Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng vitamin D (D2 và D3 ) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)



Viện Dinh Dỡng
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP
*****************








Báo cáo kết quả nghiên cứu
Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm
lợng vitamin D (D
2
và D
3
) trong thực
phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC)




Chủ nhiệm đề tài : Ks. Đoàn Thị Hờng






6544
20/9/2007



Hà nội, 2007




Viện Dinh Dỡng
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP
*****************







Báo cáo kết quả nghiên cứu
Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm
lợng vitamin D (D
2
và D
3
) trong thực
phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng


hiệu năng cao (HPLC)







Chủ nhiệm đề tài: Ks. Đoàn Thị Hờng
Các cán bộ tham gia: C n. Nguyễn Thu Hằng
Cơ quan chủ trì: Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP
Cơ quan chủ quản: Viện dinh dỡng
Kinh phí: 20 triệu đồng (Nguồn NNS)







Hà nôi, 2007

Mục lục

TT Nội dung Trang
1
Danh mục các chữ viết tắt
2
Danh mục các bảng
3
Danh mục các hình
4
Phần 1: Mở đầu
1
5
Phần 2: Tổng quan
3
6
Phần 3: Mục tiêu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
8
1. Mục tiêu 8
2. Đối tợng 8
3. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu 8
4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao áp 9
5. Các phơng pháp định lợng bằng HPLC 11
6. Quy trình phân tích thử nghiệm 13
7
Phần 4: Kết quả nghiên cứu
17
1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 17
2. Xác định LOD 28
3. Xác định LOQ 28
4. Xác định khoảng tuyến tính 29
5. Xác định độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên 32
6. Xác định độ thu hồi 35
7. Một số sắc đồ chạy sắc ký của mẫu phân tích 37
8
Phần 5: Nhận xét và bàn luận kết quả
39
9
Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm lợng vitamin D
trong thực phẩm bằng phơng pháp HPLC
41
10
Phần 7: Tài liệu tham khảo
45
11
Phần phụ lục: Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D
2

và D
3
xây dựng khoảng tuyến tính


các chữ viết tắt




TT
Các chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt
1 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
2 DAD Detector mảng diôt
3 UV-VIS Quang phổ tử ngoại - khả kiến
4 RDA Nhu cầu ăn khuyến cáo
5 TCVN Tiêu chuẩn Việt nam
6 AOAC Hiệp hội phân tích hoá học
7 LOD Giới hạn phát hiện
8 LOQ Giới hạn định lợng
9 SD Độ lệch chuẩn
10 Cv Hệ số biến thiên
11 MeOH Methanol
12 THF Tetra hydrofuran
13 ACN Acetonitril
14 SPE Cột chiết pha rắn
15 TBHQ Tert butyl hydroquinol

Danh mục các bảng


TT Nội dung bảng

Bảng 1
Thời gian lu của vitamin D
2
và D
3
đối với điều kiện chạy cột
Waters RP- 18, detector DAD, bớc sóng 265nm, pha động
MeOH: H
2
O = 98: 2, tốc độ dòng 1ml/phút
Bảng 2
Thời gian lu của vitamin D
2
chạy cột Inertsil ODS 3 và cột
Waters RP18, detector DAD bớc sóng 265nm, pha động ACN :
MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút.
Bảng 3
Nhận xét các sắc đồ của hai chất chuẩn đối với cột Inertsil
ODS 3
detector DAD bớc sóng 265nm, Pha động ACN : H2O =75:25,
tốc độ dòng 1ml/phút
Bảng 4
Nhận xét kết quả chạy sắc ký hai chuẩn trên cột Inertsil ODS 3
pha động ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD bớc sóng
265nm, tốc độ dòng 1ml/phút.
Bảng 5
Thời gian lu của hai chất chuẩn tơng ứng với pha động khác
nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm
Bảng 6
Thời gian lu của hai chất ứng với tốc độ dòng khác nhau trên hệ
pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm,
cột Inertsil ODS 3
Bảng 7
Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D
Bảng 8
Tơng quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn của vitamin D
2

