Tải bản đầy đủ

Luận văn: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG TRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN potx

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM







ĐINH THỊ NGỌC








NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC








Thái Nguyên - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM





ĐINH THỊ NGỌC




NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN


CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC
MÃ SỐ: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS CHU HOÀNG MẬU







Thái Nguyên- 2008

1
MU
1. Lý do chn  tài
u tng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghip ngn ngày, có giá
tr kinh t và hàm lng dinh dng cao. Ht u tng cha 30 % - 56% protein,
cha nhiu loi axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein,
leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) cn thit cho c
th ngi và ng vt. Mt c tính quan trng na ca cây u tng là có nt sn
 r to kh nng cnh nit không khí, vì vy trng u tng góp phn ci to
t và bo v môi trng [20].
Sn xut u tng phát trin mnh ti M, Brazil, Argentina, Trung Quc và
nhiu nc khác. Sn lng u tng trên th gii t hàng trm triu tn/ nm. Trong
khi ó,  Vit Nam sn lng mi cht trm nghìn tn/ nm, u ó chng t tình
hình sn xut u tng  nc ta so vi khu vc vn còn  mc thp.  thúc y sn
xut u tng vn  quan trng là chn to c nhng ging không ch cho nng
sut cao, phm cht tt mà còn phi thích hp vi u kin a hình khí hu.
c ta có h sinh thái rt a dng, khí hu gia các vùng, min li không
ging nhau. a hình có n 3/4 là i núi thng có mùa khô hanh  min Bc, mùa
khô nóng  Tây Nguyên…Nhng nm gn ây din bin khí hu ngày càng phc tp,
ng ma phân b không u gia các vùng và gia các thi k trong nm nên hn
hán và nng nóng kéo dài. u tng là cây tng i mn cm vi u kin ngoi
cnh và thuc vào nhóm cây chu hn kém, công tác chn to các ging u tng có
kiu gen chng chu ngày càngc quan tâm nghiên cu [10], [18], [23].
 Vit Nam, ngun gen ca cây u tng rt a dng và phong phú; ngoài
nhng ging nhp ni, ging li to và ging t bin, còn có tp oàn các ging
a phng. Nhng ging u tng a phng thng có nng sut thp, nhng
li có cht lng ht tt và kh nng chng chu cao vi các u kin bt li ca
ngoi cnh. c tính chu nóng, chu hn ca các ging u tng này ã c
nhiu nhà khoa hc quan tâm nghiên cu [18], [24], [31], [36]. Tuy nhiên, các tác
gi mi ch tp trung nghiên cu các ging u tng trng  các tnh trung du,
2
ng bng và các tnh vùng núi phía Bc, trong khi ngun gen ca cây u tng 
các tnh khu vc Tây Nguyên nc ta cng rt a dng, có nhiu c tính quý còn ít
c quan tâm.
Tây Nguyên là vùng t vi hai mùa rõ rt, mùa ma và mùa khô, mùa khô
thng kéo dài gây thiu nc trm trng dn n nng sut, sn lng cây trng
hàng nm gim mnh trong ó có cây u tng. Vì vy, vic ánh giá, tuyn chn
các ging u tng có nng sut và cht lng, có kh nng chng chu hn cao
làm vt liu chn ging là yêu cu thc tin t ra cho ngành chn ging u tng
 vùng t Cao Nguyên này. T nhng lý do trên chúng tôi ã tin hành  tài:
“Nghiên cu c m hóa sinh và phân lp gen chaperonin liên quan n tính
chu hn ca mt s ging u tng a phng trng  vùng Tây Nguyên”
nhm ánh giá cht lng ht và tìm hiu gen liên quan n kh nng chu hn ca
cây u tng trong iu kin sinh thái  khu vc Tây Nguyên.
2. Mc tiêu nghiên cu
- So sánh cht lng ht ca mt s ging u tng trng ti khu vc Tây Nguyên.
- Nghiên cu kh nng chu hn, c s hóa sinh và phân lp gen liên quan
n kh nng chu hn ca mt s ging u tng trng ti khu vc Tây Nguyên.
3. Ni dung nghiên cu
- Phân tích c m hình thái, khi lng và kích thc ht ca mt s
ging u tng trng ti Tây Nguyên.
- Xác nh hàm lng protein, lipit trong ht ca các ging u tng nghiên cu.
- Phân tích thành phn axit amin trong protein ht ca các ging u tng
- Xác nh hàm lng protein tan, hot  ca proteaza  giai n ht ny mm.
-ánh giá kh nng chu hn ca các ging u tng  giai n cây non
trong iu kin hn nhân to.
- Xác nh hàm lng prolin  giai on cây non 3 lá  thi m trc và sau
khi x lý bi hn.
- Nhân, tách dòng và c trình t gen chaperonin liên quan n tính chu hn
ca mt s ging u tng trng ti Tây Nguyên.
3
Chng 1
NG QUAN TÀI LIU
1.1. CÂY U TNG
1.1.1. c m sinh hc ca cây u tng
u tng có tên khoa hc là Glycine max (L) Merrill, có b nhim sc th
2n = 40, thuc thân tho, hu (Fabaceae), h ph cánh bm (Papilionoidea).
u tng có ngun gc t các tnh phía Bc và ông Bc Trung Quc, các vùng
k cn ca Cng hòa liên bang Nga, Triu Tiên và Nht Bn.Các ging u tng
ang trng ti nc ta c du nhp t Trung Quc t lâu i [13].
V hình thái, cây u tng các b phn chính là r, thân, lá, hoa và qu
Ru tng có r cc gm r cái và r bên, trên b r ca cây u tng có
nhiu nt sn cha vi khun Rhizobium japonicum có kh nng cnh nit t khí
tri cung cp m cho cây, có vai trò ci to t [9].
Thân u tng có hình tròn, thân non có màu xanh hoc tím, khi qu chín
thì thân ng sang màu vàng nâu.
Lá u tng gm 3 loi lá: lá mm, lá n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có
4-5 lá chét).
