Tải bản đầy đủ

nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn edwardsiella ictaluri và aeromonas hydrophila trên cá tra ( pangasius hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THUỶ SẢN






NGÔ MINH DUNG







NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI
KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila
TRÊN CÁ TRA ( Pangasius hypophthalmus)








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN






CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG
ĐẶNG THỤY MAI THY
CAO TUẤN ANH





2007
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn quý thấy cô khoa Thủy sản đặc biệt là các thầy cô
thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học thủy sản đã truyền đạt những kiến thức,
những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại
trường.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Thanh Phương, chị Đặng
Thụy Mai Thy, anh Cao Tuấn Anh và cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Từ Thanh Dung và cô trợ lý cố
vấn Phạm Trần Nguyên Thảo cùng các bạn lóp Bệnh học thủy sản K29 đã
động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt
nghiệp.
























i

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
và Aeromonas hydrophila trên cá tra” được thực hiện bởi hai thí nghiệm gây
cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) và Edwardsiella
ictaluri (E. ictaluri) trên cá tra giống bằng phương pháp tiêm. Mỗi thí nghiệm
gồm có 4 nghiệm thức mật độ vi khuẩn, với 3 lần lặp lại và một nghiệm thức
đối chứng. Hai trăm lẻ tám cá tra giống được bố trí vào 26 bể 80L, mật độ 8
con/bể. Không cho cá ăn trong suốt thời gian bố trí thí nghiệm.
Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila sử dụng 4 mật độ vi khuẩn
2,16×10
3
CFU/ml, 2,16×10
4
CFU/ml, 2,16×10
5
CFU/ml và 2,16×10
6
CFU/ml
kết quả thu được ở nghiệm thức 2,16×10
6
CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh
lý sớm nhất là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Không xác định được giá
trị LD
50
của chủng vi khuẩn A. hydrophila gây cảm nhiễm, vì ở nồng độ vi
khuẩn thấp nhất 2,16×10
6
CFU/ml cá đã có tỉ lệ chết trên 50% (54,17%).
Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri sử dụng 4 mật độ vi khuẩn
1×10
5
CFU/ml, 1×10
6
CFU/ml, 1×10
7
CFU/ml và 1×10
8
CFU/ml kết quả thu
được ở nghiệm thức 1×10
8
CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là
37 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm
có giá trị LD
50
= 10
6,5
CFU/ml.
Trong cả hai thí nghiệm, khi quan sát biến đổi mô học ở các cơ quan gan, thận
và tỳ tạng chỉ thấy có hiện tượng sung huyết và xuất huyết, không có hiện
tượng hoại tử ở các cơ quan.














ii

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh sách bảng, danh sách hình iv
Danh mục từ viết tắt v
Chương 1: Giới thiệu 1
Chương 2: Tổng quan tài liệu 3
2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra 3
2.2 Bệnh xuất huyết do A. hydrophila trên cá tra 3
2.3 Bệnh mủ gan do E. ictaluri trên cá tra 5
Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 8
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 8
3.2 Vật liệu nghiên cứu 8
3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 8
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 8
3.3 Phương pháp nghiên cứu 9
3.3.1 Đối tượng thí nghiêm 9
3.3.2 Bố trí thí nghiệm 10
3.3.3 Phương pháp thu mẫu 10
3.3.4 Phương pháp lấy mẫu vi sinh 11
3.3.5 Phương pháp xác định LD
50
11
3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn 11
3.3.7 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô học 12
Chương 4: Kết quả và thảo luận 13
4.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây cảm nhiễm 13
4.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả LD50 sau khi gây cảm nhiễm 14
4.2.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila 14
4.2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri 18
4.3 Tổn thương do vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên một số cơ
quan của cá tra 20
4.3.1 Những biến đổi mô học do vi khuẩn A. hydrophila 20
4.3.2 Những biến đổi mô học do vi khuẩn E. ictaluri 23
4.4 Kết quả tái định danh vi khuẩn 26
4.4.1 Tái định danh vi khuẩn A. hydrophila 26
4.4.2 Tái định danh vi khuẩn E. ictaluri 27
4.5 Một số hạn chế trong quá trình thí nghiệm 28
Chương 5: Kết luận và đề xuất 29
5.1 Kết luận 29
5.2 Đề xuất 29
Tài liệu tham khảo 30
Phụ lục 34
iii

