Tải bản đầy đủ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ" doc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







CHƯNG THỊ NGHIỄM








ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM
TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ










LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN











2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN








CHƯNG THỊ NGHIỄM







ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM
TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN







CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRẦN THỊ TUYẾT HOA





2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

i
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại
học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm
quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ
môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần
Thơ đã tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều
kiện để em có cơ hội học tập thêm những kiến thức thực tế.
Chân thành cảm ơn anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khoá 14) đã nhiệt tình hỗ
trợ cung cấp mẫu tôm thu ở Cà Mau năm 2008.
Xin cám ơn tập thể các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp
đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp
tại Khoa Thủy Sản.
Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt
tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và em gái đã động viên trong suốt thời gian làm
luận văn cũng như trong khoảng thời gian học Đại học.
Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc
sức khỏe và thành công trong cuộc sống.












PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

ii
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu sự khác nhau về kiểu gen của
WSSV ở hai thời điểm và hai khu vực khác nhau bằng phương pháp PCR -
Genotyping (ORF94 và ORF125). Kết quả cho thấy có sự khác nhau về kiểu
gen của WSSV ở năm 2006 và năm 2008 và cả ở 2 khu vực Cà Mau và Bạc
Liêu khi phân tích 231 mẫu ở 23 ao, thuộc 2 đợt thả giống liên tiếp trong cùng
một ao nuôi ở mô hình quãng canh cải tiến (QCCT) thuộc tỉnh Cà Mau 2008
và so sánh kiểu gen của các dòng virus này với các nghiên cứu trước đây (năm
2006). Kết quả nghiên cứu cho thấy, năm 2008, kiểu gen thuộc ORF94 có 12
nhóm vùng lặp lại (VLL), từ 4 - 16 vùng lặp lại trong đó 11-VLL chiếm tỉ lệ
cao nhất (35,8%, 43/120 tổng số mẫu), ORF125 có 8 nhóm vùng lặp lại từ 3 -
14 vùng lặp lại, trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (53,8%, 64/119 tổng số
mẫu). Năm 2006 cho thấy có 5 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125, từ 4 - 8
vùng lặp lại (Cà Mau) và có 6 nhóm từ 3 - 8 vùng lặp lại (Bạc Liêu), trong đó
kiểu gen có 6-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả hai khu vực (Cà Mau là 59,7%,
Bạc Liêu là 24,1%). Sự nhiễm nhiều kiểu gen (ORF94 và ORF125) của
WSSV trong cùng 1 ao ở mô hình nuôi QCCT năm 2008 là phổ biến và sự
nhiễm kép nhiều kiểu gen trong cùng một mẫu tôm cũng phong phú hơn so
với năm 2006. Nghiên cứu còn cho thấy, sự nhiễm bệnh ở các đợt nuôi tôm
liên tiếp ở mô hình QCCT chủ yếu là do nguồn tôm giống gây ra. Từ đó có thể
thấy khả năng ứng dụng tốt phương pháp PCR Genotying trong nghiên cứu tác
nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú.












PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ……………………………………….i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
Chương I - GIỚI THIỆU 1
Chương II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm 3
2.1.1 Trên thế giới 3
2.1.2 Ở Việt Nam 4
2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV 5
2.2.1 Hình thái học của WSSV 5
2.2.2 Cấu trúc protein 5
2.2.3 Gen và phân loai học 6
2.2.4 Sự biến đổi về gen và độc lực của các dòng virus 7
2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm 7
2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng
kỹ thuật PCR - genotyping 8
2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR 9
2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 9
2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 9
2.3.3 Úng dụng của kỹ thuật PCR 10
Chương III - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11
3.2 Vật liệu nghiên cứu 11
3.2.1 Dụng cụ và hoá chất 11
3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 11
3.3 Phương pháp nghiên cứu 12
3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV 12
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

iv

3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping 14
Chương IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16
4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008 16
4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000 16
4.1.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping 19
4.1.2.1 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94 19
4.1.2.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 25
4.2 Kết quả phân tích mẫu axit nucleic trử năm 2006 với PCR-Genotyping
thuộc ORF125 30
4.3 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau
và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 33
4.4 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau
và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 35
Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38
4.1 Kết luận 38
4.2 Đề xuất 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC I 42
PHỤ LỤC II 43





PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1 - Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích 16
Bảng 4.2 - Các ao có mẫu tôm và mẫu cua dương tính được phân tích 18
Bảng 4.3 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 19
Bảng 4.4 -Số vùng lặp lại của ORF94 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu
mẫu 24
Bảng 4.5 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu tỉnh Cà Mau
năm 2008 25
Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại của ORF125 tương ứng với từng ao qua từng đợt
thu mẫu 29
Bảng 4.7 - Kết quả phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu
axit nucleic trử ở Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 32
Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau vào năm 2006
và năm 2008 33
Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Bạc Liêu vào năm 2006
và năm 2008 34
Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau vào năm 2006
và năm 2008 35
Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Bạc Liêu vào năm 2006
và năm 2008 36


















PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

vi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996) 5
Hình 4.1 - Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5% 17
Hình 4.2 - Các vùng lặp lại thuộc ORF94 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 20
Hình 4.3 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm
thả giống đợt 1 21
Hình 4.4 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm
thả giống đợt 2 21
Hình 4.5 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 26
Hình 4.6 - Sự nhiễm kép của WSSV trong cùng một mẫu thuộc ORF125
ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 26
Hình 4.7 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm
nuôi đợt 1 27
Hình 4.8 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm
nuôi đợt 2 27
Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở 2 tỉnh Cà Mau
và Bạc Liêu năm 2006 30
Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 . 31
Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2006 31




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
1
Chương I
GIỚI THIỆU
Đồng Bằng Sông Cửu Long trong đó, Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng theo
thống kế là 3 vùng nuôi tôm lớn ở Miền Nam Việt Nam với nhiều mô hình
nuôi phong phú đa dạng. Tuy nhiên, khi dịch bệnh xảy ra (bắt đầu xuất hiện
vào năm 1994 và kéo dài đến nay) do nhiều nguyên nhân khác nhau đã dẫn
đến thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Trong đó, bệnh đốm trắng là một
trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể đến năng suất tôm nuôi.
Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra trên tôm xuất
hiện sớm nhất ở Đài Loan năm 1991, sau đó thì phân bố rộng khắp nơi ở các
khu vực nuôi tôm trên thế giới. WSSV gây bệnh trên tôm nước mặn, tôm nước
ngọt và được phát hiện nhiễm trên nhiều đối tượng khác nhau. Từ khi bệnh
xuất hiện đến nay có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về phương thức lan truyền,
vật chủ cảm nhiễm, độc lực, thành phần cấu tạo và đã hoàn thành về phân loại
học WSSV, vv,…và đặc biệt đã giải trình tự bộ gen ba dòng WSSV ở Đài
Loan, Trung Quốc và Thái Lan. Khi so sánh 3 bộ gen này với nhau, tìm thấy
sự thay đổi về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 trên 3 dòng
virus này. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, vai trò ứng dụng của việc tìm hiểu
sự thay đổi kiểu gen thuộc ba vùng mã hoá này là rất lớn.
Theo nghiên cứu của Dieu et al., (2004) và Hoa et al., (2005) cho thấy dựa
vào sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 của
WSSV có thể xác định được nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi
phát sinh và cũng như sự khác nhau của các dòng WSSV. Do đó, các vùng lặp
lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu
về dịch tể học của WSSV ở Việt Nam.
Vì vậy, đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR Genotyping trong nghiên cứu
tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú” được thực hiện nhằm
mục tiêu:
Tìm hiểu các vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm
trắng trên tôm sú thu ở Bạc Liêu và Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008.




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
2
Nội dung nghiên cứu
- Phân tích các dòng WSSV thu ở Bạc Liêu và Cà Mau (năm 2006 và
2008) với phương pháp PCR genotyping (thuộc ORF94 và ORF125)
- So sánh sự khác nhau về kiểu gen vùng lặp lại thuộc ORF94 và
ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu ở năm 2006 và 2008.
































PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
3
Chương II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm
2.1.1 Trên thế giới
Trong khoảng thời gian 1991 - 1992 bệnh đốm trắng xuất hiện và gây chết
nhiều tôm nuôi ở một tỉnh của Đài Loan và sau đó đến hai tỉnh của Trung
Quốc. Đến năm 1994, bệnh này lan rộng và xâm nhập vào các trại nuôi ở nam
Nhật Bản, Thái Lan, Indonesia và bờ biển phía tây của Ấn Độ. Sau đó một
năm, bệnh xuất hiện ở cả khu vực Thái Bình Dương đã làm thiệt hại nặng, sau
3 năm bệnh lan khắp nơi trong các trại nuôi qui mô nhỏ ở Bắc Mỹ. Từ năm
1998 đến 1999 bệnh bắt đầu xuất hiện ở Nam Mỹ, đầu tiên là ở Ecuador sau
đó là Peru và tiếp tục đến các nước ở khu vực Thái Bình Dương. Không quá
10 năm bệnh xuất hiện và lan rộng khắp toàn cầu, gây thiệt hại lớn cho nền
kinh tế. Ước lượng rằng qua 10 năm bệnh đã làm thiệt hại khoảng 20 - 30 tỉ
USD.(Trích dẫn từ Caleb McClennen, 2004).
Khi bệnh xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 1992, sản lượng tôm giảm trên
70%, thiệt hại hơn 2 tỉ USD trong 3 năm liên tiếp. Đến năm 2001 Trung Quốc
lại thiệt hại trên 200.000 triệu tấn. Ước đoán tổng thiệt hại lên tới là 15 tỉ
USD. Ở Thái Lan, sản lượng thiệt hại khoảng 34.000 triệu tấn/năm. Cho đến
năm 1994 làm sản phẩm tồn lại khoảng 265.000 triệu tấn, thiệt hại khoảng 1,6
tỉ USD. Ở Indonesia cũng có tình trạng tương tự, sản lượng tôm khi bệnh chưa
bộc phát là 17.000 triệu tấn/năm từ 1985 - 1991. Khi bệnh xuất hiện làm nền
công nghiệp bị đình trệ gây tổn thất gần 1 tỉ USD trong 10 năm. Ở Ấn Độ và
sau đó là Philippines cũng bị thiệt hại khá nặng khi bệnh bộc phát.
Ở Châu Mỹ Latin, dịch bệnh bùng nổ vào năm 1999. Bệnh xảy ra đầu tiên ở
Nicaragua nhưng chỉ ở mức nhỏ làm giảm 13% sản lượng, thiệt hại vài triệu
USD. Tuy nhiên, ở các quốc gia lân cận thì không may mắn. Ở Ecuador sản
lượng giảm hơn 60% trong 2 năm, kết quả là làm thiệt hại hơn 1 tỉ USD từ
1998 - 2001. Ở Panama, sản lượng giảm nhanh gần 90%, trong 3 năm gây
thiệt hại trên 100 triệu USD. Tương tự, ở Peru sản lượng trong 2 năm giảm
gần 90%, kết quả là thiệt hại 70 triệu USD. Vào thời điểm này các nhà khoa
học có nhiều nghiên cứu để làm rõ các ổ dịch ở nhiều vùng khác nhau xảy ra ở
Mỹ Latin để đối phó lại sự bộc phát của WSSV. (Trích dẫn từ Caleb
McClennen, 2004)