Hoa mc thành chùm  nách lá, mi chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu trng
hoc tím, hoa u tng t th phn hoàn toàn. Qu có th thng hoc cong có
nhiu lông, mi qu cha t 1-5 ht nhng thông thng là 2-3 ht.
Ht u tng không có ni nh mà ch có mt lp v bao quanh phôi và 2 lá
mm. Ht có hình tròn hoc hình bu dc, tròn dài, tròn dt, v ht u tng có màu
nâu, en, vàng, xanh. Khi lng ht rt a dng t 20-400 mg/ht
n c vào thi gian sinh trng ca cây u tng ngi ta chia làm 3 loi:
Ging chín sm (75-85 ngày), ging chín trung bình (80-100 ngày), và ging chín
mun (110-120 ngày). Thi gian sinh trng là mt yu t quan trng  la chn
cây trng luân canh tng v [28].
4
1.1.2. Giá tr kinh t ca cây u tng
u tng là cây trng có giá tr kinh t cao, là cây công nghip, cây thc
phm, va là cây ci ci to t. Vi u th ngn ngày, trng c nhiu v trong
m, có th trng thun, trng xen, luân canh gi v, trng c nhiu vùng sinh
thái khác nhau, vì vy sau lúa và ngô, cây u tng có mt vai trò c bit quan
trng trong nn nông nghip nhit i.
V mt dinh dng, ht u tng có thành phn dinh dng cao cha 30-
56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là ngun axit amin, vitamin (B1, B2,
C, D, E) rt quan trng i vi i sng ca con ngi. Protein u tng còn có
tác dng hu hiu gim cholesterol trong máu, gim thiu nguy c các bnh liên
quan n tim mch, chúng cng ngn cn s phát trin các mm ung th, ngn nga
bnh thn, bnh tiu ng, bnh xp xng
Trong công nghip, sn phm t cây u tng c s dng rt a dng
nh dùng trc tip ht khô hoc ch bin thành u ph, ép thành du u tng,
làm bánh ko, sa u, nc gii khát, nc chm áp ng nhu cu m trong
khu phn n hàng ngày ca ngi cng nh gia súc.
 nhng quc gia phát trin, ngi ta còn dùng u tng vào các k ngh
khác nh bin ch cao su nhân to, mc in, sn, xà phòng, cht t nhân to, cht
nhiên liu lng, du làm trn trong k ngh hàng không.
Trong trng trt, cây u tng còn có tác dng ci to t, tng nng sut
các cây trng khác. u này có c là do hot ng cnh N
2
ca loài vi khun
Rhizobium cng sinh trên r cây. Nh kh nng cnh m nên sau mi v thu
hoch thành phn hóa tính ca t trng c ci thin rõ rt, lng m trong t
tng và khu h vi sinh vt hiu khí trong t ng tng. Do ó, có li i vi cây
trng khác và sau khi thu hoch toàn b thân lá, r, lá ph li b mt t va có tác
dng che ph chng xói mòn, va là ngun hu c giàu m ci to t.
1.1.3. Tình hình sn xut u tng trên th gii và  Vit Nam
Trên th gii (tính n tháng 4/ 2006), có 78 nc trng u tng vi din
tích là 91,3 triu ha; nng sut 22,9 t/ ha, sn lng t 236,1 triu tn. Các nc
sn xut u tng ng u th gii là: M, Brazil, Argentina và Trung Quc
chim khong 90-95% tng sn lng u tng trên toàn th gii [45].
5
Nh vy, có th thy u tng chim mt v trí quan trng trong nn kinh t
th gii không ch do c gieo trng trên din tích ln  78 nc, mà ht u tng
còn c s dng rng rãi  làm thc phm và nguyên liu cho công nghip.
Bng 1.1. Sn lng u tng ca mt s nc trên th gii niên v 2006 – 2007
(Theo Oil World); n v tính: triu tn
 Vit Nam, trong vòng hn 20 nm qua (t 1985- 2006) din tích, nng
sut và sn lng u tng ã không ngng tng, c bit trong nhng nm gn
ây:  th m 2000 din tích trng u tng là 124100 ha n nm 2005 tng lên
203600 ha, nng sut t t 12000 t/ha nm 2000 lên 14,300 t/ha nm 2005 và
sn lng t 147300 tn nm 2000 lên 290600 tn nm 2005 [21].
Th gii 236,1
M 86,8
Brazil 59,0
Argentina 47,2
Paraguay 6,5
Trung Quc 16,2
n  7,7
Canada 3,5
Ukraine 0,9
Liên bang Nga 0,7
Indonesia 0,8
Vit Nam 0,3
Thái Lan 0,2
Nigeria 0,4
Các nc khác 0,8
6
Bng 1.2: Din tích, nng sut, sn lng u tng c nc qua các nm
(Ngun: Tng cc Thng kê, 2006)
m
Ch tiêu
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Din tích (1000 ha) 124,1 140,3 158,6 165,6 182,5 203,6 185,8
ng sut (t/ha) 12,0 12,4 13,0 13,3 13,3 14,3 13,9
Sn lng (1000 tn) 149,3 173,7 205,6 219,6 242,1 290,6 186,9
Hin nay cây u tng c trng  c 7 vùng nông nghip trên c nc,
do iu kin sinh thái ca mi vùng khác nhau nên có s khác bit khá rõ v din
tích trng, nng sut và sn lng [21].
Bng 1.3. Din tích, nng sut và sn lng u tng ca 7 vùng nm 2005
a m
Din tích
(1000 ha)
ng sut
(Kg/ha)
Sn lng
(1000 tn)
C nc 203,6 1430 291,5
ng bng Sông Hng 67,3 16000 107,5
Vùng ông Bc 48,4 1040 50,2
Vùng Tây Bc 25,0 1150 28,7
Vùng Bc Trung B 6,5 1220 7,9
Tây Nguyên 27,1 1570 42,5
ông Nam B 5,3 1060 5,6
ng bng Sông Cu long 21,2 2100 44,5
ng 3.1 cho thy Tây Nguyên là vùng có din tích trng u tng ln th
3 trong 7 vùng nông nghip trên  c.Cùng vi s ng trng a các loi cây
trng chính nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì cây u tng ng ang c
chú trng và phát trin trên vùng t này.