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Nồng độ vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm 10
Bảng 4.1 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh 15
Bảng 4.2 Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn
A. hydrophila 15
Bảng 4.3 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh 18
Bảng 4.4 Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn
E. ictaluri 18



























iv

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 4.1 Biểu hiện bên ngoài cá tra bị nhiễm A. hydrophila 13
Hình 4.2 Nội tạng cá tra nhiễm A. hydrophila bị xuất huyết 13
Hình 4.3 Cá tra nhiễm E. ictaluri bị đốm trắng ở nội tạng 14
Hình 4.4 Mô gan cá tra bị nhiễm A. hydrophila 22
Hình 4.4 Mô thận và tỳ tạng cá tra bị nhiễm A. hydrophila 23
Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri 26
Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri 27
Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310
28
Hình 4.8 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Tỷ-PT207 29

v

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
Trong thời gian gần đây, dịch cúm gia cầm và bệnh lở mồm long móng, bệnh
tai xanh ở lợn lan rộng ở nhiều nước trên thế giới. Dịch bệnh cũng đã xuất
hiện ở Việt Nam đã làm giảm đáng kể nguồn thực phẩm phục vụ cho đời sống
con người. Người tiêu dùng bắt đầu chọn sản phẩm thủy sản dùng làm thực
phẩm dinh dưỡng hàng ngày. Theo công bố của bộ thủy sản ngày 05-12-2005
thì kim ngạch xuất khẩu của toàn ngành thủy sản đạt 2,5 tỉ USD (trích dẫn bởi
Trần Thị Ngọc Hân, 2006). Điều này cho thấy nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thủy
sản ở Việt nam hiện nay là rất lớn. Việc quy hoạch vùng nuôi và đẩy mạnh
nuôi các đối tượng thủy sản có giá trị xuất khuẩu với mức đầu tư rất cao, quy
mô thâm canh hóa tạo ra sản phẩm sạch mà không tác động đến môi trường
đang là vấn đề rất quan trọng đặt ra cho các nhà khoa học, những người quản
lý và đầu tư nuôi trồng thủy sản.
Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi đang
được phát triển với tốc độ nhanh ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long
(ĐBSCL). Từ những năm 1998–2000, với sự thành công trong hoạt động
nghiên cứu xây dựng “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá
tra thương phẩm” của Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ, có thể nói phong
trào nuôi cá tra thương phẩm đang phát triển rất mạnh ở vùng ĐBSCL, năng
suất và sản lượng nuôi không ngừng tăng: năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001
đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 trên 200.000 tấn, năm
2004 trên 300.000 tấn và năm 2005 đã vượt qua 500.000 tấn (Dương Nhựt
Long, 2006). Trong “Chương trình hành động về chất lượng và thương hiệu cá
tra, basa giai đoạn 2005- 2010” Bộ thủy sản đặt ra chỉ tiêu sản lượng cá tra,
basa nuôi phải đạt 1 triệu tấn vào năm 2010 và kim ngạch xuất khẩu đạt 800
triệu USD (Hà Yên, 2005)
Việc tăng sản lượng cá tra là vấn đề không khó, điều đáng lưu tâm hiện nay là
tình trạng ô nhiễm môi trường nước thường xuyên xảy ra ở các hộ nuôi;
nguyên nhân có thể là do nuôi cá với mật độ dày, lượng thức ăn dư thừa nhiều,
quản lý chất lượng nước chưa tốt, sử dụng hóa chất và kháng sinh không đúng
qui cách… tạo điều kiện cho dịch bệnh thường xuyên bộc phát.
Bệnh xảy ra trên cá tra có nhiều nguyên nhân. Tác nhân thường gây bệnh cho
cá tra là ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng, stress…Trong đó vi khuẩn
là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, làm tỉ lệ hao hụt cao và
khó điều trị ở cá tra. Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ
1

