Master student, field Biotechnology,
belonged to international program jointed with University of Liege, Belgium. The
dissertation is: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from
Catba island, Vietnam”. The master students Nguyễn Phương Chung did defend
successfully on Feb 24
th
, 2011.
9.2. Publication:
All of the results above resulted in 02 publications:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. Journal of Biotechnology (accepted).
• Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà
National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam
National Unversity, Hanoi (accepted).
Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài



Xác nhận của ðại học Quốc gia


12













PHẦN II. BÁO CÁO TỔNG KẾT

13

GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
HPLC: High-performance liquid chromatography
rDNA 16 S: gene 16S của DNA ribosome
TE: ñệm có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0
TLC: Thin layer Chromatography
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ðỀ TÀI
1. Chủ trì: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
2. Những người thực hiện:
- TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
- TS. ðinh Thúy Hằng
- CN. Lê Phương Chung
- ThS. Phan Thị Hà
- CN. Lê Hồng Anh

14

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Danh mục bảng
Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1 ðiều kiện phân tích HPLC của các chất chuẩn
Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Bảng 3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Bảng 3.4. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn lọc
ñược
Bảng 3.5. Các ñặc ñiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces
Bảng 3.6. Kết quả xác ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào
Bảng 3.7. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ 3 chủng có hoạt tính gây ñộc
tế bào ung thư
Danh mục hình
Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm
Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA)
Hình 3.1. ðánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn
Hình 3.2. Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Hình 3.3. Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ chủng A396 (B)
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces
Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces
Hình 3.6. Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trí của 7 chủng xạ
khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea
Hình 3.7. Sự thay ñổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073
Hình 3.8. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018
Hình 3.9. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022
Hình 3.10. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073

15

MỞ ðẦU
Sức khỏe luôn là một trong những vấn ñề ñược chú trọng nhất trong mỗi quốc gia.
Mặc dù các thành tựu có ñược trong ngành hoá dược ñã ñem lại sự phong phú về chủng
loại dược phẩm, nhưng việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các sản phẩm tự nhiên có hoạt
tính sinh học trong việc chữa trị các bệnh nan y vẫn luôn là hướng ñược quan tâm hiện
nay. Trong một tổng kết về các loại dược phẩm hiện ñang lưu hành trên thế giới, Newman
và cộng sự (2003) ñã cho biết từ năm 1981 ñến năm 2002 trong tổng số 868 loại thuốc
ñược phép ñưa vào sử dụng thì có ñến 58% là có nguồn gốc tự nhiên. ðặc biệt con số này
là 62% ñối với thuốc dùng trong ñiều trị bệnh ung thư.
Với nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú và ña dạng, Việt nam có cơ sở ñể phát
triển ngành công nghệ sinh học theo hướng ứng dụng y-dược này. ðây cũng là một bài
toán ñặt ra cho ngành dược nước nhà trước tình hình thuốc nhập ngoại chiếm vị trí áp ñảo
trên thị trường và trong các bệnh viện lớn. ðể cung cấp nguồn nguyên liệu hỗ trợ cho
ngành dược, các nghiên cứu về ñặc tính sinh học từ vi sinh vật có tác dụng chữa trị bệnh
cần phải ñược chú trọng, nhằm tạo tiền ñề cho việc phát triển dược phẩm mới với tính
năng ñiều trị cao và ít tác dụng phụ không mong muốn. Sự suy thoái môi trường sống ở
Việt nam hiện nay là nguyên nhân dẫn ñến ña dạng hoá các tác nhân gây bệnh. Các bệnh
viêm nhiễm và bệnh ung thư hiện ñang là ñối tượng cần thiết ñể các nhà nghiên cứu ñặt
mục tiêu tìm kiếm các chất có công dụng ức chế từ nguồn vi sinh vật nội ñịa.
Thay ñổi khí hậu, ô nhiễm môi trường sống là những yếu tố gây tác ñộng trực tiếp
ñến sức khỏe của con người. Theo dự báo toàn cầu, tại một số vùng trên thế giới, trong ñó
có Việt nam, tỷ lệ người mắc bệnh viêm nhiễm thông thường hay các bệnh nguy hiểm
như ung thư, tim mạch ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998).
Do vậy, việc nghiên cứu ñể tìm kiếm các chất có hoạt tính chữa trị bệnh từ các nguồn gốc
tự nhiên là một trong những hướng nghiên cứu trọng tâm của ngành công nghệ sinh học
tại nhiều quốc gia, ñặc biệt ở các nước phát triển. ðể nắm bắt ñược những kỹ thuật tiên
tiến trong lĩnh vực này và từng bước hoà nhập với sự phát triển chung, ñồng thời ñể ñáp
ứng nhu cầu trong việc bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng, Việt nam cần chú trọng khai thác
nguồn ña dạng vi sinh vật của mình làm nguyên liệu ñể phát triển dược phẩm. Vì lẽ ñó
chúng tôi ñã ñề xuất và ñã ñược ðại học quốc gia Hà Nội phê duyệt thực hiện ñề tài:
“ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng
tế bào ung thư từ xạ khuẩn”