Mc dù, sn lng u tng  nc ta có tng nhng so vi các nc trên
th gii và trong khu vc nng sut ca ta vn còn thp, và c bit trong nhng
m gn ây din tích, nng sut và sn lng u tng ca nc ta gim i áng
7
k. Nm 2005 din tích t 203600 ha gim xung ch còn 185800 ha nm 2006 và
sn lng gim t 290600 tn nm 2005 xung còn 186900 tn nm 2006.
Nguyên nhân chính là do u t thp, cha có b ging phù hp, cha áp
dng k tht tiên tin. Vì vy, nghiên cu ci tin các c m nông sinh hc ca
các ging a phng và to ging mi có nng sut cao, thích nghi vi u kin
sinh thái  nhng vùng khác nhau bng phng pháp truyn thng kt hp vi hin
i s áp ng c yêu cu ca thc tin t ra và ó cng là chin lc quan
trng v s phát trin cây u  nc ta.
1.1.4. Thành phn hóa sinh ht u tng
Trong ht u tng có các thành phn ã bit tính theo t l protein 30-
56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mui khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các
vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nha, cellulose. Ngoài ra, ht u tng
còn có  các axit amin c bn isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,
tryptophan, valin [20].
Protein là thành phn ch yu trong ht u tng. Chúng chim khong
30%-55% khi lng khô ca ht. Da vào h s lng, ngi ta chia protein ca ht
u tng thành 3 loi: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Nhng loi
protein chính trong ht u tng là: protein d tr (chim 70% tng s protein),
các enzim, các cht c ch proteaza và lectin. Thành phn ca protein gm có
albumin (9,5%), globulin tan trong nc (75,8%), globulin ch tan trong NaCl là
3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25].
Thành phn axit amin ca ht u tng: Protein ca các loi u ,
nht là u tng, c xem là protein có cht lng tt nht trong các loi protein
thc vt. Chúng có cha tt c các axit amin không thay th. Hn na protein ca
cây hu còn có hàm lng lysin rt cao so vi protein t các loi ng cc.Tuy
vy, hàm lng các axit amin có cha gc SH (metionin, cystein) còn thp [8], [40].
Hàm lng lipit trong u tng khá cao chim khong 12-25% khi
ng khô, trong ó hàm lng các axit béo no thp, khong 13%, không có
cholesterol, 30% là các axit béo cha no mt ni ôi. Lng axit béo không no cn
8
thit: axit linoleic 50%, và c bit có 7% axit anpha linolenic là ngun cung cp
axit béo chui mch dài omega 3 quan trng cho c th nh DHA (Docosa
Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44].
Cht lng lipit ca ht u tng rt tt, cho nên nó c s dng rng rãi
trong công nghip ch bin thc phm. Ht u tng còn có các loi vitamin tan
trong lipit, c bit là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong ht u
ng còn cha mt s cht khác nh hydrat cacbon, mui khoáng, axit nucleic,
kích thích sinh trng .
Tóm li, ht u tng có giá tr dinh dng cao.Trong ó, hàm lng
protein d tr và cht lng ca chúng là yu t quyt nh làm cho u tng tr
thành ngun thc phm quan trng cho ngi và thc n cho gia súc [18].
1.2. NGHIÊN CU VC TÍNH CHU HN CA CÂY U TNG
1.2.1. Khái nim v hn và tác ng ca hn n thc vt
Hn i vi thc vt là khái nim dùng  ch s thiu nc do môi trng
gây nên trong sut quá trình hay tng giai n, làm nh hng n sinh trng và
phát trin ca cây.
Thiu nc trc tiên nh hng n s cân bng nc ca cây, tó nh
ng n chc nng sinh lý nh quang hp, hô hp dinh dng khoáng và cui
cùng nh n s sinh trng phát trin ca thc vt. Cây s cht non hoc gim sc
sng, gim nng sut [19].
Hin tng mt nc có th do tác ng s cp, là kt qu ca s thiu nc
trong môi trng, hoc là tác ng th cp c gây ra bi nhit  thp, st
nóng hay tác ng ca mui. Hn cng nh yu t ngoi cnh bt li khác khi tác
ng lên c th thc vt s gây ra phn ng ca c th. Tùy theo tng loài, ging
mà mc  phn ng ca c th cng nh thit hi do khô hn gây ra khác nhau:
mt s b cht, mt s b tn thng nhng cng có mt s khác không b nh
ng. Kh nng thc vt có th gim thiu mc tn thng do thiu ht nc gây
ra gi là tính chu hn [19].
9
Vit Nam là mt nc có a hình a dng và din bin khí hu phc tp, lng
a phân b không u gia các vùng, min và gia các thi k trong nm nên hn
hán có th xy ra  bt k mùa nào, vùng nào. Din tích có ti 3/4 lãnh th là i núi,
t canh tác ca các khu vc này thng xuyên b hn nên thành phn th nhng ca
các vùng khác nhau rt rõ rt. Tt c các yu t trên chi phi mnh m mc nc ngm
và kh nng gi nc ca t.  chng li khô hn cây có th gi không b mt
c, gim din tích lá, rút ngn chu k sng…Kh nng duy trì áp sut thm thu ni
bào có tác dng bo v hoc duy trì sc sng ca t bào cht khi b mt nc [2]. Có
hai loi hn do môi tng tác ng là hn t và hn không khí [1], [5].
Tác ng a n lên cây ch yu theo hai hng chính là: làm tng nhit 
cây và gây mt nc trong cây. Nc là yu t gii hn i vi cây trng, va là sn
phm khi u va là sn phm trung gian và cui cùng ca các quá trình chuyn hoá
sinh hc. Nc là môi trng  các phn ng trao i cht xy ra [2].
S tác ng ca hn, gây nên hin tng co nguyên sinh và làm cho cây b
héo. S co nguyên sinh các t bào din ra khi nng  nc trong môi trng quá
cao hay do hn nc làm cho nc trong t bào tht thoát ra ngoài nên khi.