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết đường ruột, trắng da, đốm trắng trên gan…Bệnh xuất
huyết (còn gọi là bệnh đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas và bệnh trắng gan (mủ
gan) do vi khuẩn E. ictaluri là bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm
ở cá tra nuôi ao, bè, đăng quần. Chúng đã gây nhiều thiệt hại cho người nuôi
trong những năm gần đây. Đầu năm 2006, ở tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá
chết do bệnh mủ gan lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006),
bệnh xảy ra làm thiệt hại hàng trăm triệu đồng/hộ nuôi. Từ những vấn đề trên
đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
và Aeromonas hydrophila trên cá tra” được thực hiện.
Mục tiêu đề tài
Tìm hiểu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng gây bệnh của hai dòng vi
khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra.
Nội dung đề tài
1. Xác định LD
50
của vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra trong
điều kiện gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với các mật độ vi khuẩn
khác nhau.
2. Khảo sát sự biến đổi về cấu trúc mô học ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng
của cá tra đã gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila.


2

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra
Cá tra là một trong những loài cá da trơn ở hạ lưu sông Mê kông thuộc địa
phận Việt Nam.
Theo Nguyễn Bạch Loan (2004) cá tra có hệ thống phân loại như sau:
Bộ: Siluriformes
Họ: Pangasidae
Chi: Pangasius
Loài: Pangasius hypophthalmus
Theo Dương Nhựt Long (2006), cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có ở
bốn nước: Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Cá có khả năng sống tốt
trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể
nuôi với mật độ rất cao. Cá tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn được mùn bã
hữu cơ, cây cỏ thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá. Tuy nhiên,
thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá sinh trưởng và phát triển nhanh hơn.
Cá tra không đẻ trong ao nuôi, cũng không có bãi đẻ tự nhiên ở Việt Nam. Cá
đẻ ở thượng nguồn sông Campuchia, cá bột theo dòng nước về hạ nguồn sông
Mê kông Việt Nam. Trong tự nhiên mùa vụ sinh sản của cá bắt đầu từ tháng 5
đến tháng 7 hàng năm.
2.2 Bệnh xuất huyết do A. hydrophila trên cá tra
Theo Từ Thanh Dung (2005), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae,
bao gồm 3 loài Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria.
Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi là
bệnh do vi khuẩn A. hydrophila (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh
Dung, 2005).
Trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem
là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh
nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis &
Plumb, 1979). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia
và gây tỉ lệ tử vong từ 80-90% (Angka, 1990). Trong báo cáo của Saitanu et
al., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do nhiễm
trùng máu trên cá chép.
3

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Theo Angka (1990) vi khuẩn này cũng gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng
giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi
trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979). Vi khuẩn A. hydrophila còn tìm
thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp) (trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005).
Đặc điểm sinh hoá
Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que hoặc hình que cầu, hiếu
khí và yếm khí không bắt buộc, khử Nitrate, có khả năng lên men, Oxidase
dương tính, kháng với O/129 (Từ Thanh Dung, 2005)
Điều kiện sống và gây bệnh
Ở Châu Âu, bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa
xuân - hè, nhiệt độ nước khoảng 17
o
C - 22
o
C, khoảng nhiệt độ này cũng được
cho là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al.,
1993). Bên cạnh đó, Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá
hồi giống đã kết luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5
o
C và 17
o
C, tỉ lệ chết thấp
hơn ở 15
o
C và 12
o
C, còn ở 9
o
C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không
thấy các chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson, 1988).
Báo cáo của Rahman et al., (2000) cũng cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có
độc lực cao nhất ở 17
o
C (LD
50
= 10
6,03
CFU/ml) và 25
o
C (LD
50
= 10
6,53

