Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc

1
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis
cDNA DNA bổ xung (complementary DNA)
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
dNTP Deoxynucleotid triphotphat
EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic
IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test
IPTG Isopropyl β – D - thiogalactoside
PBS Phosphat Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium Dodecyl Sulfat
SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide
TEA Tris – axit acetic – EDTA
T.evansi Trypanosoma evansi
VAT Variant Antigen Tupe
VSG Variant Surface Glucoprotein
v/p Vòng/phút
2
DANH MỤC CÁC BẢNG

3
DANH MỤC CÁC HÌNH
4
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của của đề tài
Bệnh tiên mao trùng hay còn gọi là bệnh ngã nước trâu bò do
Trypanosoma evansi (T.evasi) gây ra. Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982),
Phan Địch Lân và cs (2004)[9], Phan Văn Chinh (2006)[3], bệnh tiên mao
trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là
13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới
6,3 – 20%. Hậu quả là bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi do ảnh
hưởng đến sản lượng thịt và sức kéo.
Trong các hệ thống chẩn đoán bệnh tiên mao trùng hiện nay ở nước ta
như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết
thanh học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử thì phương pháp chẩn
đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho
kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời
gian ngắn.
Tuy nhiên hiện tại chúng ta vẫn phải sử dụng Kít nhập ngoại nên giá
thành cao, chưa có khả năng cho phép sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh
tiên mao trùng.
Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kít huyết thanh học chẩn đoán bệnh tiên
mao trùng còn khá mới mẻ. Hầu hết chỉ tập chung vào xác định hiệu quả chẩn
đoán của một số phương pháp phát hiện tiên mao trùng và phương pháp huyết
thanh học.
Để sản xuất Kít chẩn đoán cần phải có một lượng lớn kháng nguyên
RoTAT 1.2, nguồn kháng nguyên này có thể được sản xuất bởi 2 phương
pháp: tự nhiên và tái tổ hợp.
5
Kháng nguyên tự nhiên được tách từ ký sinh trùng sau khi tăng sinh
trên động vật thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời
tạo ra một lượng lớn kháng nguyên, tuy nhiên kháng nguyên này không tinh
khiết, thành phần đa dạng, vì vậy có khả năng gây phản ứng dương tính giả
với các kháng thể khác. Trong khi kháng nguyên tái tổ hợp có thể khắc phục
được những hạn chế đó.
Theo nghiên cứu của Urakawa và cs năm (2001)[32], kháng nguyên tái
tổ hợp RoTAT 1.2 được sản xuất dựa trên chức năng biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên vào tế bào côn trùng dòng Sf 9. Dòng tế bào tái tổ hợp có khả
năng tổng hợp và tiết kháng nguyên vào dịch nuôi cấy tế bào. Khi ứng dụng
kháng nguyên RoTAT 1.2 vào sản xuất Kít chẩn đoán, kháng nguyên tái tổ


hợp có độ nhạy tương tự như với kháng nguyên RoTAT 1.2 tự nhiên, nhưng
có độ đặc hiệu cao hơn tương ứng là 99% và 89,3%. Kết quả này chỉ ra khả
năng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 phát hiện được kháng thể đặc hiệu
của Trypanosoma evansi.
Như vậy, để chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kít
chẩn đoán nhanh và chính xác từ đó có biện pháp điều trị kịp thời và hiệu quả
bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo
kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất kít phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma
evanci gây bệnh trên gia súc và đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả là vấn
đề cấp thiết.
Với mục tiêu sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở
trong nước chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện
gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng
dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao
trùng ở gia súc”.
2. Mục tiêu của đề tài
2.1. Mục tiêu chung
6
Sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của
Trypanosoma evansi
- Tạo được bộ Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về biểu hiện các gen mã
hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evanci và ứng dụng để sản xuất
Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài chế tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít
chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc tại Việt Nam, nhằm phục vụ cho
việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc, góp phần nâng cao năng suất
chăn nuôi.
7
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc
Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt
Nam. Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong
cả nước. Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Trâu, bò,
ngựa mắc bệnh dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng
sinh sản và sức sản xuất.
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
1.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại
động vật nguyên sinh
Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5], vị
trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida
Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
8
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Loài Trvpanosoma (D) uniform
Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (N) congolense
Loài Trypanosoma (N) siminae
Loài Trypanosoma (N) vanhogi
Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906
Loài Trypanosoma (T) brucei
Loài Trypanosoma (T) gambience
Loài Trypanosoma (T) rhodesiense
Loài Trypanosoma (T) equiperdum
Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (P) suis
Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843
Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)
Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế
(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là:
T. brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng
Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là
một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 μm (trung bình là 25 μm),
chiều rộng 1,5 - 2μm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân
nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của
các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài
vào trong được chia thành 3 phần chính:
9
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp
ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp
vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant
Glycoprotein Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp
song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của
các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972
[27]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).
- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh
chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào
màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội
bào) và mạng lưới golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa DNA, hình bầu dục hoặc hình
trứng. Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể.
Ngoài nhân, về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa DNA (KADN). Từ
kinetoplast có một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể
thành một roi tự do. Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ
của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp
song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [27]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).
1.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định
(kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)
Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi
trong quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết
thanh thỏ tối miễn dịch với T. evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30
thành phần kháng nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến
đổi ở màng nguyên sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein):
ISG 65, ISG 75 và ISG 100. Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa
nước, các loại này không kết hợp với kháng thể của vật chủ (Nolan, 1997).
10
* Kháng nguyên biến đổi
Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG
(Variant Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng
nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi.
Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins
(1969) đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt. Cross (1975)
đã mô tả lớp áo bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao
phủ toàn bộ bề mặt tế bào bằngmột lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao
trùng có 107 phân tử). Lớp áo bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra
kháng thể đặc hiệu với từng type kháng nguyên biến đổi VAT (Variable
Antigen Type). Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới có khả năng kích thích vật
chủ tạo miền dịch chủ động. Người ta ước lượng rằng, một con tiên mao trùng
có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số gen của tiên mao
trùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này.
Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng
biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ.
Tuy nhiên, Van Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt
của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi
xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan
(1981), hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy
ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là
hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao
trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao
trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.
* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt
(VSG), làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy
11
sự hoạt hoá của gen. Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi
hoàn toàn bằng các phân tử VSG mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước
đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này.
Theo Barry và Tumer (1991) [22], các VSG được mã hoá nhờ các gen
chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn đến khác nhau, một gen VSG được hoạt
hoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG. Mỗi
bên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ gen của tiên
mao trùng tồn tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắp
xếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia
súc bị bệnh mãn tính. Cơ chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứ
nhất là, sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện trên (expression si de) khác nhau,
không có sự sắp xếp của DNA. Các điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các
gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự thay đổi type kháng
nguyên. Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình cảm
nhiễm. Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối
với VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên của các
điểm biểu hiện gen này. Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn DNA khác nhau
để tái tổ hợp gen, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc
từng phần gen; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứ
không phải dựa vào tái tổ hợp gen. Trường hợp này được diễn giải như sau:
một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác. Do có
sự thay thế một phần của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trưng.
1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
1.1.2.1. Phân bố của bệnh
Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán
cầu. Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi
cho đến Philippine.
12
Theo Euzeby (1984), bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới
ở châu Phi,châu Á và Nam Mỹ.
Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạc
Sahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa trung hải.
Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả rập Saudi,
Yêmen, Sultanate, Ả Rập thống nhất, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan,
Pakistan.
Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ,
Malaysia, bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine.
Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiện
chỉ còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ).
Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ở
Brazil, Mexico, Venezuela, Colombia.
Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng (Reid, 2002)
cho rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi, từ Ấn Độ
đến Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia, Iran,
Philippine.
Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái
khác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển. Theo Phạm Sỹ Lăng
(1982) [7], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng
Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây). Trâu, bò nhiễm bệnh
với tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng
nhiễm tiên mao trùng cao hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò
có nguồn gốc từ miền núi chuyển xuống vùng đồng bằng).
Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [11] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao
trùng ở trâu bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với
tỷ lệ cao (21,27%), trong đó trâu bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm
T. evansi cao hơn ở đồng bằng.
13
Theo Lê Đức Quyết và cs (1995) [16], Phạm Chiến và cs (1999) [2],
trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%;
bò là 6,6 - 10,3%.
1.1.2.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và
thú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo,
sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch , nhưng
không ký sinh ở người.
Chen Qijun (1992) cho biết: T. evansi gây bệnh cho hầu hết các loài
động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó… ở Trung Quốc.
Theo Sukanto I. P (1992): tỷ lệ lưu hành bệnh tiên mao trùng ở trâu
Indonesia cao hơn ở bò và tỷ lệ lưu hành bệnh ở bò lại cao hơn ở ngựa.
Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khoẻ là nhờ
các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu
(thuộc họ Tabanidae). Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả
tiên mao trùng vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu
sẽ truyền tiên mao trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ. Sự lây truyền này
mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới
truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng.
Theo Phan Địch Lân (1974) [8], Phan Địch Lân (1994 - 2004) [9], phần
lớn các loài mòng tập trung ở khu vực miền núi và trung du. Trong 53 loài
mòng thì có tới 44 loài phân bố ở vùng rừng núi có độ cao dưới 1 .000 mét so
với mặt nước biển, càng lên cao số loài càng ít dần (độ cao trên 1 .000 mét chỉ
có 26 loài). Ở vùng trung du (rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so với mặt
nước biển có 27 loài; vùng đồi trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biển
phát hiện chỉ có 8 loài. Những loài mòng phổ biến ở tất cả các vùng là:
Tabanus rubidus, T. striatus, Chrysops dispar, Chrysozoma assamensis.
14
Phan Địch Lân (1994 - 2004) [9] cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm
thấy hai loài mòng T. rubidus và T. striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ
15,2% và 14,0%; ruồi hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ
lệ 12,5%. Ở những vùng đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mòng
hút máu dễ dàng tìm thấy tiên mao trùng. Sau khi theo máu vào vòi hút ruồi và
mòng, tiên mao trùng vẫn sống đến giờ thứ 53, thời gian hoạt động mạnh nhất
là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34 trung bình là 24giờ. Sự hoạt động của tiên
mao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42. Từ 46 - 53 giờ thì tiên mao trùng
ngừng hoạt động.
Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian:
từ 1 - 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao trùng có
hình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ: tiên mao
trùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động.
Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau
khi xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến
thứ 5, tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự
như khi truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7
chỉ còn 30% số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và
thời gian chết của chuột cũng dài. Điều này có thể giải thích là do độc lực của
tiên mao trùng giảm dần và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh
cũng giảm dần sau khi chúng xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus.
1.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh
Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao
trùng và đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu,
giảm sức đề kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất.
Phan Địch Lân (1994 - 2004) [9] đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172
trâu ở các tỉnh đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,l
15
%), trâu 3 - 5 tuổi nhiễm cao hơn (lo 6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao
nhất (12,9 - 14,8%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3
- 8 năm tuổi.
Theo Phan Văn Chinh (2006) [3], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở
4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm
tuổi (6,92% và2,31%). Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng
ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9). Thời gian này điều kiện sinh thái
thuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển, hoạt động mạnh. Hút máu súc vật
và truyền tiên mao trùng.
Theo Luckins (1988), sự xuất hiện lượng lớn ruồi, mòng trong mùa
mưa nóng ẩm luôn có liên quan đến tình hình dịch tễ bệnh tiên mao trùng ở
trâu, bò, dê, lạc đà. Từ cuối mùa thu, mùa đông và đầu mùa xuân, trâu bò
nhiễm tiên mao trùng phải sống trong điều kiện thời tiết lạnh, thiếu thức ăn
nên sức đề kháng giảm, bệnh thường phát ra vào thời gian này và trâu bò bị
đổ ngã hàng loạt. Tiên mao trùng có sức đề kháng yếu, dễ chết khi tiếp xúc
với nước cất, cồn và thuốc sát trùng.
Theo Tamasan Kas R (1992): bò ở Guaico nhiễm T. evansi từ 11 –
74%, bò dưới 12 tháng nhiễm 21,04%; bò trên 25 tháng nhiễm 72,92%; bò
Zebu cao sản nhiễm 74,4%.
Cũng năm 1992, Tperone M. C và cs kiểm tra bò ở Venezuela thấy: bò
dưới 3 tháng nhiễm T. evansi 13% và bò trên 36 tháng nhiễm 50%.
1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
1.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý
Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò,
ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da. Theo có
thể quan sát được phản ứng viêm ở da của thỏ, cừu, dê và bò gây nhiễm thực
nghiệm tiên mao trùng, kích thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao
16
trùng được tiêm truyền (ước chừng khoảng 108 tiên mao trùng có thể gây
viêm da - ở vị trí tiêm truyền), một số lượng lớn tiên mao trùng phát triển ở
tại chỗ viêm này.
Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong
bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia
theo chiều dọc. Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng
như nhau. Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày. Biểu đồ sóng tiên mao
trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt
sóng yếu. Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên
mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng. Mỗi
đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể
tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tục
sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng thể đặc
hiệu với chúng.
Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose và các
chất đạm, chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩm
thấu qua bề mặt cơ thể để duy trì hoạt động và sinh sản. Ở súc vật bị bệnh,
trong 1 ml máu có thể có 10.000 - 30.000 tiên mao trùng. Với số lượng nhiều
như vậy, tiên mao trùng chiếm đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh
gây còm, thiếu máu và mất dần khả năng sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng
sinh sản và giảm sức đề kháng với các bệnh khác.
Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin,
độc tố này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá
trình sống và độc tố do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau
15 - 30 ngày. Độc tố của tiên mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ương
làm rối loạn trung khu điều hoà thân nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt,
lúc hết sốt xen kẽ nhau). Khi sốt thường có rối loạn về thần kinh (kêu rống,
17
run rẩy, ngã vật xuống). Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức chế cơ quan tạo
máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần. Độc tố còn tác động tới bộ
máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy
thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh.
Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc
các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ
thũng chất keo vàng dưới da.
1.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa
* Ở trâu, bò:
Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:
- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền
tiên mao trùng, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,7
0
C) kéo dài 2 - 4
ngày rồi giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên. Thời gian gián đoạn giữa
hai cơn sốt dài hay ngắn tuỳ theo thể trọng con vật. Khi sốt, kiểm tra máu
thường thấy tiên mao trùng.
- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện
hội chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạy
vòng quanh kêu rống lên. Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn
ngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như trâu bị cảm nắng. Sau 20 -
30 phút con vật lại đứng dậy đi lại được. Những trâu bò mắc bệnh có triệu
chứng lâm sàng như trên thường là mắc bệnh ở thể cấp tính.
Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân
sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và
nhai lại cho đến khi sắp chết.
- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như
ở bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục.
18
- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu,
bò bệnh. Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng đỏ
ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng (củi nhãn) kéo che kín giác mạc.
- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng,
màu vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp
theo những cơn sốt cách quãng. Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thường dai
dẳng và con vật vẫn ăn được.
- Gầy yếu, suy nhược: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ
sau 7 – 14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu. Nếu bệnh
kéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc
mắt nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng
cày kéo và sinh sản. Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu,
bò dễ chết. Trong thực tế, có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm
việc bình thường khi được chăm sóc nuôi dưỡng tốt.
Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T. evansi gây ra. Theo
Silva Rams và cs (1995), Smith R. D. (1995), số lượng hồng cầu và hàm
lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch cầu thay
đổi: bạch cầu lymphô, bạch cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính giảm,
protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt.
* Ở ngựa
Sau khi ruồi, mòng hút máu và truyền T. evansi, ngựa phát bệnh sau 1 -
2 tuần. Triệu chứng rõ nhất là ngựa sốt 40 - 41
0
C, sốt gián đoạn, khi sốt có
tiên mao trùng ở máu ngoại vi. Khi bị bệnh nặng, ngựa thường sốt cao đột
ngột, các triệu chứng khác chưa kịp thể hiện thì con vật đã lăn lộn điên cuồng
rồi chết. Thể bệnh cấp tính diễn ra khoảng 1 - 3 tuần, thể mãn tính kéo dài 2 -
4 tháng (tuy nhiên, thể mãn tính thường ít gặp).
19
Hiện tượng thuỷ thũng xuất hiện ở vùng thấp của cơ thể (ngực, bụng,
âm hộ, vú) sau 1 - 2 tuần kể từ khi phát bệnh. Ngựa đi đứng xiêu vẹo, gầy sút
rất nhanh, ăn kém, da khô, lông dựng, bốn chân run rẩy, hay nằm, dần dần liệt
chân, nằm một chỗ rồi chết.
1.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng
Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có
những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão,
xoang bao tim tích nước vàng; phổi xung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan
sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và có
tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và
xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt; có những đám keo nhầy vàng dưới vùng
da thuỷ thũng.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò,
ngựa không phải lúc nào cũng phát hiện được. Rất nhiều gia súc mang bệnh
nhưng khó phát hiện các triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc
mắc bệnh tiên mao trùng mãn tính. Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính,
các biểu hiện bệnh đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên
loạn) và chết nhanh. Trâu bị bệnh mãn tính có thể thấy triệu chứng: sốt gián
đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân
sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]). Triệu chứng sẩy thai có thể
thấy ở trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng (Nguyễn Đăng Khải, 1995 [6];
Kashiwazaki, 1998).
1.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm
Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí
nghiệm, mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc. Tùy từng
20
trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp
hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao.
* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:
Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương
pháp sau:
- Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi;
vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi. Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến
kính đã có sẵn 1 giọt EDTA 1%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men
lên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ
phóng đại 10 x 10 và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống.
- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)
+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng
một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính
khoảng 1 - 1,25 cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn
Methanol, nhuộm Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat
Buffered Saline) pH = 7,2] trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy
mạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng,
do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều
loài tiên mao trùng cùng một lúc.
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm,
dùng la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn
Methanol trong 2 phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml
dung dịch PBS pH = 7,2). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô, soi
dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái
các loài tiên mao trùng khác nhau.
21
+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl
Sulfat) là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng
được phát hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da
và tránh hút bằng pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong
nhiều tháng (Van Meirvenne, 1989).
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng
ống Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (WOO, 1971):
cho máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt
kín bằng chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly âm với tốc độ 14.000
vòng/phút trong 5 phút. Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị
trí tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phương
pháp xem tươi và nhuộm Giemsa. Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao.
Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground:
dùng cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết
tương và hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men và
kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:
Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng
dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Phương pháp này
có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi
nhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm. Song, nhược điểm của
phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với
số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng
được (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [11]; Đoàn Văn Phúc và cs, 1994 [13]).
22
* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc
kháng nguyên tiên mao trùng. Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu.
- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng
Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu
chống lại tiên mao trùng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng
thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:
+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination
Test): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối
sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao
trùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20
hoặc 10 x 40). Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-).
Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng.
+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có
trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T. evansi
gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên
bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể.
Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích
là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại
kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt
(epitop surface). Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm
thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng
nguyên. Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệu
kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên
kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại. Kết quả là các hạt latex
23
cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể quan sát
bằng mắt thường. Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng nguyên bề mặt
được tinh chế từ chủng T. evansi không nhuộm màu.
Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng
dụng ở cơ sở. Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phương pháp này
cho kết quả dương tính cả khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồn
tại trong huyết thanh; mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMT
trong huyết thanh chưa có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phương pháp
LATEX sẽ cho kết quả âm tính.
* Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)
Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng
thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu
động vật nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với kháng
thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng
nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều. Cho vào lọ
kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml
dung dịch buffer, lắc đều. Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ
cần chẩn đoán (1/8). Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha
loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng
vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45µl). Sau đó
cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn. Dùng
que nhựa trộn đều. Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và
đánh giá kết quả
* Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect
Fluorescent Antibody Test) Phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc
24
hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thực
địa. Ngoài việc được dùng làm phản ứng chuẩn để so sánh với các phương
pháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT còn được dùng trong nghiên cứu
các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins, 1988 [23]; Davison,
1999 [24]).
Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu
bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu bò khoẻ
mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh.
Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu và cs (1994)
[20] đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng. Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho
phản ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng ớ 1/40. Theo Lương Tố Thu
và Lê Ngọc Mỹ (1996) [12], độ nhạy của phương pháp IFAT là 71,25.
Để tinh chế kháng nguyên T. evansi dùng trong phản ứng miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu bò, Vương
Thị Lan Phương (2004) [15] đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T. evansi
phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6
mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT (Variable
Antigenic Type) và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác
nhau. Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch,
tác giả đã xác định được sự thay đổi kháng nguyên bề mặt của T. evansi: đa
số các VAT của các kho kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8
VAT/26 VAI có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với
các VAT của các kho kháng nguyên khác. Các VAT trội xuất hiện sớm
trong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên
cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán. Từ đó, tác giả đã tinh chế
kháng nguyên theo phương pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản
25
ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho
độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)
Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất
được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng Globulin (kháng
kháng thể) có mang một enzym (phosphatase hoặc Peroxydase) được gắn trên
mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó, cho
cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạo
nên màu. So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của
phản ứng.
Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế
giới. Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [12] đã bước đầu chế kháng nguyên
tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta.
* Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng
- Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)
Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát
hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh. Phản ứng
dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng. Lê Ngọc Mỹ và cs
(1994) [12] đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên
mao trùng ở Việt Nam. Tuy nhiên, theo cơ quan năng lượng nguyên tử thế
giới (IAEA) (1997), phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhạy kém hơn
so với các phương pháp phát hiện tiên mao trùng cổ điển. Vì vậy, phương
pháp này đã không được phổ biến trong thời gian hiện tại và tương lai (IAEA
đã không sản xuất đĩa Ag - ELISA cho nhiều nước trên thế giới).
- Phản ứng Suratex:
Phản ứng Suratex là phản ứng ngưng kết giữa các hạt latex được gắn
kháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×