Hn hán làm gim mnh quang hp. Khi hàm lng nc trong lá còn
khong 40-50% quang hp ca lá s bình tr cn tr s sinh trng ca cây.
Nh vy, nh hng cc oan ca hn  bt c giai n sinh trng nào ca
cây trng cng nh hng n các yu t cu thành nng sut và sn lng cây trng.
1.2.2. C s sinh lý, sinh hóa và sinh hc phân t ca tính chu hn
1.2.2.1. C s sinh lý, sinh hóa ca tính chu hn
Khi gp hn thc vt luôn có nhng bin i v mt sinh lý, sinh hóa nhm
không  mt nc. Có hai c ch bo v thc vt tn ti trên môi trng thiu
c ó là vai trò ca b r và kh nng u chnh áp sut thm thu [2].
Vai trò ca b r: kh nng thu nhn nc ch yu ph thuc vào b r. 
tránh mt nc nhng cây chu hn thng có b r khe, dài, mp, có sc xuyên
sâu s hút c nc  nhng ni sâu trong t hoc r lan rng vi s lng ln
[19]. Thc vt nói chung, và cây u tng nói riêng, khi  giai n cây non
thng chu tác ng mnh ca hn vì b r cha phát trin y  còn yu.
10
Kh nng u chnh áp sut thm thu (ASTT): là mt c tính quan trng
ca t bào khi b mt nc do nóng hn. Nhng thc vt tn ti trên môi trng mt
cân bng v áp sut thm thu òi hi phi có kh nng chng li u kin khc
nghit ó. Trong u kin khô hn ASTT c u chnh tng lên giúp cho t bào
thu nhn c nhng phân t nc tt. Bng c ch nh vy, thc vt có th vt
qua c tình trng hn cc b.
Thông thng, thiu nc gây ri lon toàn b phng thc chuyn hóa 
thc vt, làm tng hoc gim hàm lng các cht chuyn hóa nh: ng lên v hàm
ng prolin, nng  ion K
+
, các loi ng, axit hu c [2], [4], [30]. S tng
hp và tích ly các cht trên din ra rt nhanh khi t bào mt nc, các cht hòa tan
sc tích ly nhm chng li vic gim mt nc, tng kh nng gi nc ca
cht nguyên sinh và chúng có th tng tác vi lipit hoc protein màng ngn chn
s phá hy màng và các phc protein [24]. Quá trình này liên quan n s biu hin
ca các gen, hàng lot các gen nghc hot hóa tng hp to ra các cht cn thit
 chng li s khô hn [1].
c ta nm trong khu vc nhit i gió mùa hn là yu t tng xuyên tác
ng gây nh hng n sinh trng, phát trin ca cây trng, nh hng xu n
ng sut và phm cht ca chúng. Vì vy, vic nghiên cu các c ch chu hn s
là c s cho vic ci thin ging cng nh to ra c các ging có tính chng chu.
Khi nghiên cu v kh nng chng chu ca các cây trng ly ht ngi ta
thc hin theo nhiu hng khác nhau: phân tích hóa sinh trong ht ny mm 
nghiên cu a dng enzym - amylaza và proteaza hàm lng protein tan, thành
phn axit amim, prolin
Các proteazaóng vai trò quan trng trong c th sng và nht là trong thi
k ny mm ca ht. Chúng rt a dng. Thành phn phc tp ca các proteaza ht
c to ra bi sa dng chc nng do chúng m nhim trong thi k ny mm.
Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gii protein d tr trong ht, nhm
cung cp các axit amin cho thi k phát trin u tiên ca cây mà chúng còn tham gia
vào quá trình vi x lý phân t protein. Proteaza tham gia vào phân gii các protein l
11
hoc b bin tính khi gp u kin cc oan (lnh, mn, hn, tác ng c hc ) [18].
Trn Th Phng Liên (1999) khi nghiên cu so sánh phn di hot tính proteaza
ca các ging u tng chu nóng chu hn khác nhauã nhn xét rng. Proteaza
trong quá trình ht ny mm ca ht  tt c các ging u tng nghiên cu rt a
dng, có hot tính cao, có kh nng phân gii hoàn toàn protein d tr to nguyên
liu  tng hp protein cho c th mi. X lý nhit  cao chnh hng n hot
tính proteaza  mt s ging chu hn, không nh hng n ging chu nóng [18].
Nguyn Th Kim Dung (2003) nghiên cu s bin ng hot  proteaza  giai
on ht ny mm ca các ging lc ã rút ra kt lun, hot  ca proteaza trong
giai on ht ny mm có xu hng tng t 1 n 5 ngày tui, sau ó gim t 7 n
9 ngày tui [6]. Cng theo hng nghiên cu này Nguyn Th Thu Ngà (2007), cho
rng  các giai n ht ny mm làm bin i hot  ca proteaza và hàm lng
protein tan. S bin i này tuân theo quy lut chung : tng  các giai n t 3 n
7 ngày tui, bt u gim  giai n 9 ngày tui, hàm lng protein tan và hot 
proteaza có mi tng quan thun cht ch [29].
Nhng thay i hóa sinh khác do hn gây ra cng c nhiu tác gi quan
tâm nghiên cu: nh s thay i hàm lng prolin khi cây gp hn.
Prolin là mt axit amin có vai trò quan trng trong su hòa ASTT trong
t bào, ng thi là mt axit amin a nc có kh nng gi và ly nc cho t bào,
ngn chn s xâm nhp ca ion Na
+
tng tác vi protein màng, ngn chn s phá
hy ca màng và các phc protein khác. Các kt qu nghiên cu u cho thy khi cây
trng gp hn thì cây gim tng hp protein và tng tng hp prolin [26], [28].