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
4
2.1.2 Ở Việt Nam
Vào giữa năm 1994, bệnh tôm xuất hiện và xảy ra khắp các tỉnh phía Nam đã
gây thiệt hại lớn về kinh tế. Theo báo cáo kết quả NTTS năm 2003 cho thấy,
cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có
tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng
đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện
tích có tôm bị chết trong cả nước. Chủ yếu là bệnh virus đốm trắng, bệnh
MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần
đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi.
Ở các tỉnh Bắc Trung Bộ theo các số liệu do Trung tâm Môi trường và Dịch
bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I) cho thấy: Thanh Hóa có hơn 40% diện tích
nuôi tôm bị bệnh, thường là bệnh do virus đốm trắng, tập trung ở vùng nuôi
tôm công nghiệp như Khu công nghiệp Hoằng Phụ với 70/110 ha nuôi tôm bị
nhiễm bệnh. Nghệ An có 9,1- 47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh virus đốm
trắng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh có 67 ha bị bệnh virus
đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng
Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có đến hơn 100 ha nuôi tôm bị bệnh.
Tại các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ, theo Phòng Bệnh học thủy sản
(Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III), địa phương có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bị
bệnh thấp nhất là Khánh Hoà (14,3%), cao nhất là Ninh Thuận (52,4%). Tỷ lệ
nhiễm bệnh virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này có giảm.
Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ
khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên
mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Bệnh
do virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt làm tác hại lớn đến năng suất, sản
lượng tôm của khu vực (http://vietlinh.com.vn/kithuat/benhthuysan/
banvebenhtom.htm).







PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
5
2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV
2.2.1 Hình thái học của WSSV
WSSV có hình que, màng bao khép kín. Vỏ virus dài khoảng 210 - 380 nm và
rộng nhất khoảng 70 - 167 nm. Có một đuôi phụ nằm ở cuối của virion, đôi lúc
không quan sát được dưới kính hiển vi điện tử.


Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996).
Màng bao của virus dày 6 - 7 nm và có 1 lớp lipid, cấu trúc của màng với 2
lớp trong suốt phân biệt được nhờ vào 1 lớp đục. Nucleocapsid nằm ở phía
trong màng bao gồm có các protein hình cầu với đường kính 10 nm. Khi
phóng thích khỏi màng bao, nucleocapsid tăng thêm chiều dài và nằm trong
virion. Kích cở của nucleocapsid thay đổi tuỳ theo loài nhưng chiều dài
thường trong khoảng 180 - 420 nm và chiều rộng 54 - 85 nm, với bề dày của
thành tế bào là 6 nm. Lỏi nhân gồm có ADN gắn với protein VP15 và ADN
của virion nằm trong vỏ nucleocapsid (Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et
al., 2008).
2.2.2 Cấu trúc protein
Protein của WSSV có hơn 40 loại. Một vài protein không có cấu trúc, có liên
quan đến việc kiểm soát sự phiên mã (VP9), virus sinh sản được qui định từ
bản sao là ADN. Có ít nhất 38 protein cấu trúc nằm trên virion. Trên màng bao
là 21 loại, 10 loại ở nucleocapsid và 5 loại nằm trên vỏ (nằm giữa màng bao và
nucleocapsid). Một tế bào phụ giử chức năng xâm nhập của virus được tìm
thấy ở màng bao protein VP31, VP110 và VP281. Vỏ protein VP36A và
nucleocapsid VP664 và VP136A. Các protein khác như VP28, VP39B,
VP41A, VP41B, VP51A, VP51B, VP68, VP124, VP150, VP187, VP281,
VP292 và một protein tạo keo nằm trên màng bao. Trong khi các protein
VP35, VP466, VP15, VP51, VP76 và những protein khác nằm ở nucleocapsid.
Các protein này có chức năng khác nhau. Khi phân tích ở mức độ tế bào sử
dụng kháng thể để liên kết với các protein lạ cho thấy rằng nó làm tỷ lệ chết
của tôm diễn ra chậm hơn, điều này chứng tỏ các protein như VP28, VP68,
VP281, VP466 và cả VP24, có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của virus.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
6
Nghiên cứu gần đây cho thấy, một protein màng là 25-kDa ở tế bào máu của
tôm có thể kết hợp với VP28 hoặc những virion của WSSV. Ở tôm, các
protein màng bao VP31, VP33 (cũng như VP36B) và vỏ protein VP36A có
khả năng làm hạn chế sự sao mã của WSSV, cho nên các protein này giử vai
trò quan trọng để điều kiểm sự phát sinh bệnh đốm trắng trên tôm (Trích dẫn
từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008).
2.2.3 Gen và phân loại học
Bộ gen của WSSV có dạng vòng, phân tử ADN sợi đôi với A+T khoảng 59%
được phân bố đồng nhất với nhau. Kích cở gen thay đổi theo từng vùng địa lý
như dòng WSSV ở Thái Lan là 293 kbp (van Hulten et al. 2001), Trung Quốc
là 305 kbp (Yang et al. 2001) và dòng WSSV ở Đài Loan là 307 kbp (Chen et
al. 2002). WSSV có kích thước gen lớn nhất, chỉ nhỏ hơn một số loại virus
như virus gây bệnh ở A mip (1 181 404 bp), virus gây bệnh ở canarypox (359
853 bp), virus từ tảo nâu Ectocarpus (335 593 bp) và virus từ trùng đế giày
Paramecium (PBCV-1) (330 743 bp)(van Hulten et al. 2001b).
Phân tích trình tự gen cho thấy, bộ gen của WSSV nằm trong khoảng 531 đến
684 ORFs với mã mở đầu là ATG. Trong đó, 181-184 ORFs có khả năng mã
hoá protein chức năng có kích cở khoảng 51 - 6077 aminoacid, tương ứng với
92% thông tin di truyền nằm trong bộ gen (van Hulten et al. 2001a; Yang et
al. 2001). Khoảng 21 - 29% ORF mã hoá cho prôtêin của WSSV hoặc tham
gia nhận dạng các protein đã biết khác như DNA polymerase (Chen et al.
2002), các tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ của ribonucleotide, thymidine
kinase, thymidylate kinase, chimeric thymidine-thymidylate kinase,
thymidylate synthase, dUTPase / 2 PK (Yang et al. 2001),…Ba ORF (151,
366 và 427 của dòng virus ở Thái Lan) có khả năng mã hoá các protein phức
tạp của WSSV. Các nghiên cứu gần đây, cho thấy rằng WSSV cũng có 3 gen
sớm (immediate early - IE) (ORFs 126, 242 và 418 của dòng virus ở Đài
Loan). Các gen này phiên mã độc lập tổng hợp prôtêin trong bộ máy của tế
bào vật chủ. Những gen IE có ý nghĩa quan trọng để quyết định vật chủ cảm
nhiễm và có chức năng điều chỉnh các yếu tố gây nhiễm bệnh (Liu et al.
2005).
Phân tích chuỗi DNA polymerase và thành phần của một vài ORFs đã biết để
mã hoá cấu trúc protein của WSSV, tìm thấy sự khác biệt với nhóm
baculovirus, điều đó đã chứng minh rằng WSSV không có mối quan hệ với
nhóm virus này. WSSV là một loài virus mới thuộc họ virus là Nimaviridae
(Vlak et al. 2005).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
7
2.2.4 Sự biến đổi về gen và độc lực của các dòng virus
Bộ gen của 3 dòng WSSV ở Thái Lan, Trung Quốc và Đài Loan đã được giải
trình tự, sự giống nhau giữa các dòng này là 99,3% (Marks et al., 2003). Dòng
virus ở Trung Quốc và Đài Loan có 27 đoạn gen, còn ở Thái Lan chỉ có 25
đoạn, trong đó các đoạn có kích cỡ là 0,3 ; 0,5 ; 0,7 ; 4,2 ; 4,7 ; 5,3 ; 5,4 ; 8,3
và 10,8 kbp đều giống nhau ở cả 3 dòng. Có 2 đoạn gen mà dòng virus ở Thái
Lan không có, với kích thước tương ứng là 9 và 20 kbp. Còn lại khoảng 14-16
đoạn có kích cở thay đổi từ 1,2 - 18 kbp có sự khác nhau giữa các dòng. Dựa
vào sự khác nhau của các vùng trong bộ gen của WSSV có thể dùng để xác
định nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi phát sinh và cũng như sự
khác nhau của các dòng virus (Dieu et al. 2004; Hoa et al. 2005).
Một vùng không ổn định là 9,6 kbp trong bộ gen ở dòng WSSV Trung Quốc
có hoặc không có hiện diện với kích cở khác nhau tuỳ thuộc vào loài vật chủ.
Từ đó cho thấy rằng sự mất đoạn có chức năng quan trọng trong độc lực của
virus (Lan, Lu & Xu 2002).
Các protein của 6 dòng virus được mô tả bởi Lo et al., (1999) và các dòng từ