Bảng 9
Tơng quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn vitamin D
3

Bảng 10
Xác định hàm lợng vitamin D
2
mẫu sữa bột XO
Bảng 11
Xác định hàm lợng vitamin D
3
trong sữa Sunny grow baby
Bảng 12
Xác định hàm lợng vitamin D trong sữa chua nestlé có đờng
Bảng 13
Xác định hàm lợng vitamin D
3
trong sữa Kappi hộp 100ml
Bảng 14
Xác định hàm lợng vitamin D
3
trong sữa bột giầu năng lợng
Bảng 15
Xác định hàm lợng vitamin D trong sữa đặc có đờng
Bảng 16
Kết quả hàm lợng vitamin D trong một số mẫu khác
Bảng 17
Độ thu hồi của vitamin D
3

Bảng 18
Độ thu hồi của vitamin D
2

Bảng 19
Kết quả phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP
4
vật liệu chuẩn
Bảng 20
Tổng hợp các thông số thẩm định

Danh mục các hình



TT
Nội dung các hình

Phần tổng quan
Hình 1 Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D
2
và D
3

Hình 2 Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể

Phần mục tiêu, đối tợng và phơng pháp
Hình 3 Mô tả quá trình chạy sắc ký
Hình 4 Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC
Hình 5 Đồ thị phụ thuộc diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ

Phần kết quả nghiên cứu

* Khảo sát điều kiện chạy
Hình 6 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector
DAD bớc sóng 265nm, pha động MeOH: H
2
O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút
Hình 7 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D
2
Hình 8 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,08ppm, cột Waters, detector
DAD bớc sóng 265nm, pha động MeOH: H
2
O = 98:2, tốc độ 1ml/
phút
Hình 9 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D
3

Hình 10 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector
DAD bớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ
dòng 1ml/ phút
Hình 11 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,04ppm, cột Inertsil ODS 3,
detector DAD bớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25,
tốc độ 1ml/ phút
H×nh 12 S¾c ®å chuÈn vitamin D
3
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 13 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 14 S¾c ®å chuÈn vitamin D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 15 S¾c ®å chuÈn vitamin D
3
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 16 S¾c ®å hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng
ACN: MeOH = 50:50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 17 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10, tèc ®é
1ml/ phót
H×nh 18 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é
dßng 1,2 ml/ phót
H×nh 19 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é
dßng 1,5 ml/ phót
H×nh 20 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H
2
O = 93:2:5 tèc
®é dßng 1 ml/ phót
H×nh 21 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H
2
O = 93:2:5 tèc
®é dßng 1,2 ml/ phót
H×nh 22
S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H
2
O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1,5
ml/ phót.
Hình 23 Sắc đồ vitamin D
2
, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bớc sóng
265nm, pha động
MeOH: THF: H
2
O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút
Hình 24 Sắc đồ vitamin D
3
, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bớc sóng
265nm, pha động
MeOH: THF: H
2
O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút

* Xác định khoảng tuyến tính
Hình 25 Đờng chuẩn vitamin D
2

Hình 26 Đờng chuẩn vitamin D
3


* Sắc đồ chạy mẫu
Hình 27 Sắc đồ xác định hàm lợng vitamin D trong sữa tuơi Kapi
Hình 28 Sắc đồ chạy mẫu sữa tơi xác định hàm lợng vitamin D
2

Hình 29 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D
3

Hình 30 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D
3


Phần phụ lục:
Các sắc đồ dung dịch chuẩn xây dựng khoảng tuyến tính
Hình 31 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,0022ppm
Hình 32 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,02ppm
Hình 33 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,041ppm
Hình 34 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,082ppm
Hình 35 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,165ppm
Hình 36 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,33ppm
Hình 37 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,0068ppm
Hình 38 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,068ppm
Hình 39 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,137ppm
Hình 40 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,274ppm
Hình 41 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,392ppm
Hình 42 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,5ppm

Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 1/46
Phần 1: Mở đầu

Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần
đợc cung cấp đủ các chất dinh dỡng, nguồn cung cấp các chất này có
nhiều trong thực phẩm ăn vào hàng ngày. Các chất dinh dỡng chính là các
nhóm cung cấp năng lợng cho cơ thể nh glucid, lipid, protein, nhóm cung
cấp muối khoáng, nhóm cung cấp các loại vitamin và nớc. Theo quan
điểm của các chuyên gia dinh dỡng hiện nay trên thế giới mà chúng ta
đang sống tồn tại hai thái cực khác nhau, một bên là vực thẳm của sự thiếu
ăn và một bên là vực thẳm của sự thừa ăn. Sự thiếu ăn đã dẫn đến tình trạng
suy dinh dỡng do thiếu năng lợng protein, tuy nhiên với sự phát triển của
nền khoa học tiến tiến trên thế giới đời sống của ngời dân ở hầu hết các
nớc đã đợc cải thiện, không ngừng nâng cao. ở Việt nam với sự hỗ trợ
của các chơng trình phòng chống suy dinh dỡng, chơng trình VAC và
cuộc cách mạng xanh trong ngành nông nghiệp đã góp phần to lớn trong
việc tăng cờng an ninh thực phẩm quốc gia, vấn đề đói ăn không còn là
điều bức xúc. Hàng năm tỷ lệ suy dinh dỡng đã giảm đi một cách đáng
kể Tuy nhiên vấn đề dinh dỡng mới nảy sinh đó là các bệnh mãn tính
liên quan đến dinh dỡng đang là mối quan tâm của nhiều ngời. Khái
niệm thực phẩm chức năng (thực phẩm chữa bệnh) đã trở nên quen thuộc
dần với mọi ngời dân. Hiện nay để giải quyết vấn đề này trên thế giới cũng
nh trong nớc đã xuất hiện nhiều loại thực phẩm chữa bệnh, thực phẩm bổ
sung vi chất dinh dỡng phục vụ cho bệnh nhân liên quan. Có thể coi thực
phẩm chức năng, vai trò của thực phẩm đối với bệnh mãn tính là hớng tiếp
cận rất mới trong ngành dinh dỡng, thức ăn là thuốc, thuốc là thức ăn [16].
ở Nhật bản cho đến nay đã có khoảng hơn 192 sản phẩm đợc gọi là thực
phẩm chức năng nhằm góp phần vào duy trì, cải thiện chế độ ăn và sức
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 2/46
khoẻ [16]. Một trong số các vi chất rất quan trọng đã đợc bổ sung vào thực
phẩm đó là các loại vitamin.
Vitamin là những chất không sinh năng lợng nhng không thể thiếu
đợc đối với sự tồn tại, phát triển của mỗi cơ thể sống. Vitamin có vai trò
tạo ra các coenzim cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá khác nhau. Tất
cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều có sự
tham gia trực tiếp của vitamin [14]. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là từ
thức ăn. Khi thiếu vitamin cơ thể sẽ mắc phải một số bệnh lý, nh thiếu
vitamin A dễ dẫn tới bệnh mù loà, thiếu vitamin B1 dễ bị bệnh tê phù, thiếu
vitamin PP bị bệnh pellagra, thiếu vitamin D bị bệnh về xơng [17]. Hiện
nay một thực tế khắc nghiệt đã xảy ra ở các nớc đang phát triển là phải
đơng đầu với gánh nặng kép giã bệnh nhiễm trùng, tử vong trẻ em và
thiếu dinh dỡng với các bệnh mãn tính không lây liên quan đến dinh
dỡng [16]. Thực tế đã cho thấy thiếu vi chất dinh dỡng đã góp phần
không ít trong gánh nặng kép này. Vì vậy vai trò thực phẩm đợc đánh giá
vô cùng quan trọng, việc nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chức năng đã
đang trở thành trào lu mang tính toàn cầu. Nói đến thực phẩm chức năng
chúng ta không thể nói đến thực phẩm bổ sung vitamin D, một loại vitamin
khá quan trọng để phòng chống bệnh còi xơng ở trẻ em, loãng xơng ở
ngời lớn, hạ calci máu và một số bệnh ngoài da
Hiện nay trên thị trờng có rất nhiều loại sữa, bột dinh dỡng, bánh
quy có bổ sung viatmin D. Với lý do trên, đề tài này chúng tôi hy vọng
chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D bằng phơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong một số loại thực phẩm nh sữa
chua, sữa bột, sữa nớc, bánh quy, bột dinh dỡng để đa ra quy trình phân
tích phù hợp, nhằm đánh giá đúng chất lợng, giá trị dinh dỡng thực của
các sản phẩm thực phẩm.
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 3/46
Phần 2: Tổng quan