Soulages và cs (2003) ã chng minh ngoài vai trò tng cng kh nng chu
hn thì chui axit amin L – Prolin nhóm II còn có kh nng chng li các tác ng
bt li ca nhit i vi cây u tng [ 38]. Theo inh Th Phòng (2001),  lúa
khi gây hn sinh lý bng dung dch sorbitol 5% hàm lng prolin ca các dòng chn
lc tng lên vt xa so vi i chng, s tng hàm lng prolin liên quan n kh
ng chu hn [30]. Kho sát cht lng ht và kh nng chu hn ca mt s ging
lúa cn a phng  vùng núi phía Bc, Chu Hoàng Mu và cs ( 2005) ã nhn xét,
12
kh nng chu hn ca các ging lúa cn có liên quan n hàm lng protein và hàm
ng prolin. Khi gp hn, cây lúa cn gim hàm lng protein và tng hàm lng
prolin [24]. Nguyn Th Thúy Hng ( 2006), khi nghiên cu v kh nng chu hn ca
các ging u tng a phng ca Tnh Sn La cng ã nhn xét rng: khi gp hn
các ging u tng có s gim tng hp protein và tng cng tng hp prolin [26 ].
1.2.2. C s phân t ca tính chu hn
Kh nng chng chu ca sinh vt nói chung và ca thc vt nói riêng liên
quan n cu trúc, chc nng ca các thành phn trong t bào và các quá trình
xy ra trong mi vùng liên quan n kh nng chu nóng, chu hn, mn, phèn
ca thc vt.
Phn ng ca thc vt trc nhng tác ng: nóng, hn rt a dng nó ph
thuc vào nhiu yu t khác nhau, trong ó có kiu gen,  dài và tính khc lit ca
iu kin ngoi cnh. Biu hin ca quá trình này là vic sinh tng hp mt lot các
cht trong t bào, mt s hormon hoc cht kích thích  giúp cho cây có kh nng
thích ng. Khi i sâu vào nghiên cu  mc  phân t ca hin tng nóng hn 
thc vt ngi ta ã có nhng bc tip cn khác nhau trên nhiu loài cây trng 
các giai on phát trin khác nhau. c nghiên cu nhiu nht là các protein sn
phm biu hin gen [19]. Nhóm các protein c c bit quan tâm bao gm:
protein sc nhit, môi gii phân t, LEA
Protein sc nhit (heat shock protein- HSP): HSP có  hu ht các loài
thc vt nh: lúa mì, mch, lúa go, ngô, u nành, hành, ti…. chúng chim
khong 1% protein tng s trong lá ca các loài thc vt này. HSP c tng hp
khi t bào gp iu kin cc oan nh: hn, nhit  cao,  mui cao. S xut hin
ca HSP có chc nng ngn cn hoc sa cha s phá y do stress nóng và m
rng giá tr ngng vi s chng chu nhit  cao. Trong các t bào thc vt HSP
t bào cht tp trung thành các ht sc nhit (HSG-Heat Shock Granules). Ngi ta
cho rng các HSP gn kt trên các ARN polymeraza  ngn cn s phiên mã tng
hp mARN trong quá trình b stress nóng. Sau sc nóng các ht này phân tán và
liên kt dày c vi các ribôxôm hot ng sinh tng hp protein [19].
13
HSP có th chia làm 6 nhóm da trên c s khi lng phân t khác nhau:
110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhiu i
din ca cht môi gii phân t (gi là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có chc
ng bo v cho t bào nhng không phi là môi gii phân t. Ubiquitin có hot
tính proteaza vi chc nng phân gii các protein không có hot tính enzym.
Ubiquitin có MW rt thp, ít chu nh hng ca nhit  nên có vai trò t sa cha
ca t bào khi gp yu t cc oan, c bit là nhit  cao [19].
Môi gii phân t (MGPT): MGPT là mt nhóm gm nhóm gm nhiu loi
protein khác nhau, nhng chúng u có chc nng tham gia to cu trúc không gian
úng cho protein trong t bào. Phn ln các cht MGPT có hot tính ATP-aza, có
chc nng: (1) Gin nh chui polypeptit khi ang tng hp và to cu trúc
không gian úng cho chúng, (2) To li cu trúc không gian ca protein sau khi vn
chuyn qua màng t bào, (3) Lp ráp các chui polipeptit vào phc  to cu trúc
bc 4, (4) MGPT c tng cng nh quá trình tng hp trong u kin cc oan
do nhu cu cp thit ca t bào, nht là sc nhit.
MGPT có th chia thành mt s nhóm nh sau:
HSP 70 là nhóm MGPT có hot tính ATP-aza và có tính bo th cao. Trong
iu kin cc oan HSP có th ngn chn s co cm và kt t protein.
HSP 60 (chaperonin) là loi protein cu to t các tiu n v có khi lng
60 kDa và cng có hot tính ATP-aza [24].
H CCT: Chaperonin ca t bào cht, còn gi là chaperonin cha polypeptit-
l ca phc t (CCT), hay còn gi là phc vòng cha polypeptit-l ca phc t (TriC) là
mt nhóm môi gii phân t mi. Chúng giúp cho vic to cu trúc không gian úng
ca protein trong khung t bào actin và tubulin trong t bào cht. Chúng óng vai
trò quan trng trong qua trình hình thành thoi vô sc ca giai n phân bào, c
bit là thi k phát trin mm t ht. Chaperonin t bào cht là mt phc có khi
ng phân t khong 90 kDa bao gm 8 tiu n v có tên là α, , , , , , , 
(tng ng vi CCT1- CCT8) và hình thành nên cu trúc vòng bi kép [16]. Trong
dch chit t bào các tiu n v trong cu trúc không gian ca vòng bi có vai trò rt
14
quan trng  gn c cht. Chc nng này gn lin vi s có mt ca 4 tiu n v:
CCTα. Vì quá trình to cu trúc không gian trong CCT không có s tham gia
ca protein dng GroES, nên c cht protein c gi li trong khi hình tr nh c
chóng mc bit theo kiu bc thang ca các vùng CCT. Ngoài CCT còn có hai
nhóm nhân t cùng tác ng A và B tham gia vào cu trúc không gian úng ca
protein. Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò trong công vic u chnh
hot tính ca CCT. Nó không tham gia tng tác vi CCT nhng li tham gia vào
to cu trúc không gian úng ca protein khi gii phóng ra khi CCT [18].