Ấn Độ và Triều Tiên có kết quả tương tự nhau là có ít nhất 3 protein cấu trúc
thiết yếu (VP28, VP24 và VP19). Ngoài ra, còn tìm thấy VP15 trên 4 loài.
Trình tự amino ở mã kết thúc của các protein này là giống nhau giữa các dòng
(Wang et al. 2000).
Độc lực của các dòng WSSV khác nhau là khác nhau. Độc lực phụ thuộc vào
loài cảm nhiễm, đối với tôm thẻ chân trắng có tỷ lệ chết đến 100% khi nhiễm
WSSV. Dòng virus Texas có tính độc cao nhất so với các dòng khác (Wang et
al. 1999). Ngoài ra, khả năng gây độc và tính cạnh tranh của virus còn phụ
thuộc vào kích cỡ của bộ gen. Dòng virus WSSV (WSSV-TH- 96-II) với kích
cở gen lớn nhất (312 kbp), khả năng gây độc chậm hơn [thời gian gây chết
(LT50) = 14 ngày] so sánh với dòng virus khác (WSSV-TH) với kích cở gen
nhỏ hơn (292 kbp) (LT50 = 3.5 ngày). Kết quả này là do virus có kích cỡ gen
nhỏ hơn thuận lợi cho quá trình sao chép của virus (Marks, 2005).
2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm
WSSV gây bệnh chủ yếu trên các loài giáp xác 10 chân. Ít nhất 18 loài tôm
nuôi hoặc tôm ngoài tự nhiên, 8 loài thuộc nhóm động vật vỏ giáp kín thân
(caridean), 7 loài tôm hùm, 7 loài tôm, 38 loài cua, 6 loài giáp xác không
thuộc bộ 10 chân, Các thành viên thuộc ngành Chaetognata và Rotifera, giun
nhiều tơ và vài loài ấu trùng nước cho kết quả dương tính với kỷ thuật PCR.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
8
Tuy vậy, trong đó là những loài cảm nhiễm với WSSV ở mức thử nghiệm,
trong thực tế chỉ 1 vài loài thu từ ngoài tự nhiên dương tính với WSSV bằng
phương pháp PCR. Nhưng nhận định cho thấy các loài này không là vật chủ
thiết yếu của WSSV, nhưng chúng có khả năng là vật chủ trung gian gây bệnh.
(Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008).
2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật
PCR-genotyping
Vào năm 2003 Wongteerasupaya et al., ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping để
xác định số lần lại của trình tự 54 bp bằng đoạn mồi ORF94. Kết quả cho thấy
đã tìm ra được 12 dòng WSSV với số lần lặp lại khác nhau như 6-, 7-, 8-, 9-,
10-, 11-, 12-, 14-, 15-, 17-, 19-, 20- vùng lặp lại. Trong đó các mẫu có 8 vùng
lặp lại chiếm đa số. Các mẫu tôm này được thu từ 55 ao tôm phát bệnh ở Thái
Lan. Qua đó cho thấy tiềm năng sử dụng trong nghiên cứu về dịch tể học của
bệnh đốm trắng trong việc tìm hiểu nguồn gốc gây bệnh và ngăn ngừa việc lây
lan.
Tiếp sau đó Dieu et al., (2004) nghiên cứu dịch tể học phân tử của virus gây
bệnh đốm trắng trên tôm ở VN. Mẫu được thu ở 8 nơi khác nhau ở Việt Nam,
trong đó 6 mẫu thu tại bờ biển miền Trung và 2 mẫu thu tại miền Nam - Việt
Nam. Những mẫu dương tính với PCR sẽ được phân tích tiếp theo kỷ thuật
PCR-genotyping sử dụng các cặp mồi ORF23/24, ORF14/15, ORF75, ORF94
và ORF125 để xác định dòng WSSV. Kết quả cho thấy, dựa vào cặp mồi
ORF14/15 và ORF23/24 đã chứng minh dòng WSSV ở Việt Nam có nguồn
gốc từ WSSV ở Thái Lan và Đài Loan. Tác giả đã nhận định rằng có mối quan
hệ gần gũi giữa dòng WSSV phân lập ở VN với dòng WSSV ở Thái Lan, rất
có thể chúng có cùng một nòi giống.
Pradeep et al., 2007 cũng tìm hiểu sự biến về vùng lặp lại của ORF94 ở mẫu
cua, tôm giống, tôm thịt và tôm bố mẹ ở Ấn Độ tìm thấy 13 nhóm vùng lặp lại
từ 2 -16 vùng (không thấy 11 và 15 kiểu gen), trong đó 7 vùng lặp lại chiếm
ưu thế.
Vào năm 2005 Hoa et al., đã thiết lập và sử dụng qui trình PCR-genotyping để
kiểm tra sự khác nhau của các chủng WSSV phân lập từ tôm và các loài giáp
xác thu ở các khu vực khác nhau của đồng bằng sông cửu long. Qui trình
PCR-genotyping này phát hiện được sự khác nhau về số lượng cũng như trình
tự ribonucleotide ở đoạn gen sao chép nối tiếp có 54 nucleotide. Đoạn sao
chép nối tiếp này nằm giữa đoạn gen mã hoá cho hai tiểu đơn vị của
ribonucleotide reductase. Kết quả cho thấy rằng qui trình PCR-genotying có
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
9
thể xác định được những chủng WSSV đặc trưng và có thể giúp tìm hiểu ra
nguồn gốc lây lan của mầm bệnh WSSV.
2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR
2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự
phát minh năm 1985. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để
tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt
động của enzyme polymerase.
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình
tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần
những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động
của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành mạch đơn,
phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của chúng, thường là ở 94 - 95
o
C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
- Giai đoạn lai: ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các
mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Đây là giai đoạn quyết định
tính đặc hiệu của phản ứng.
- Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 72
o
C tạo điều kiện tốt
cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo ngyên tắc
bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt
động. (Trích dẫn từ Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR như ADN khuôn, enzyme, mồi
và nhiệt độ gắn mồi, nồng độ các nucleotide, nồng độ Mg
+
, số lượng chu kỳ
phản ứng,…nhưng đáng quan tâm nhất là cặp mồi được chọn phải đặc trưng
cho trình tự DNA cần khuếch đại và DNA thật tinh sạch thì phản ứng PCR
mới tối ưu (trích dẫn từ Trần Thị Mỹ Duyên, 2006).