16

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. 1 Kháng sinh
1.1.1. Khái niệm chung
Theo ñịnh nghĩa truyền thống thì kháng sinh (còn ñược gọi là trụ sinh) là những
chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách ñặc
hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp ñộ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi
khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Theo ñịnh nghĩa hiện
nay, kháng sinh ñược hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và ở nồng ñộ
thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt (các) vi sinh vật khác (Nduka,
2007).
Hiện nay các chất có hoạt tính sinh học có khả năng diệt khuẩn gồm các chất
kháng sinh truyền thống, các sản phẩm trao ñổi chất như các acid lactic do các vi khuẩn
lactic sinh ra, các chất phân giải như lysozyme, các loại ngoại ñộc tố có bản chất protein,
các bacteriocin…. Các “vũ khí sinh học” này ñược quan tâm ñặc biệt do tính ña dạng và
cả do chúng có nhiều trong tự nhiên (Margaret & Milind, 2007).
Thực, ñộng vật bậc cao cũng có khả năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các hợp chất
này nằm ngoài ñịnh nghĩa nói trên. Tương tự như vậy, mặc dù cũng do vi sinh vật sinh ra
nhưng bacteriocin cũng không ñược coi là kháng sinh không chỉ vì chúng có khối lượng
phân tử không lớn như các chất kháng sinh thông thường khác mà còn do chúng chủ yếu
ảnh hưởng ñến các vi sinh vật gần với vi sinh vật sản sinh ra bacteriocin. So với
bacteriocin, các chất kháng sinh ña dạng về bản chất hóa học và tấn công các vi sinh vật
không có quan hệ họ hàng. ðiểm khác biệt quan trọng nữa là trong khi thông tin di truyền
của các chất kháng sinh thường nằm trên một vài gen thì bacteriocin chỉ cần gen ñơn.
(Nduka, 2007). ðến nay ñã có khoảng 16.500 kháng sinh ñược phát hiện từ vi sinh vật, và
hàng năm hàng chục kháng sinh mới ñược phát hiện (Hopwood, 2007).
1.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh
Kháng sinh là thuốc ñược con người dùng chủ yếu ñể chống các bệnh truyền
nhiễm. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần rất lớn trong các bệnh của con người và ñộng
vật. Cho ñến nửa sau của thế kỷ 19 người ta ñã phát hiện ra rằng vi sinh vật chính là thủ
phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. Do ñó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi
sinh vật gây bệnh ñã ñược phát triển thành liệu pháp ñiều trị chính.

17

Vào năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh này ñã ñược dùng
trong ñiều trị vào những năm 1940. Ngay sau ñó penicillin ñã trở thành một kháng sinh
nổi tiềng vì ñã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới II (Saga &
Yamaguchi, 2008).
Từ những năm 1940 ñến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới ñược xác
ñịnh hầu hết từ xạ khuẩn, và ñó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh
(Hình 1.1).

Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007).
Năm 1944, streptomycin ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất Streptomyces griseus. Sau
ñó ñến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc nhóm macrolide và
glycopeptide (tức vancomycin) ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất. Các kháng sinh tổng hợp
như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất quinolone ñã ñược tạo ra vào năm
1962. Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu ñược phổ kháng vi sinh vật rộng
hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn ví dụ như các kháng sinh β-lactam. Lớp β-lactam
gồm penicillin, cephem, carbapenem và monobactam. Penicillin ban ñầu có tác dụng hiệu
quả lên vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus. Sau ñó, S. aureus sinh ra các
enzyme phân giải penicillin- penicillinase, nên người ta phát triển methicillin. Bên cạnh
ñó, ñể mở rộng phổ tác dụng của ampicillin (là kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm
Enterobacteriaceae) người ta ñã phát triển ñược piperacillin có thể kháng ñược cả
Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2).

18


Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G (Saga et al, 2008)
Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong ñiều trị ở thế kỷ 20 ñã
làm giảm ñáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ 1980 số kháng sinh mới ñược
ñưa vào ñiều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày
càng lớn. Bên cạnh ñó, một hiện trạng ñáng báo ñộng là ngày càng tăng các vi sinh vật
gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải ñược
khắc phục bằng việc phát hiện ra các thuốc mới. Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng
nhanh kháng thuốc và tốc ñộ ñó lại nhanh hơn tốc ñộ tạo ñược thuốc mới của con người.
Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào ñể vượt qua tính kháng thuốc
kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới có các cơ chế hoạt ñộng khác nhau
(Fred, 2006).
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Có một số phương pháp phân loại kháng sinh. Một trong những phương pháp ñó là
dựa vào kiểu hoạt ñộng tức là kháng sinh ñó tác ñộng lên vách tế bào, kìm hãm protein…
Tuy nhiên có khi một kháng sinh lại có nhiều cơ chế ñồng thời cùng tác ñộng nên cách
phân loại này khó áp dụng. Một số trường hợp kháng sinh ñược phân loại dựa trên vi sinh
vật sản sinh ra kháng sinh ñó. Nhưng khi ñó có trường hợp một vi sinh vật có thể sinh ra
một số kháng sinh như Streptomyces sp. có thể sinh penicillin N và cephalosporin. Ngược
lại một kháng sinh cũng có thể do nhiều vi sinh vật sinh ra. Kháng sinh cũng ñã ñược
phân loại dựa theo con ñường sinh tổng hợp. Phổ tác ñộng cũng ñược dung, ví dụ như tác

19

ñộng lên vi khuẩn, nấm, nguyên sinh ñộng vật… Tuy nhiên một loại/nhóm kháng sinh
như aminoglycoside lại có thể có phổ tác dụng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al,
2010).
Cách phân loại nêu dưới ñây là dựa trên cấu trúc hóa học của kháng sinh và theo
ñó kháng sinh ñược phân thành 13 nhóm (Bảng 1.1) (Nduka, 2007).
Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Nhóm hóa học Ví dụ
Aminoglycoside Streptomycin
Ansamacrolide Rifamycin
Beta-lactam Penicillin
Chloramphenicol và các chất tương
tự
Chloramphenicol
Linocosaminide Linocomycin
Macrolide Erythromycin
Nucleoside Puromycin
Puromycin Curamycin
Peptide Neomycin
Phenazine Myxin
Polyene Amphothericin B
Polyether Nigericin
Tetracycline Tetracycline
Như ñã ñề cập ở trên có nhiều cách phân loại kháng sinh và không có cách nào
thỏa mãn toàn bộ các yêu cầu về phân loại. Do vậy, cách phân loại dựa trên cấu trúc hóa
học nêu ở ñây cũng chỉ mang tính chất tương ñối và các ví dụ nêu ra là ñể dễ dàng nhận
biết nhóm có kháng sinh ñó mà thôi. Sau ñây là một số nhóm kháng sinh thông dụng:
a. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ñường amino ñược liên kết bằng
liên kết glycoside. Streptomycin và gentamicin là các ví dụ ñiển hình của nhóm này.
Streptomycin vẫn còn là thuốc thay thế trong ñiều trị bệnh lao, nhưng do sự phát triển tính
kháng thuốc nhanh chóng và các ảnh hưởng ñộc hại nghiêm trọng ñã làm hạn chế việc sử
dụng kháng sinh này. Các aminoglycoside kìm hãm tổng hợp protein ở nhiều vi khuẩn
Gram âm và một số vi khẩn Gram dương. ðôi khi chúng ñược dùng kết hợp với penicillin.