CFU/ml) khi tác giả gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus). Ngoài
ra, theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), vào thời gian lũ rút thì các hộ
nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện cao nhất với 85,4%.
Dấu hiệu bệnh lý
Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da
thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các
đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn,
mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết
nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày bóng hơi đều xuất
huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh
thường tách đàn và treo râu.
Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm
Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá vàng
bằng 4 cách khác nhau: tiêm ở bụng (mật độ vi khuẩn 3x10
4
- 3×10
8
CFU/ml),
tiêm ở cơ (mật độ vi khuẩn 8x10
4
- 8×10
8
CFU/ml), tiêm dưới da (mật độ vi
khuẩn 8,5x10
4
- 8,5×10
8
CFU/ml) và ngâm vi khuẩn (mật độ vi khuẩn 4,6x10
4

- 4,6×10
8
CFU/ml). Sau khi so sánh đã đưa kết luận gây cảm nhiễm bằng
phương pháp tiêm dưới da thì độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD
50

4

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
là 10
6,4
CFU/ml. Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm tiêm vi
khuẩn này trên cá rô phi, ở mật độ vi khuẩn 10
7
CFU/ml đã gây chết trên 80%.
Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A.
hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 10
3

CFU/ml đến 10
7
CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các
chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD
50
lần lượt là 3,68×10
6
CFU/ml,
2,64×10
6
CFU/ml đến 4,52×10
6
CFU/ml và 1,96×10
6
CFU/ml đến 1,45×10
7

CFU/ml.
2.3 Bệnh mủ gan do Edwardsiella ictaluri trên cá tra
Vi khuẩn Edwardsiella ictalluri được Hawke (1979) phân lập lần đầu tiên
trên cá Nheo nuôi tại Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên
nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish). Ở Việt Nam, bệnh do
E. ictaluri gây ra trên cá tra được gọi là bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu
tiên ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi bè với
dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al., 2001).
Theo Hawke (1981), Plumb và Sanchez (1983) vi khuẩn E. ictaluri còn có khả
năng gây bệnh trên một số nhóm cá da trơn khác như blue catfish (Ictalurus
furcatus) và white catfish (Ictalurus catus) (trích lược bởi Từ Thanh Dung,
2005). Ngoài ra, vi khuẩn E. ictaluri được ghi nhận cũng gây bệnh trên cá trê
trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan, trên cá trê xanh (Ictalurus furcatus) và
cá trê sông (Ictalurus catus) (Bùi Quang Tề, 2006). Ở Việt Nam, bệnh mủ gan
gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế đối với cá tra nuôi thâm canh, tỉ lệ hao
hụt lớn ở cá tra giống từ 10% - 90% (Từ Thanh Dung và ctv., 2004). Đầu năm
2006 ở 2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên tới 60%
(Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006).
Đặc điểm sinh hóa
E. ictaluri là loài vi khuẩn thuộc Enterobacteriaceace, gram âm, hình que
ngắn, di động yếu hoặc không di động. Catalase dương tính, oxidase âm tính
và lên men glucose, không sinh ra H
2
S và Indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri
phát triển trên môi trường TSA chậm 36-48 giờ ở nhiệt độ 28-30
o
C (Từ Thanh
Dung, 2005).
Điều kiện sống và gây bệnh
Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển
mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn
lại. Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện vào thời gian lũ về là cao nhất với tỉ lệ
87,8% số hộ nuôi cá ghi nhận ở An Giang (Trần Anh Dũng, 2005). Lê Thị Bé
5

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước
đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy
mạnh cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh vì vậy bệnh dễ
dàng bộc phát. Bệnh xuất hiện ở tất cả các giai đoạn nhưng gây thiệt hại
nghiêm trọng ở giai đoạn cá lứa.
Khi nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26
o
C - 28
o
C là điều kiện tốt cho vi
khuẩn này gây bệnh trên cá tra (Trương Quốc Phú, 2004). Lương Trần Thục
Đoan (2006) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở nhiệt độ
khoảng 27,5±0,8
o
C đã kết luận mật độ vi khuẩn 1×10
6
CFU/ml và 1×10
5

CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết cá. Theo Plumb (1999), E. ictaluri
chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18
o
C - 28
o
C, do đó bệnh do vi
khuẩn này xảy ra trên cá trơn thường rơi vào mùa có nhiệt độ thấp. Bên cạnh
đó, trong điều kiện thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá nheo giống, bố trí thí
nghiệm ở 25
o
C cho tỉ lệ cá chết cao nhất, thấp nhất ở các nghiệm thức có nhiệt
độ 23
o
C và 28
o
C và không có cá chết tại các nhiệt độ 17
o
C, 21
o
C và 32
o
C
(Francis-Floy et al., 1987).
Dấu hiệu bệnh lý
Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới
chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát
hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và
rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ
đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội
quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 1-3mm các
cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận (Từ Thanh Dung và ctv,
2004)
Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm
Wolter và Johnson (1994) gây cảm nhiễm (bằng phương pháp ngâm) trên Cá
Nheo Mỹ (15-20 cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri 1,2.10
6
CFU/ml ở 25
o
C,
tốc độ nước chảy 1L/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ngày. Tỉ lệ chết dao
động từ 38-95,3% trong thời gian thí nghiệm là 7 ngày (trích dẫn từ Phan Thị
Mỹ Hạnh, 2004). Klesius & Sealey (1995) sử dụng E. ictaluri với mật độ
1x10 CFU/mL ngâm trong một giờ trên Cá Nheo (14-17 cm). Tỉ lệ chết là
28% trong vòng 5-20 ngày.
7
Gần đây nhất, Williams và Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri
R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0x10
7
CFU/ml và
7,2x10 CFU/ml ngâm trên cá Nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là
90% và 85%. Bên cạnh đó họ cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn
7
6

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
E. ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần.
Đối với E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2×10
3
CFU/ml,
5,2×10
4
CFU/ml, 5,2×10
5
CFU/ml thì tỉ lệ cá chết lần lượt là 67,2%, 100% và
100%. Trong khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là
5,2×10
3
CFU/ml, 5,2×10
4
CFU/ml, 5,2×10
5
CFU/ml, 5,2×10
6
CFU/ml gây chết
63,5%, 98,7%, 100% và 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng
không có sự khác nhau về tỉ lệ chết giữa 2 phương pháp ngâm và tiêm.
Ngoài ra, Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh rằng ngâm cá tra với
mật độ vi khuẩn E. ictaluri mật độ vi khuẩn từ 1x10
5
CFU/ml đến 1x10
7

CFU/ml trong 1 giờ, thời gian theo dõi thì nghiệm là 10 ngày thì ở mật độ
1x10
7
CFU/ ml có tỉ lệ cá chết cao nhất (75% số cá thí nghiệm) so với 2 nồng
độ còn lại là 1x10
5
CFU/ml và 1x10
6
CFU/ml. Và đưa ra kết luận rằng mật độ
vi khuẩn 1x 10
7
CFU/ml có độc lực cao nhất. Bên cạnh đó, Lương Trần Thục
Đoan cũng gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ
1x10
4
CFU/ml đến 1x10
6
CFU/ml đã cho rằng mật độ vi khuẩn 1x10
5
CFU/ml
và 1x10
6
CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết cá trong thí nghiệm tiêm (ở
1x10
6
CFU/ml cá chết 100% chỉ sau 5 ngày thí nghiệm) và kết luận rằng
phương pháp tiêm vi khuẩn làm cá chết nhanh hơn phương pháp ngâm vi
khuẩn trong khoảng thời gian 1 giờ. Trong khi đó, Phan Thị Mỹ Hạnh (2004)
khi gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra, tiêm cá ở mật độ vi khuẩn
1,5×10
6
CFU/ml và 1,5×10
5
CFU/ml làm cá chết 100% sau 6 ngày thí nghiệm.
Trần Thị Ngọc Hân (2006) cũng thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn này trên
cá tra bằng 2 phương pháp: phương pháp tiêm (mật độ vi khuẩn từ 1x10
4

CFU/ml đến 1x10
6
CFU/ml) và phương pháp ngâm (mật độ vi khuẩn từ 1x10
5

CFU/ml đến 1x10
7
CFU/ml) đã đưa ra kết luận: trong cùng mật độ vi khuẩn
gây cảm nhiễm là 1x10
5
CFU/ml và 1x10
6
CFU/ml, cấu trúc mô của mẫu thu
ở phương pháp ngâm biến đổi sớm hơn so với phương pháp tiêm.