1. Nguồn gốc và tính chất của vitamin D
VitaminD là chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không
tan trong nớc, hoà tan trong dầu mỡ, tan trong dung môi hữu cơ nh
ethanol, chlorofoc, methanol. Tên gọi khác của vitamin D là calciferol.
Vitamin D là một nhóm gồm từ D
2
đến D
7
song có hai hoạt tính mạnh nhất
là vitamin D
2
còn gọi Ergocalciferol và vitamin D
3
còn gọi Cholecalciferol.
Cholecalciferol - C
27
H
44
O Ergocalciferol - C
28
H
44
O

Vitamin D
3


Vitamin D
2

Hình 1: Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D
2
và D
3

Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn nguồn gốc động vật nh trứng,
cá, đặc biệt dịch chiết từ gan cá, bơ, sữa, thịt
Trong cơ thể ngời vitamin D
3
(Cholecalciferol) đợc tổng hợp từ 7
dehydrocholesterol ở dới da nhờ ánh sáng tử ngoại.
Vitamin D
2
(Ergocalciferol) đợc tổng hợp từ ergosterol có trong nấm và
men bia.
Nói chung, hoạt tính sinh học của hai loại vitamin D
2
và vitamin D
3

không có sự khác nhau nhiều. Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan và
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 4/46
thận tạo ra chất chuyển hoá có hoạt tính là 1,25- dihydroxycholecalciferol
nhờ enzim hydroxylase [14].