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
10
2.3.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Ngày nay, phương pháp PCR đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu
khoa học cũng như y học và khoa học hình sự như xác định trình tự các đoạn
ADN, tiến hoá phân tử, phục hồi gen, phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, tạo đột
biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động
vật và thực vật…Trong Thủy sản PCR đã được áp dụng để phát hiện nhanh
các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thuỷ
sản có chất lượng tốt trong sản xuất giống và ương nuôi. Đồng thời PCR còn
được ứng dụng đánh giá xu hướng an toàn hàng thuỷ sản (xuất khẩu) và góp
phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của các tác nhân gây
bệnh, hay các loài động vật thuỷ sản (trích dẫn từ Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).

















PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
11
Chương III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Từ 25/12/2008 – 30/04/2009
Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ
sản - Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và hoá chất
Dụng cụ:
- Que nghiền - Máy ly tâm
- Eppendorf 1,5ml, 0,5 ml, 0,2ml - Cân điện tử
- Bộ pipette, găng tay - Máy vortex
- Đầu col 200µl và 1000µl. - Bếp nhiệt khô
- Máy ủ - Máy sấy chân không
- Máy PCR - Bộ điện di
- Thiết bị chụp ảnh gel - Lò vi sóng (microwave),
Hoá chất:
- Ly trích: CTAB Solution, Dissolve solution, ethanol 95%, Chloroform, dung
dịch TE.
- Khuếch đại: nước cất tiệt trùng, dung dịch Buffer 10X, MgCl
2
25mM, dNTP
mix 10 mM, Taq ADN Polymerase, mồi ORF 94 - F, mồi ORF 94 - R và mồi
ORF 125 flank (Forward, Reverse).
- Điện di: Agarose, Ethidium bromide, 6X loading Dye, thang ADN 1 kb plus
(Invitrogen) và thang ADN 100 bp plus.
3.2.2 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu axit nucleic trữ năm 2006 (67 mẫu - Cà Mau và 87 mẫu - Bạc
Liêu)
- Mẫu tôm sú thu ở tỉnh Cà Mau vào năm 2008 (231 mẫu, Cà Mau).




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
12
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV
Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ-2000 WSSV (Công ty Farming
Intelligene Technology Coperation, Đài Loan), gồm các bước sau:
Chuẩn bị mẫu
Cho khoảng 20mg mang tôm vào ống eppendorf (1,5ml) chứa 0,6ml dung dịch
DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền.
Ly trích ADN
Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75
o
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 700 µl Chloroform, vortex kỹ 20 giây
và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
Chuyển phần dung dịch trong ở trên sang ống eppendorf 1,5ml mới, thêm
100µl CTAB Solution và 900 µl nước cất, lắc đều, sau đó ủ ở 75
o
C trong 5
phút. Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10
phút.
Bỏ phần nước trong ở trên, hoà tan phần còn lại bằng 150 µl Dissolve
solution, ủ ở 75
o
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong phía trên
sang eppendorf mới có chứa 300 µl ethanol 95%.
Lắc đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 µl ethanol
70%, để lắng xuống. Làm khô ADN và hoà tan trong TE. Bảo quản ADN ly
trích ở -80
o
C.
Khuếch đại ADN Thực hiện phản ứng PCR 2 bước
+ Phản ứng PCR bước 1: 8 µl/phản ứng
First PCR PreMix 7,5 µl
IQzyme ADN Polymerase 2 U/µl 0,5 µl
+ Phản ứng PCR bước 2: 15 µl/ phản ứng
Nested PCR PreMix 14 µl
IQzyme ADN Polymerase 2 U/µl 1 µl