20

Thành viên của nhóm này thường có xu hướng ñộc hơn các nhóm kháng sinh khác
(Tortora et al, 2010).
b. Beta-lactam là các kháng sinh ñã ñược sử dụng rất nhiều và rất quan trọng trong ñiều
trị như penicillin, cephalosphorin cũng như các loại tương ñối mới như cephamycin,
nocardicin, thienamycin và clavulanic acid (Nduka, 2007).
Penicillin là chất diệt khuẩn, kìm hãm sự tạo thành vách tế bào. Có 4 loại penicillin:
penicillin-G phổ hẹp, ampicillin và các chất tương tự, các penicillin kháng penicillinase
và các penicillin phổ rộng có thể kháng các vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas. Các
penicillin-G kháng hiệu quả các chủng Gram dương như Streptococcus, Staphylococcus,
và một số vi khuẩn Gram âm như Meningococcus. Penicillin-G ñược dùng ñể ñiều trị các
bệnh như giang mai, lậu, viêm màng não, lao và bệnh ghẻ cóc (yaws). Penicillin V có
hoạt ñộng tương tự nhưng hiệu lực thấp hơn. Ampicillin và amoxicillin có tác dụng tương
tự penicillin-G nhưng có phổ tác dụng rộng hơn bao gồm cả một số vi khuẩn Gram âm
(Tortora et al, 2010).
c. Chloramphenicol kìm hãm sự sinh trưởng của nhiều vi khuẩn Gram dương và âm,
ñây là kháng sinh phổ rộng ñầu tiên ñược sử dụng trong ñiều trị. Chloramphenicol ñược
sản xuất từ nuôi cấy vi khuẩn ñất Streptomyces venezuelae. Chloramphenicol kìm hãm
sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gây nhiễu hoạt tính xúc tác của peptidyl-
transferase của ribosome trong pha kéo dài của phiên mã. Do phân tử lượng thấp, kháng
sinh này có thể thâm nhập vào nhiều vùng của cơ thể mà các loại thuốc khác không thể
thâm nhập ñược. Tuy nhiên, chloramphenicol có các ảnh hưởng bất lợi, trong ñó quan
trọng nhất là kìm hãm hoạt ñộng của tủy xương do ñó ảnh hưởng ñến sự tạo thành tế bào
máu (Creighton, 1999; Nduka, 2007).
d. Macrolide là nhóm các kháng sinh ñược ñặt tên do có mặt vòng macrocyclic lactone
trong phân tử. Macrolide ñược dùng nhiều nhất trong ñiều trị là erythromycin. Kiểu hoạt
ñộng của nó là kìm hãm tổng hợp protein. Erythromycin có tác dụng hiệu quả lên các cầu
khuẩn Gram dương và thường ñược dùng ñể thay thế penicillin trong các bệnh nhiễm
Streptococcus và Pneumococcus. Macrolide còn ñược dùng trong ñiều trị bệnh bạch hầu
và nhiễm trùng huyết (bacteremia). Tác dụng phụ của nhóm kháng sinh này có thể gồm
nôn, mửa và tiêu chảy, ñôi khi gây suy giảm thính giác (Nduka, 2007).
e. Tetracycline là nhóm kháng sinh phổ tương ñối gần nhau do Streptomyces spp sinh ra.
Tetracycline ảnh hưởng tới sự gắn tRNA mang amino acid vào ribosome ở tiểu ñơn vị
30S của ribosome 70S do ñó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào chuỗi polypeptide ñang
tổng hợp. Tetracycline là các kháng sinh phổ rộng kháng các Streptococcus, Bacillus