Các nhóm HSP 100, HSP 90 u có tính bo th cao và có hot tính ATP-
aza. Mt s tìm thy trong t bào bình thng, nhng phn ln chúng sinh ra khi
gp các u kin ngoi cnh bt li nh hn, nóng, lnh. Chc nng chính ca
chúng là ngn chn s co cm ca protein và tái hot hoá các protein bin tính [19].
1.2.3. Nghiên cu v tính chu hn  cây u tng
Trong các cây trng ly ht thì cây u tng có nhu cu v nc cao hn
các loi cây khác. ó chính là do trong ht và cây u tng có hàm lng protein
và lipit rt cao,  tng hp 1kg cht khô cn 500 - 530 kg nc. Trong quá trình
ny mm thì nhu cu v nc ca u tng cng khá cao 50%, trong khi ó  ngô
ch là 30%, lúa là 26% [20 ].
Nghiên cu v các c tính chu hn ca cây u tng v phng din sinh
lý và di truyn ã cho thy rng, các c tính này liên quan cht chn c m
hoá keo ca nguyên sinh cht, c m ca quá trình trao i cht. Tính chu hn
ca cây u tng là tính trng a gen. Chúng th hin  nhiu khía cnh khác nhau
nh: v s phát trin ca b r, tính chín sm tng i, cng nh bn cht di
truyn ca tng ging có kh nng s dng nc tit kim trong quá trình sinh
trng và phát trin ca cây. n c vào c m này, u tng c chia thành
hai nhóm [18].
- Nhóm chu c s mt nc trong tng giai n phát trin ca cây.
- Nhóm chu c s thiu nc trong tt c giai n phát trin ca cây.
15
 giai n cây con khi gp hn, u tng có th d vt qua hn, còn 
nhng giai n sau nh giai on ra hoa, kt qu, ht chín sa mà gp hn thì s
dn n nng sut gim áng k.
Trong nhng nm gn ây các nhà khoa hc ã có nhiu thành công khi
nghiên cu sâu hn v tính chu hn ca cây u tng.
Maitra và Cushman (1994) ã phân lp c cDNA ca dehydrin t lá u
ng khi b mt nc, ngoài ra các tác gi còn phân lp c cDNA ca LEA nhóm D
- 95 t lá và r cây u tng khi b hn [36].
Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên cu v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ã
nhn thy, chúng tng lên  lng ln trong mm u tng di tác ng ca nhit
c tìm thy  cu trúc dng ht trong nguyên sinh cht và trong nhân cùng vi
protein b bin tính.[35].
m 2004, nhóm nghiên cu gm Huang và cs ca Trng i hc T
nhiên và K thut Pingtung, ài Loan, ã phân lp c gen P5CS u tng t
mARN vi kích thc 2148bp [45]. Gen P5CS là nhân t gii hn cho nhp  tng
hp proline  thc vt trong u kin bt li do hn và do mn gây nên [39].
Nghiên cu ca Porcel và Cs (2005), ã ch ra rng, gen mã hoá protein dehydrin
(LEA-DII) có vai trò vi kh nng chng chu ca u tng.
 Vit Nam ã có mt s công trình nghiên cu phân lp các gen liên quan
n kh nng chu nóng, chu hn ca cây u tng. Nghiên cu phân lp và c
trình t gen chaperonin t ging u tng chu nh Bonminori- Nht n vi kích
thc phân t 1,6 kb ca Nông Vn i và cs (1997) [12]. Nghiên cu ca Trn Th
Phng Liên (1999) ã phân lp, xác nh trình t gen chaperonin t bào cht CCT
t ging u tng t bin M103 vi kích thc 1602 bp mã hóa cho 533 axit
amin. Trình t gen này có s thay i axit amin  3 v trí 99 (Ser  Thr), 280 (Ser  Gly)
và 308 ( Ser  Ala), s thay i này tuân theo quy lut tng kh nng chu nhit.
Tác gi khng nh s thay i này là cn c lý gii kh nng chu nóng ca ging
t bin M103 [18]. Trn Th Phng Liên và cs (2003), ã phân lp c gen
chaperonin CCTδ t ging u tng a phng chu n Cúc Vàng, gen này gm
16
1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17]. Nguyn Th Thu Hin (2005), phân
lp c gen dehydrin vi kích thc 751bp liên quan n kh nng chu hn t hai
ging u tng vàng Mng Khng và Cao Bng 4 [11].
1.3. NHN XÉT CHUNG
1.3.1. u tng là cây trng có giá tr kinh t cao, là cây công nghip, cây
thc phm, va là cây ci ci to t. c trng ph bin  nhiu quc gia trên th
gii.  Vit Nam, cây u tng chim mt v trí quan trng trong nn nông
nghip. Trong nhng nm gn ây nng sut và sn lng u tng tuy có s tng
áng k, nhng so vi các nc trên th gii nng sut ca các ging u tng 
c ta còn  mc thp.
1.3.2.Trong ht u tng có các thành phn ã bit tính theo t l protein
30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mui khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các
vitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm lng protein d tr và cht lng ca
chúng là yu t quyt nh làm cho u tng tr thành ngun thc phm quan
trng cho ngi và thc n cho gia súc.
1.3.3. u tng là loi cây có nhu cu v nc cao hn các loi cây trng
khác, thuc vào nhóm chu hn kém. Hn ã nh hng ln n quá trình sinh trng,
phát trin ca cây u tng và làm gim nng sut, cht lng. Nghiên cu v tính
chu hn ca cây u tng ngi ta thc hin theo nhiu hng khác nhau: phân tích
hóa sinh trong ht ny mm  nghiên cu a dng enzym - amylaza và proteaza hàm
ng protein tan, thành phn axit amin i sâu vào nghiên cu  mc  phân t,
c nghiên cu nhiu nht là các protein sn phm biu hin gen. Nhóm các protein
c c bit quan tâm bao gm: protein sc nhit, môi gii phân t, LEA
1.3.4. Trên th gii ã thành công trong vic nghiên cu gen mã hóa protein
u tng và các trình t gen này ã c công b trên ngân hàng gen th gii.