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
13
PCR bước 1 (First PCR):
94
o
C trong 2 phút
15 chu kỳ: 94
o
C trong 20 giây
62
o
C trong 20 giây
72
o
C trong 30 giây
Sau đó, 72
o
C trong 30 giây
20
o
C trong 30 giây.
PCR bước 2 (Nested PCR)
30 chu kỳ: 94
o
C trong 20 giây
62
o
C trong 20 giây
72
o
C trong 30 giây
Sau đó, 72
o
C trong 30 giây
20
o
C trong 30 giây.
Điện di
Chuẩn bị bản thạch (gel): đun nóng dung dịch đệm TAE 1X với agarose 1,5%
(1,5g/100ml) cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó, nhuộm gel với 4µl
Ethidium Bromide, lắc đều hoà tan dung dịch. Để nguội khoảng 50
o
C, rồi đổ
dung dịch agarose từ từ vào khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao
hơn đáy của lược khoảng 0,3 - 0,5 cm, bề dày của gel không quá 0,8 cm.
Điện di: Cẩn thận cho mẫu, thang ADN, đối chứng âm, đối chứng dương vào
trong từng giếng. Sau đó, điện di với dòng điện 90V trong thời gian khoảng 50
phút.
Đọc kết quả: kết quả điện di được ghi nhận với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber
Loumart).
- Mẫu dương tính được phát hiện với các trường hợp: (i) hiện vạch
tương ứng 296 bp và 848bp (mẫu nhiễm rất nhẹ); (ii) hiện vạch tương
ứng 296 bp (mẫu nhiễm nhẹ); (iii) hiện vạch tương ứng 296 bp và 550
bp (mẫu nhiễm trung bình); (iv) hiện vạch tương ứng 296 bp và 550 bp
và vạch trên 848bp (mẫu nhiễm nặng)
- Mẫu âm tính hiện vạch tương ứng 848 bp (nội chuẩn của tôm).
- Nếu mẫu không hiện vạch nào là do chất lượng ADN ly trích kém.



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
14
3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping
Phương pháp PCR-genotyping dùng để xác định số vùng lặp lại thuộc
ORF94 (Wongteerasupaya et al., 2003, do Trần Thị Mỹ Duyên tối ưu năm
2006).
Thành phần phản ứng: (25µl/phản ứng)

Hóa chất Nồng độ
Nước
PCR buffer 1X
MgCl
2


1,5 mM

dNTPs mix 200 µM
Taq
DN
A

polymerase

2,5 U

ORF94 - F 25 pmol
ORF94 - R 25 pmol
ADN chiết tách 2 µl

Trình tự cặp mồi ORF94:
Tên mồi Trình Tự
ORF94-F 5’-TCT ACT CGA GGA GGT GAC GAC-3’
ORF94-R 5’-AGC AGG TGT GTA CAC ATT TCA TG-3’
Điều kiện phản ứng:
85
o
C trong 15 giây
40 chu kỳ: 94
o
C trong 20 giây
60
o
C trong 20 giây
72
o
C trong 1 phút

72
o
C trong 10 phút
20
o
C trong 1 phút.
Cách đọc kết quả:
Xác định số vùng lặp lại 54 bp với công thức X = x + 54*n
Trong đó, X : là chiều dài sản phẩm
n : là số lần lặp lại của trình tự 54 bp
x : là khoảng cách từ vị trí con mồi đến vùng lặp lại (bp)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
15
Phương pháp PCR-genotyping dùng để xác định số vùng lặp lại thuộc
ORF125 (Bui Thị Minh Dieu et al.,2004, do Nguyễn Thị Thuý Hằng tối ưu
năm 2008)
Thành phần phản ứng: (25µl/phản ứng)

Hóa chất Nồng độ
Nước
PCR buffer

1X

MgCl
2
2,0 mM
dNTP mix 200 µM
Taq
DN
A

polymerase

2,5 U

ORF125 - flank Forward 20 pmol
ORF125
-

flank
Reverse

20 pmol

ADN chiết tách 1 µl

Trình tự cặp mồi ORF125:
Điều kiện phản ứng:
94
o
C trong 3 phút
35 chu kỳ: 94
o
C trong 30 giây
52
o
C trong 30 giây
72
o
C trong 1 phút
và 72
o
C trong 7 phút
Cách đọc kết quả:
Xác định số vùng lặp lại 69bp với công thức X = x + 69*n
Trong đó, X: là chiều dài sản phẩm (bp)
n: là số lần lặp lại của trình tự 69 bp
x: là khoảng cách từ vị trí con mồi đến vùng lặp lại (bp)