Hình 2
: Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể ngời

Trong da
Trong gan
Trong thận
Dạng hoạt động
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 5/46
2. Tác dụng của vitamin D
- Vitamin D tham gia vào quá trình tạo xơng nhờ tác dụng chuyển hoá các
chất vô cơ chủ yếu là calci và phosphat, làm tăng hấp thu calci và phosphat
ở ruột, tham gia vào quá trình calci hoá sụn nên nó rất cần cho sự phát triển
xơng ở trẻ em.
- Làm điều hoà calci trong máu, ức chế tế bào sinh ung th.
- Khi thiếu vitamin D ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci
máu giảm gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi xơng chân vòng kiềng, chậm
biết đi, chậm kín thóp, nguời lớn bị loãng xơng, xốp xơng, xơng tha dễ
gẫy, phụ nữ có thai thiếu vitamin D dễ sinh ra trẻ khuyết tật ở xơng [14].
- Nguyên nhân của sự thiếu vitamin D là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do
ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, do rối loạn chuyển hoá, do nhu cầu cao ở
phụ nữ có thai và cho con bú
-Tuy nhiên dùng vitamin D quá liều cũng gây ra chứng tăng calci máu, tăng
calci niệu, đau nhức xơng khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, có thể gây suy
nhợc, mệt mỏi, đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, giòn xơng [14].
Theo công trình nghiên cứu khảo sát tác dụng của vitamin D đối với
bệnh ung th ở bang Chicago trong 19 năm các tác giả nhận thấy tỷ lệ ung
th kết tràng ở nam giảm 55% nếu hàng ngày đợc bổ sung vitamin D là
3,75mcg [18]. Theo nghiên cứu của Danson - Hughes và các cộng sự tiến
hành trên đối tợng phụ nữ đợc bổ sung vitamin D 400 IU/ ngày và nhóm
phụ nữ khác không đợc bổ sung, cả hai nhóm đều có lợng vitamin D ăn
vào hàng ngày là 100 IU. Nhận thấy nhóm đối chứng bị giảm đáng kể mật
độ khoáng trong xơng so với nhóm đợc bổ sung [18]. Năm 1989 theo
khuyến cáo của uỷ ban dinh dỡng Hoa kỳ (RDA) vitamin D cần bổ sung
là 10mcg/ ngày ở tuổi từ 51- 70 và 15mcg / ngày ở tuổi cao hơn [18]. Theo
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 6/46
nghiên cứu của trờng Y Harvard đợc đăng trên tạp chí của hiệp hội y học
Mỹ cho thấy vitamin D có thể giúp giảm nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng.
Các nhà nghiên cứu đã so sánh lợng vitamin D ở 257 mẫu huyết tơng
trong số hơn 7 triệu mẫu của nhân viên quân đội Mỹ, họ phát hiện rằng
ngời da trắng nhóm có hàm lợng vitamin D cao nhất có nguy cơ mắc
bệnh đa xơ cứng thấp nhất. Bệnh đa xơ cứng là bệnh mãn tính của hệ thần
kinh, bắt đầu với các triệu chứng nh mất trí nhớ, suy nhợc, mệt mỏi, đau
đớn hoặc liệt, chóng mặt và sau đó ảnh hởng tới tim mạch.
3. Tình hình nghiên cứu trong nớc và trên thế giới
Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, với sự
bùng nổ của ngành công nghệ thông tin, hiện nay hàng loạt các hệ thống
máy phân tích hoá học đã đợc cải tiến nâng cấp, nhằm xác định nhiều loại
chất hoá học và đồng thời nâng cao độ nhạy của phép phân tích cũng nh
độ lặp lại của kết quả kiểm nghiệm. Trên thế giới nhiều nhà phân tích hoá
học đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lợng vitamin D trong
thực phẩm nh thịt, cá, sữa, trong máu Đó là nghiên cứu hàm lợng
vitamin hoà tan trong chất béo của mẫu sữa chua bằng phơng pháp HPLC
với detector PDA của M.M Delgado Zamarreno, A. Sanchez Perez của
trờng đại học Salamanca Tây ban nha đã đa ra các yếu tố ảnh hởng đến
quá trình phân tích vitamin A, E, D nh điều kiện thuỷ phân, tách các chất
trong khi xử lý mẫu, kết quả của nghiên cứu này đa ra độ thu hồi vitamin
D
3
là 91 5% với hàm lợng vitamin D
3
trong mẫu là 0,09 mcg/100g
5% [11]. Theo nghiên cứu công bố trên Food Chemistry Vol.57, No.1. 95-
99, 1996 ở Anh các nhà nghiên cứu đa ra cách xử lý mẫu, điều phân tích
xác định hàm lợng vitamin D trong thực phẩm, kết quả nghiên cứu này
cho thấy hệ số biến thiên sau khi làm lặp lại ba lần đối với vitamin D
3
và D
2
là <10%, độ thu hồi của phơng pháp là 90 -110% với D
2
và D
3
, giới hạn
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 7/46
phát hiện là 1,5-2 ng [12]. Trong công trình nghiên cứu đăng trên tạp chí
Chromatography A của bộ môn thực phẩm, dinh dỡng Đại học Georgia
Athens Mỹ, bộ môn Dinh dỡng trên ngời và khoa học thực phẩm trờng
Bách khoa Virginia ngày 26 tháng 1 năm 1998 đã đa ra điều kiện và yếu
tố ảnh hởng quá trình phân tích hàm lợng vitamin A, E, D trong thức ăn
động vật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Nghiên cứu này cho thấy độ thu
hồi của phơng pháp là 93-107% [19]. Trong bài báo của tạp chí Food
composition and analysis 16 (2003) có công trình nghiên cứu hàm lợng
vitamin D
3
và 25 hydroxyvitamin D
3
trong thịt lợn tơi và thịt lợn chín, đã
đa ra kết quả nồng độ vitamin D
3
đối với thịt tơi là từ 0,05 đến 0,21
mcg/100g với thịt chín là 0,07-0,14 mcg/100g. Sau khi làm 49 thí nghiệm
lặp lại họ đã đa ra hệ số biến thiên là 7,0%, làm 51 thí nghiệm khác hệ số
biến thiên là 7,3% [7]. Ngoài ra còn nhiều công trình nghiên cứu xác định
hàm lợng vitamin D trong máu và huyết thanh, trong thực vật Một số
nghiên cứu đã đa ra hàm lợng vitamin D trong cá thu là 15mcg/100g,
trong gan bò 1mcg/100g, trong trứng gà 2mcg/100g, trong nấm rơm là
2mcg/100g [8].
Hiện nay ở Việt nam chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D
trong thực phẩm cha đợc làm nhiều, trong bảng thành phần thức ăn Việt
nam cha đề cập đến hàm lợng vitamin D. Trong danh mục tiêu chuẩn
Việt nam (TCVN) chúng tôi cũng cha thấy một quy trình chuẩn nào để
xác định hàm lợng vitamin D bằng HPLC, vì vậy sau khi tham khảo các
tài liệu cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D
trong một số loại thực phẩm bằng HPLC.


Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 8/46
Phần 3
Mục tiêu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu.

1. Mục tiêu
Nh đã đề cập trong phần tổng quan mục tiêu đề tài chúng tôi chọn
là chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D (D
2
và D
3
) trong
thực phẩm bằng phơng pháp HPLC
2. Đối tợng
Trong khuôn khổ tổng kinh phí của đề tài là 20 triệu đồng, chúng tôi
chỉ có khả năng tiến hành trên đối tợng thực phẩm là mẫu sữa bột, sữa
chua, sữa đặc, bánh quy và siro
3. Nội dung và phơng pháp
Để đáp ứng với mục tiêu nói trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau đây:
- Khảo sát điều kiện chạy dung dịch chuẩn vitamin D
2
và vitamin D
3

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD)
- Xác định giới hạn định lợng (LOQ)
- Xác định khoảng tuyến tính
- Xác định độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (Cv %)
- Xác định độ thu hồi (R %)
Sau khi tham khảo các tài liệu [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 13] chúng tôi nhận
thấy để phân tích hàm lợng vitamin D trong thực phẩm có nhiều phơng
pháp khác nhau. Trớc đây thờng sử dụng phơng pháp sinh học, phơng
pháp hoá học tạo phản ứng lên màu rồi tiến hành đo quang, song ngày nay
với sự phát triển của hệ thống sắc ký thì hầu nh các nớc trên thế giới đã
chọn phơng pháp HPLC để xác định. Hiện nay phòng thí nghiệm chúng
tôi có hai hệ thống HPLC với các detector huỳnh quang, detector UV,
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 9/46
detector PDA và các thiết bị phụ trợ khác nh máy cất quay, máy lọc hút
chân không đáp ứng tốt cho việc phân tích nên chúng tôi đã chọn phơng
pháp này để nghiên cứu. Đây là phơng pháp có nhiều u điểm và hiện nay
đợc nhiều nhà phân tích lựa chọn.
4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao
4.1 Nguyên lý:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp, kỹ thuật
phân tích dựa trên cơ sở sự tách các chất trên pha tĩnh chứa trong cột nhờ
dòng chuyển động của chất lỏng (pha động) dới áp suất cao. Pha tĩnh có
thể là chất rắn hoặc chất lỏng đợc phủ trên chất mang. Chất phân tích đợc
ghi nhận bởi bộ phận phát hiện dới dạng các pic trên sắc đồ.


Hình 3
: Mô tả quá trình chạy sắc ký
4.2 Hệ thống HPLC:
Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận chính đợc mô tả dới đây.
Rửa giải qua cột
Quá trình sắc ký
Sắc đồ
Pha động
Pha tĩnh
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 10/46


Hình 4: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động.
2: Bơm cao áp
3: Van bơm mẫu.
4: Cột sắc ký
5: Bộ phận phát hiện Detector
6: Bình chứa dung môi thải
7: Hệ thống máy tính ghi dữ liệu phân tích.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector mảng diod (DAD) và
chạy sắc ký pha ngợc (pha động phân cực, pha tĩnh ít phân cực) để xác
định hàm lợng vitamin D.