21

Gram âm, rickettsia (gây sốt thương hàn) và Spirochetes (gây bệnh giang mai). Các kháng
sinh này cũng ñược dùng ñể ñiều trị nhiễm trùng ñường tiết niệu và viêm cuống phổi.
Nhờ phổ tác dụng rộng, tetracycline ñôi khi làm thay ñổi cân bằng hệ vi khuẩn nội sinh
thông thường ñược duy trì/kiểm soát bởi hệ miễn dịch của cơ thể, dẫn ñến việc nhiễm
khuẩn thứ cấp ví dụ như ở hệ tiêu hóa hay âm ñạo. Việc sử dụng tetracycline hiện nay còn
bị hạn chế do sự tăng tính kháng của các chủng vi khuẩn (Nduka, 2007).
1.1.4 Kháng sinh kháng ung thư (Anti-tumor antibiotics)
Ở sinh vật bậc cao mỗi tế bào có chức năng nhất ñịnh ñược thực hiện trong mối
tương tác/liên hệ với các tế bào khác. ðôi khi, tế bào mất liên hệ với các tế bào xung
quanh và phân chia một cách không ngừng ñể tạo thành cấu trúc gọi là khối u hay ung thư.
Ung thư ñược ñiều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp gồm phẫu
thuật ñể loại bỏ khối u, chiếu xạ ñể phá hủy chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hóa trị.
Nhiều chất hóa học dùng trong hóa trị liệu ung thư là các sản phẩm thứ cấp do vi sinh vật
sinh ra do ñó ñược gọi là kháng sinh chống/kháng khối u (Nduka, 2007; Carlos et al,
2009). Một số nhóm kháng sinh ñã ñược dùng trong ñiều trị ung thư có thể kể ñến là
anthracycline, actinomycin và bleomycin.
Anthracycline ñược sử dụng rộng rãi trong ñiều trị ung thư như ung thư máu, ung
thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư
vú, ung thư bàng quang (Gewirtz, 1999). Một số
chủng ñược cho là sinh anthracycline là
Streptomyces coeruleorubidus hoặc
Streptomyces peucetius. Nhóm kháng sinh này
cho ñến nay ñược ghi nhận gồm daunorubicin
(DNR), doxorubicin, epirubicin và idarumycin
(IDA) (Hình. 1.3). Daunorubicin và adriamycin
gắn vào các cặp base do ñó kìm hãm tổng hợp
RNA và DNA. Mithramycin và chromomycin
A3 (là các actinomycin), kìm hãm tổng hợp
RNA phụ thuộc DNA. Bleomycin tương tác và
làm ñứt gãy DNA (Nduka, 2007; Carlos et al,
2009).
1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới
Một trong các thành tựu của y học hiện
ñại là phát triển các chất kháng sinh và các chất
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của
daunorumycin (DNR) và
idarumycin (IDA)

22

kháng vi sinh vật khác. Tuy nhiên, rõ ràng là các vi sinh vật ñã và ñang phát triển tính
kháng với các kháng sinh hiện có bằng các ñột biến mới hoặc thay ñổi thông tin di truyền
(Arnold et al, 2009). Cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi
khuẩn kháng thuốc, ñặc biệt là các hợp chất chống khối u và vật ký sinh (anti-parasitic).
Tuy nhiên việc tìm kiếm các kháng sinh chống ung thư khó hơn nhiều so với các chất
kháng khuẩn hay kháng nấm về mặt phương pháp và biểu hiện (interpretation) (Nduka,
2007). Hơn nữa còn cần các kháng sinh mới cho nông nghiệp ñể làm thuốc chữa bệnh cho
cây trồng và vật nuôi vì các bệnh ñó sẽ ảnh hưởng ñến con người thông qua chuỗi thức ăn.
1.2 Xạ khuẩn
1.2.1 Các ñặc ñiểm chung
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất ña dạng trong ñó ña số sinh trưởng hiếu khí
và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn –actinomycete- bắt nguồn từ
tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban ñầu xạ khuẩn ñược coi là nấm nhỏ vì
chúng sinh trưởng giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở
cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất
(Ashutosh, 2008). ða số xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử rất khác nhau về hình dạng và kích
thước. ðây là một trong những ñặc ñiểm ñể phân loại.
Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. ða số xạ
khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong ñất, nước và xác thực vật. Xạ khuẩn
ñóng vai trò về mặt sinh thái quan trọng trong vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy
và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong ñất. Nhiều chủng xạ
khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan ñến lignin bằng
cách sinh các enzyme thủy phân cellulose và hemicellulose và các peroxidase ngoại bào
(Pasti et al., 1990; Mason et al., 2001). Các chủng xạ khuẩn cũng xuất hiện trong môi
trường giàu hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt
(thermophilic) (Steger, 2006), và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa
mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn ñịnh, ñặc trưng (Seong
et al., 1999, Goodfellow et al., 1996).
Nhìn chung, nhiệt ñộ ôn hòa 25-30°C và pH trung tính là các ñiều kiện tối ưu cho
xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài ñã ñược phân lập ở các môi trường khắc
nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh ñược phân lập từ trầm tích hồ ở Nam
cực có thể sống ở nhiệt ñộ 0°C (Chen et al., 2005) và Nocardiopsis alkaliphila ñược phân
lập từ ñất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9.5-10 (Hozzein et al., 2004).