Tên mồi Trình Tự
ORF125 flank - Forward 5'-CGA AAT CTT GAT ATG TTG TGC-3'
ORF125 flank - Reverse 5'-CCA TAT CCA TTG CCC TTC TC-3'
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
16
Chương IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008
4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000
Mẫu phân tích gồm có 23 ao nuôi với mô hình quãng canh cải tiến. Mẫu thu
gồm có tôm và một số loài giáp xác tồn tại trong cùng 1 ao nuôi. Trong đó,
mẫu phân tích thuộc mẫu tôm thả nuôi Lần 1 (thu ngày 14/11/2008) và mẫu
tôm thả nuôi Lần 2 (thu ngày 11-15/12/2008). Thông tin chi tiết thể hiện ở
bảng Phụ lục I. Ly trích axit nucleic các mẫu thu và phát hiện bệnh đốm trắng
bằng kit IQ-2000 ta được kết quả như sau:

Bảng 4.1- Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích
Loài

Tổng số mẫu
âm tính (-)
Tổng số mẫu
dương tính (+)
Tổng số mẫu
Phân tích
(%) nhiễm


Tôm

Lần 1 21 62 83 75

Lần 2 49 68 117 58

Cua
18 13 31 42

Tổng

88 143
231 62


Qua kết quả trên, cho thấy các ao thu mẫu mặc dù ít thấy dấu hiệu bệnh lý và
tỉ lệ chết rất thấp (theo thông tin thu mẫu) nhưng khi phân tích mức độ nhiễm
bệnh lại khá cao chiếm 62% so với tổng số mẫu phân tích. Mẫu dương tính ở
đợt thả giống lần 1 (chiếm 75%) cao hơn so với mẫu tôm ở đợt thả giống lần 2
(chiếm 58%) và mẫu cua (chiếm 42%) (Hình 4.1). Ở tôm nuôi lần 1, tôm
nhiễm ở cả 3 mức độ nhẹ (+), trung bình (++) và nặng (+++), nhiễm nhẹ xuất
hiện nhiều nhất (chiếm 45% so với tổng số mẫu tôm nuôi lần 1) nhưng ở tôm
nuôi lần 2 tôm chỉ nhiễm nhẹ hoặc nhiễm nặng (nhiễm vừa chiếm 0%). Đối
với các mẫu cua những mẫu dương tính chỉ nhiễm ở mức độ nhẹ (+) không
thấy mức độ nhiễm nặng và nhiễm vừa (Thông tin chi tiết bảng Phụ lục II).









PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
17






Hình 4.1 - Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5%.
M: thang ADN (kit IQ2000)
Giếng 1, 6: mẫu nhiễm vừa (++)
Giếng 2, 4, 5: mẫu nhiễm nhẹ (+)
Giếng 3 : mẫu âm tính (-)
Giếng 7, 8, 9, 10, 11, 12: mẫu nhiễm nặng (+++)
(-): Đối chứng âm
(+): Đối chứng dương.

Theo nghiên cứu của Tô Vũ An (2008) khi phân tích những mẫu tôm dương
tính ở các ao nuôi với mô hình quãng canh cải tiến ở Cà Mau cũng cho kết quả
tương tự. Nghiên cứu cho thấy, các ao thu mẫu cũng ít thấy dấu hiệu bệnh lý,
khi phân tích tỉ lệ ao nhiễm bệnh chiếm 50% (12/24 ao). Mức độ nhiễm (+) có
tỉ lệ cao nhất chiếm 53% (so với tổng số mẫu dương) và mẫu nhiễm (+++) chỉ
chiếm 10%. Nhưng khác với nghiên cứu của Triệu Thanh Tuấn (2006), khi
phân tích WSSV nhiễm trên tôm của các ao thu ở mô hình nuôi thâm canh và
bán thâm canh ở tỉnh Cà Mau, theo thông tin của tác giả mẫu tôm thu cho
nghiên cứu đều có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng và tỉ lệ chết hầu như 100% ở các
ao. Khi phân tích bằng Nested - PCR cho kết quả dương tính 100% ở các ao
và mẫu nhiễm (+++) ở mức cao nhất chiếm 67%, còn mẫu nhiễm (+) chỉ
chiếm 33%.
Do đó, cho thấy có sự khác biệt lớn về tỉ lệ chết, mức độ nhiễm bệnh cũng như
sự bộc phát bệnh của WSSV ở 2 mô hình nuôi này.
Theo Tsai et al., 1999 nghiên cứu khả năng bộc phát bệnh đốm trắng nhiễm
trên tôm bằng cách cho tôm này nhiễm WSSV xuyên suốt từ giai đoạn trứng
đến Postlaver và sau đó tôm này được nuôi với mật độ 24 con/m
2
trong ao có
diện tích 200m
2
cho đến khi tôm trưởng thành. Kết quả cho thấy rằng đàn tôm
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - +
848

bp


630 bp

333 bp

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×