1
2
3
4
5
6
7
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 11/46
5. Các phơng pháp định lợng bằng HPLC
Các phơng pháp định lợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc
nồng độ của chất tỷ lệ với diện tích hay chiều cao pic.
* Có 4 phơng pháp định lợng thờng đợc lựa chọn đó là
- Phơng pháp chuẩn ngoại
- Phơng pháp chuẩn nội
- Phơng pháp thêm chuẩn
- Phơng pháp chuẩn hoá diện tích
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phơng pháp chuẩn ngoại để phân tích.
Phơng pháp chuẩn ngoại là phơng pháp định lợng cơ bản trong đó
dung dịch chất chuẩn và mẫu thử đợc tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện. Sau đó so sánh diện tích pic hoặc chiều cao của mẫu thử với diện tích
pic hoặc chiều cao dung dịch chất chuẩn để tính nồng độ chất có trong mẫu.
Có thể dùng phơng pháp chuẩn hoá một điểm hoặc nhiều điểm.
* Chuẩn hoá một điểm (phơng pháp so sánh):
Chọn nồng độ dung dịch chất chuẩn gần bằng nồng độ mẫu thử, tính theo
công thức sau.
S
C
SC
s
s
xx
=

Trong đó: C
x
nồng độ mẫu thử.
C
s
nồng độ dung dịch chất chuẩn
S
x
diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử
S
s
diện tích hoặc chiều cao pic dung dịch mẫu chuẩn

Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 12/46
* Chuẩn hoá nhiều điểm:
Chuẩn bị dãy dung dịch các chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến
hành chạy sắc ký. Vẽ đồ thị liên quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với
nồng độ mỗi chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đờng chuẩn để tính
nồng độ các chất cần xác định. Thực hiện việc tính toán này theo hai cách
- áp diện tích hoặc chiều cao pic vào đờng chuẩn để suy ra nồng độ của
chất trong mẫu.






Hình 5
: Đồ thị tơng quan diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ.
- Xây dựng phơng trình hồi quy tuyến tính Y= a + b C
Trong đó :
Y Diện tích hay chiều cao pic
a Giao điểm của đờng chuẩn với trục tung.
b Độ dốc của đờng chuẩn
C

Nồng độ của chất thử
Dựa vào phơng trình đờng chuẩn để tính nồng độ chất thử. Chú ý độ lớn
diện tích hay chiều cao píc của chất thử phải nằm trong đờng chuẩn.

C
nồng độ

S
diện tích
Y= a + b
C

Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 13/46
6. Quy trình phân tích thử nghiệm
Sau khi đã tham khảo các tài liệu chúng tôi đã thống nhất xây dựng
quy trình phân tích dự kiến và sử dụng các hoá chất thiết bị nh sau phù
hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
6.1 Nguyên lý của phơng pháp
Mẫu đợc xà phòng hoá bởi dung dịch kali hydroxit trong môi
trờng ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc xà phòng nóng ở nhiệt độ
75
o
C trong 1 giờ. Sau đó các chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin
D) đợc chiết bằng ete dầu hoả. Vitamin D đợc xác định bằng cách làm
sạch dịch chiết rồi bơm vào cột sắc ký và phát hiện bằng detector DAD ở
bớc sóng 265nm.
6.2 Hoá chất sử dụng
- Dung môi methanol của Merck loại dùng cho HPLC.
- Dung môi tetra hydrofuran THF của Merck.
- Dung môi ethanol loại PA của Trung quốc.
- Dung môi ete dầu hoả loại PA của Trung quốc (30-60).
- Dung dịch muối natri clorid 5% loại PA của Trung quốc.
- Chuẩn cholecalciferol của Merck.
- Chuẩn ergocalciferol của Merck.
- Dung môi ethanol tuyệt đối loại PA của Merck.
- Chất chống ô xi hoá Tert butyl hydroquinol (TBHQ) PA của Trung quốc



Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 14/46
6.3 Thiết bị và dụng cụ
- Hệ thống HPLC của Thermo Finnigan với detector DAD
- Cột Inertsil ODS -3, 5àm, 250 x4,0 mm của Japan
- Cột tách chiết ODS 2 của Waters Spherisorb 5àm; 4,0 x150mm
- Cân phân tích XT 220 của Thuỵ sĩ độ chính xác 10
- 4
g
- Máy quang phổ UV-VIS của Nhật
- Máy cất quay chân không loại Eyela của Nhật.
- Bộ phận hút chân không cho cột làm sạch SPE.
- Máy siêu âm ultrasonic LC 30 của Nhật.
- Bình định mức 100, 50, 25 ml
- Pipet bầu 5, 2, 1 ml
- Cốc có mỏ 500, 250, 100 ml
- ống đong 100, 25 ml
- Bình cầu cất quay chân không.
6.4 Cách tiến hành
6.4.1 Pha dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn vitamin D
2
gốc 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g
vitamin D
2
cho vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch bằng dung
môi ethanol của Merck.
- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D
2
nồng độ 1ppm: Lấy 1ml dung
dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loãng bằng ethanol đến
vạch.
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 15/46
- Dung dịch chuẩn vitamin D
3
gốc 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g
vitamin D
2
cho vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch bằng dung
môi ethanol của Merck.
- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D
3
nồng độ 1ppm: Lấy 1ml dung
dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loãng bằng ethanol đến
vạch.
- Xác định lại nồng độ các dung dịch chuẩn trung gian trên.
Sử dụng máy quang phổ UV-VIS đo độ hấp thụ (Abs) của mỗi dung dịch
chuẩn trung gian vitamin D
2
, D
3
ở bớc sóng 265 nm. Tính nồng độ thực
của dung dịch chuẩn (C) với hệ số = 18466 với vitamin D
3
và = 18843
với vitamin D
2

- Pha loãng các dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm
việc với nồng độ khác nhau để xây dựng đờng chuẩn.
6.4.2 Chuẩn bị mẫu phân tích
- Mẫu đợc đồng nhất kỹ trớc khi xử lý: Đối với mẫu rắn phải xay hoặc
nghiền kỹ và trộn đều. Mẫu dạng bột, lỏng, sệt phải đợc trộn khuấy kỹ.
- Cân khoảng 0,5- 50 g mẫu độ chính xác 0,1g cho vào lọ nhựa.
- Mẫu đợc xà phòng hoá bằng cách cho thêm 40 ml ethanol, 25 ml KOH
80 % , khoảng 0,1 g TBHQ, xà phòng hoá ở 75
0
C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt
độ phòng qua đêm.
- Chiết các chất không xà phòng hoá bằng ete dầu hoả, hai lần mỗi lần 25
ml. Tập hợp lớp ete vào phễu chiết khác
- Rửa sạch lớp ete bằng dung dịch NaCl 5 % đến khi dung dịch trung tính.
- Lớp ete cho vào bình cất quay và chng cất đến còn khoảng 5ml.
- Làm sạch qua cột SPE - Si loại 6ml:

Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 16/46
Các bớc làm sạch:
+ Cột đợc ổn định bằng 4 ml dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:73.
+ Sau đó nạp dung dịch chiết mẫu ở trên vào cột.
+ Rửa giải bằng 20 ml dung dịch ethyl acetat : n-hexan = 7:73 .
+ Dung dịch rửa giải đợc cất quay đến cạn.
+ Hoà cặn còn lại bằng 1ml pha động lấy dung dịch bơm vào cột HPLC
6.4.3 Điều kiện chạy sắc ký dự kiến nh sau
- Hệ thống HPLC của Thermo Finnigan
- Cột tách chiết pha ngợc Inertsil ODS 3 và Waters RP18
- Pha động (MeOH : THF : H
2
O) = ( 92:3: 5)
- Detector DAD ở bớc sóng 265nm
- Tốc độ dòng 1; 1,2; 1,5 ml/ phút
6.5 Tính kết quả
- Bơm các chuẩn làm việc vào cột HPLC xác định diện tích hay chiều cao
pic của mỗi chất chuẩn, xây dựng đờng chuẩn tơng quan giữa diện tích
hoặc chiều cao pic với nồng độ dãy chuẩn. Hoặc dùng một chất chuẩn để
làm theo phơng pháp so sánh.
- Căn cứ vào đờng chuẩn để tính hàm lợng vitamin D trong mẫu theo
công thức sau.
X (àg/g) = V x C
m
/m
Trong đó:
V: Thể tích dịch chiết cuối cùng để chạy sắc ký HPLC (ml)
C
m:
Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đờng chuẩn (àg/ml).
m: Khối lợng của mẫu phân tích (g)
X: Hàm lợng Vitamin D trong mẫu thử (àg/g).

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×