23

Về mặt phân loại, lớp xạ khuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong ñó bộ ñược nhắc ñến
nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales. Bộ Actinomycetales
có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi (http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria).
Xạ khuẩn thường ñược chia thành hai loại: Streptomyces và không phải
Streptomyces (non-Streptomyces). Chi xạ khuẩn ñược biết nhiều nhất là Streptomyces, với
khoảng 500 loài, tất cả ñều có GC cao (69–73 %) trong DNA. Streptomyces ñặc biệt
nhiều trong ñất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều phức các chất hữu cơ bằng các
enzyme ngoại bào. Thực tế, mùi mốc ñặc trưng của nhiều loại ñất liên quan ñến sự sản
sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi gọi là geosmin
(http://science.howstuffworks.com/question479.htm). Một phần rất lớn các chất kháng
sinh ñược sự dụng hiệu quả trong ñiều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces trong ñó
ñược biết ñến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và tetracycline (Stuart, 2005).
1.2.2 Xạ khuẩn và các chất thứ sinh
Xạ khuẩn ñược ñặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứ sinh có
giá trị ứng dụng cao. Trong các hợp chất tự nhiên do vi sinh vật sinh ra ñã ñược công bố
sử dụng trên toàn thế giới thì 45% ñược sinh ra từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ vi
khuẩn ñơn bào (Arnold et al, 2009). Hai phần ba kháng sinh ñã biết ñược sinh ra bởi xạ
khuẩn chủ yếu từ các loài Streptomyces (Miyadoh, 1997). Các hợp chất kháng sinh khác
nhau của xạ khuẩn ñã ñược nghiên cứu ñặc ñiểm gồm aminoglycoside, anthracyclin,
glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide,
actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1988). Các hợp chất này ñã ñược sử dụng
thành công làm thuốc giệt cỏ, thuốc chống ung thư, thuốc, các chất ñiều hòa miễn dịch và
các chất chống ký sinh trùng (Thomson et al, 1995).
1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam
Ở Việt Nam xạ khuẩn ñã ñược quan tâm nghiên cứu khá nhiều trong ñó các nghiên
cứu tập trung vào ñặc ñiểm sinh học (Biền Văn Minh, 2000-2004), tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Hy, 1994…), khả năng sinh kháng sinh kháng các vi
sinh vật gây bệnh thực vật (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm ñạo ôn, nấm thối cổ
rễ…) (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 1992, 1994, 2005), kháng vi sinh vật
gây nhiễm trùng bệnh viện (Nguyễn Phú Hùng và cs, 2009). Ngoài ra còn có công trình
nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng
sinh của xạ khuẩn (Vi Thị ðoan Chính, 2000), hay sản xuất kháng sinh b-lactam (Lê Gia
Hy và Phạm Thị Bích Hợp, 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số xạ

24

khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs., 1998), nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs,
2005).
Cho ñến nay chưa thấy công trình nào ñề cập ñến kháng sinh kháng ung thư có
nguồn gốc từ xạ khuẩn ở Việt Nam.
1.4. Nội dung và mục ñích của nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ
khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo
Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do
các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.
Cụ thể là:
- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh
giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng
- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao
- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược
- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng
(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải
trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.
- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của dịch chiết từ dịch
nuôi của một số chủng có tiềm năng
- Phân tích HPLC chất chiết từ các chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư làm cơ
sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×