Ti Vit Nam, ã có mt s tác gi nghiên cu v tính chu hn và ã phân lp, gii
trình t gen liên quan n tính chu hn ca cây u tng, trong ó có chaperonin
trên các ging u tng khác nhau. Tuy nhiên, vic nghiên cu các ging u
ng a phng ca các tnh  khu vc Tây Nguyên còn ít c quan tâm chú ý.
17
Chng 2
NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.1. NGUYÊN LIU
2.1.1. Nguyên liu thc vt
Các ging u tng a phng: Azmpa- Gia Lai (AZP), Sa Thy -
Kon Tum (ST), Chmnga-k Lk (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truyn
thc vt - Vin Khoa hc Nông nghip Vit Nam cung cp.
Ging a phng Duy Linh- Lâm ng (DL) và ging i chng HN9 do
Trung tâm Khuyn Nông tnh k Lk cung cp.
Bng 2.1. Ngun gc ca các ging u tng nghiên cu
TT
Tên ging Ký hiu Ngun gc
1 Duy Linh DL Ging a phng, Duy linh- Lâm ng
2 Sa Thy ST Ging a phng, Sa Thy- Kon Tum
3 mnga CNg Ging a phng, Chmnga-k Lk
4 HN9 HN9 Ging i trà c trng ph bin  huyn Buôn
ôn- k lk
5 Azmpa AZP Ging a phng, Azmpa- Gia Lai
2.1.2. Hóa cht, thit b và a m nghiên cu
Hóa cht: dùng cho các thí nghim phân tích hoá sinh và sinh hc hc phân
t: gm các loi hoá cht mua ca các hãng Anh, c, M, Trung Quc: EDTA,
CTAB, TAE, Agarose…
Các hóa cht thông dng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol
(70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, nc kh ion,
NaH
2
PO
4
, Fe
2
( SO
4
), K
3
Fe( CN)
6
, CuSO
4
, ninhydrin…
Thit b: Các thit b chính c s dng  phân tích hoá sinh và sinh hc
phân t gm:
- Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia)
- Máy in di + b ngun PowerPac 300 (Bio-Rad, M)
18
- Máy phân tích axit amin t ng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett
Parkard, M)
- Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M)
- Bn nhit (Techne, OSI, Anh)
- Pipetman các loi (Gilson, Pháp)
- T sy (Anh)
- Cân in t (Thu S)
- T lnh sâu – 85
0
C (Sanyo, Nht Bn)
- Ni kh trùng (Tomy- Nht)
- Máy PCR (ABI System, M)
- Máy soi ADN (Bio-Rad, M)
- Máy li tâm lnh (c)
- Máy khuy trn Voltex (c)
- Máy o pH (Metter Toledo, Thy S)
a m nghiên cu: Các thí nghim c thc hin ti Phòng thí nghim
Di truyn hc và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Trng i hc S phm -
i hc Thái Nguyên. Các phân tích axit amin tng và xác nh trình t gen
c thc hin ti Phòng thí nghim trng m Công ngh gen, Vin Công ngh
sinh hc, Vin Khoa hc và Công ngh Viêt Nam.
2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.2.1 Phng pháp hoá sinh
2.2.1.1. Phân tích hóa sinh  giai n ht tim sinh
(1) Xác nh hàm lng lipit
Da vào tính cht hoà tan ca lipit trong dung môi hu c chit rút, dung
môi hu cc s dng là petroleum ether [24].
Mu em sy khô, bóc v, nghin mn. Cân 0,05g mu cho vào mi ng
Eppendorf (3 ng Eppendorf / mu). Tip theo, cho 1,5ml petroleum ether vào mi
ng, lc o u,  ngn lnh 4
o
C trong 24 gi, em ly tâm 12000 vòng/phút trong 20
phút, b dch, lp li thí nghim 3 ln. Sau ó, sy khô mu còn li trong epp  70
0
C
n khi khi lng không i ri cân mu. Hàm lng lipit c tính theo công thc:
19
Hàm lng lipit =
(%)
AB
A

Trong ó: A: Khi lng mu ban u
B: Khi lng mu sau khi loi lipit
(2) Xác nh hàm lng protein
Protein tan tng s xác nh theo phng pháp Lowry c mô t trong tài
liu ca Phm Th Trân Châu và cs (1998) [3].
Cân 0,05g mu ã nghin nh, sy khô cho vào ng Eppendorf, mi mu lp
li 3 ln. Cho vào mi ng 1,5ml dung dch m photphat citrat ( pH=10 ), o u
bng máy voltex,  trong t lnh 4
o
C qua êm, em ly tâm thu dch  12000
vòng/phút trong 20 phút ri thu ly dch. Thí nghim c lp li 3 ln .
Dch chit c nh mc lên 5ml và o hp th quang ph trên máy quang
ph UV  bc sóng 750 nm vi thuc th Folin.
Hàm lng protein c tính theo công thc :
X % =
m
AxHSPL
x 100%
Trong ó :
X : hàm lng protein (% khi lng khô)
A : nng  thu c khi o trên máy (mg /ml )
HSPL: h s pha loãng
m: khi lng mu (mg)
(3) Xác nh hàm lng và thành phn axit amin trong ht
Hàm lng axit amin c xác nh trên máy HP - Amino Quant s dng
ortho-phtalADNehyt to dn xut i vi các axit amin bc 1 và 9 - fluoreryl -
metyl - cloroformat i vi các axit amin bc 2. Mu c x lý theo phng pháp
thu phân pha lng theo hng dn s dng máy phân tích axit amin tng.
2.2.1.2 ánh giá kh nng chu hn thông qua phân tích mt s ch tiêu hóa
sinh  giai n ht ny mm
(1) Chun b mu
Ht các ging u tng c ngâm trong nc 1h, sau ó c m
bng dung dch MS pha loãng 10 ln cha sorbitol 7%. Ht ny mm sau các
20
thi gian  1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày c ly  xác nh hot 
c proteaza và hàm lng protein tan. i chng là ht u tng c  bng
c không cha sorbitol.
(2) Xác nh hot  ca proteaza
Hot  enzym proteaza xác nh theo phng pháp Anson ci tin theo mô
t ca Nguyn Vn Mùi ( 2001) [27].
Ht ny mm bóc v la, cân khi lng, nghin nh, chit bng m
phosphat pH= 6,5 li tâm 12000 vòng/phút  4
o
c, dch thu c s dng làm thí
nghim. Thí nghim c tin hành trên ng thí nghim, ng kim tra, o trên máy
quang ph bc sóng 750 nm. Hot  enzym proteaza c tính da trên  th
ng chun xây dng bng tyrosin, và c tính theo công thc:
VH/mg =
()
n k D HSPL
Tm
− ××
×
Trong ó:
n: so trên máy ng thí nghim (mg/ml)
HSPL: h s pha loãng
k: so trên máy ng kim tra (mg/ml)
m: khi lng mu (mg)
D: s ml dch chit
T: thi gian  enzym vi c cht
(3) nh lng hàm lng protein tan
Hàm lng protein tan c xác nh theo phng pháp Lowry c mô t
trong tài liu ca Phm Th Trân Châu và cs (1998) [3].
2.2.2. ánh gía kh nng chu hn  giai n cây non bng phng pháp gây
hn nhân to
Phng pháp ánh giá nhanh kh nng chu hn  giai n cây non c
tin hành theo Lê Trn Bình và cs (1998) [2].
21
Ht u tng ny mm gieo vào chu (kích thc 30cm x 30cm) cha cát
vàng ã ra sch, mi chu trng 30 cây, mi ging trng 4 chu. Thí nghim c
lp li 3 ln trong iu kin và ch chm sóc nh nhau. Thi gian u ti nc
cho m, khi cây u tng c 3 lá tin hành gây hn nhân to và ánh giá kh
ng chu hn ca các ging u tng bng cách xác nh t l thit hi và ch s
chu hn tng i.
(1) Xác nh t l cây sng sót (%)
S cây sng
T l cây sng sót =
Tng s cây x lý
(%)
(2) Xác nh kh nng gi nc qua các giai n x lý bi hn theo công thc
(%)
ft
fc
W
W
W
=
Trong ó:
W(%): Kh nng gi nc ca cây sau khi x lý bi hn
W
ft
(g): Khi lng ti ca cây sau khi x lý bi hn (g)
W
fc
(g): Khi lng ti ca cây không x lý (g)
(3) Xác nh t l thit hi do hn gây ra c tính theo công thc
()
(%)
o
Nb
a
NC
=

Trong ó:
a: T l thit hi do hn gây ra (%);
b: Tr s thit hi ca mi cp;
c: Tr s thit hi ca cp cao nht;
N
o
: S cây ca mi cp thit hi;
N: Tng s cây x lý
Các tr s:
S cây cht: Tr s 3
22
S cây héo: Tr s 1
S cây không bnh hng: Tr s 0.
(4) Xác nh ch s chu hn tng i c da trên 15 ch tiêu phân tích
và c tính theo công thc
1
sin ( )
2
= + + ++
S ab bc cd pa
α
Trong ó:
S: Ch s chu hn tng i
a, b, c, … : Các ch tiêu theo dõi
: Góc to bi 2 trc mang tr s lin nhau  = 360
0
/15
15: S ch tiêu theo dõi
(5) Xác nh mt s ch tiêu khác chu tác ng ca hn
- Khi lng ti ca r và thân lá: Ct riêng r và thân lá, dùng giy thm
khô, ri cân trng lng ti trên cân phân tích.
- Xác nh khi lng khô ca r và thân lá: Các mu c sy trong t sy
 nhit  100
0
C ri xác nh khi lng khô tuyt i.
- Xác nh t s chu hn
T = W
r
/W
tl
Trong ó :
T: T s khi lng ca r/ thân lá khô
W
r
: Khi lng khô ca r (mg)
W
tl
: Khi lng khô ca thân lá (mg)
(6) Xác nh hàm lng prolin theo Bastes (1973) [33].
Tách chit prolin: Nghin 0,5 gram thân lá cây u tng ã x lý hn 
ngng trc hn, hn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong ci chày x, thêm 10ml dung
dch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu dch làm thí
nghim. o hp th quang ph bc sóng 520 nm.
Hàm lng prolin c tính theo công thc:
X % =
m
AxHSPL
x 100%
23
Trong ó:
X : Hàm lng prolin (%)
A : Nng  thu c khi o trên máy (mg /ml)
HSPL: H s pha loãng
m: Khi lng mu (mg)
2.2.3. X lý kt qu và tính toán s liu
Mi thí nghim c nhc li 3 ln. S dng toán thng kê  xác nh tr s
thng kê nh trung bình mu
)(x , phng sai (σ
2
), và sai s trung bình mu )(
x
S ,
h s tng quan R… theo tài liu ca Chu Vn Mn và cs (2001) [22]. Các s liu
c x lý trên máy vi tính bng chng trình Excel vi mc ý ngha α = 0,05 [32].
Xác nh khong cách và thit lp mi quan h gia các ging u tng bng
chng trình NTSYS pc 2.02i.
2.2.4. Phng pháp sinh hc phân t
2.2.4.1. Phng pháp tách chit ADN tng s t mm u tng
Quy trình tách chit và làm sch ADN tng s t mmu tng c thc
hin theo phng pháp ca Gawel và CS (1991) [34].
Mm u tng c 3 ngày tui tách ly phn thân mm ri em bao qun
 t lnh sâu (-85
0
C).
Quy trình tách chit ADN tng sc thc hin theo các bc sau:
- Ly khong 200g mm u tng ã  lnh  -85
0
C  nghin nhanh trong
ci và chày x (ci chày ã c vô trùng và  trong t -85
0
C).
- B sung 0,8ml m ra, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loi b dch ni.
c này làm 2 ln.
- Thêm 700µl m tách, mix nh,  65
0
C trong 2h, sau ó ly ra  nhit
 phòng 5 phút.
- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), trn u 20 phút
- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cn thn 500µl dch trong sang ng
eppendorf 1,5 ml mi ( b ta).

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×