7

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 06/2007.
- Địa điểm nghiên cứu tại trại thực nghiệm bệnh cá và phòng thí nghiệm bệnh
học thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm
- Bể composit: 36 bể, mỗi bể 80 lít.
- Máy sục khí, hệ thống sục khí, xô nhựa, vợt.
- Dụng cụ tiểu phẫu, que cấy, đèn cồn, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy tissues,
bút lông, kính hiển vi, lame.
- Cốc thủy tinh, lọ thủy tinh, đĩa Petri, ống đong.
- Ống tiêm, kim tiêm.
- Cân điện tử, máy Autolauve, máy ly tâm.
- Máy đúc khối, máy cắt lát mỏng, máy xử lý mẫu.
- Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy.
- Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày.
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm
- Chlorin, cồn, nước cất, formol (70%, 10%)
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: TSA (Trypticase soya agar), NB (Nutrient
broth).
- Các loại hóa chất nhuộm Gram.
- Các hóa chất Test sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn theo phương
pháp truyền thống.
- Dung dịch cố định mẫu: NBF (Neutral Buffered Formalin)
- Xylen, parafin, sáp ong.
- Dung dịch Mayer

s aldumin.
- Dung dịch nhuộm Harris

s Haematolin & Eosin (H&E).
- Keo dán Enterlan.



8

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng thí nghiệm
¾ Cá thí nghiệm
- Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-20g.
- Cá tra giống tương đối đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng bóng.
- Cá giống sau khi mua về được dưỡng trong bể composite nước chảy tràn,
có sục khí khoảng 1 tuần và cho cá ăn thức ăn công nghiệp (cho ăn theo
nhu cầu).
- Kiểm tra tình trạng sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi tiến
hành bố trí thí nghiệm.
¾ Nguồn vi khuẩn
- Vi khuẩn được phân lập từ các ao cá Tra bệnh ở An Giang thuộc đề tài
“Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (Tra-
Pangasius hypophthamus) và tôm càng xanh (Macrobrachiumrosenbergii)
- Mẫu vi khuẩn được trữ vào tháng 11/2006 ở nhiệt độ -80
o
C.
Mã vi khuẩn A. hydrophila: Xương-CĐ3L310
Mã vi khuẩn E. ictaluri: Tỷ-PTK207
- Vi khuẩn trữ được cấy trên môi trường TSA để có khuẩn lạc rồi tiếp tục
đem cấy sang trên môi trường TSA để chắc chắn có khuẩn lạc thuần, kiểm
tra tính thuần dựa vào các chỉ tiêu về hình thái: hình dạng, màu sắc khuẩn
lạc, nhuộm gram.
- Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong 100 ml NB, ủ trong tủ ấm ở
28
o
C từ 24-48 giờ.
- Sau đó vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4
o
C trong vòng
5 phút. Tiếp đó vi khuẩn sẽ được rửa sạch 3 lần trong nước muối sinh lý
bằng cách ly tâm ở 5.000 vòng/phút ở 4
o
C trong vòng 5 phút (Theo
Rahman et al., 2000)
- Xác định mật độ vi khuẩn bằng hai cách tiến hành song song
1. Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610
nm. Với OD = 1 tương đương với mật độ vi khuẩn là 1×10
9
CFU/ml (Theo
Lương Trần Thục Đoan, 2006).
2. Pha loãng dung dịch vi khuẩn, dùng pipet hút 20µl cho lên môi trường
TSA, lặp lại 7 lần (140µl/ độ pha loãng/ dòng vi khuẩn). Cho vi khuẩn
phát triển 24-48 giờ ở điều kiện 28
o
C. Đếm số lượng khuẩn lạc, xác định
mật độ vi khuẩn bằng công thức:
Tế bào vi khuẩn (CFU/ ml) = Số khuẩn lạc trên đĩa/7 x 50 x Hệ số pha loãng
- Pha loãng vi khuẩn với các mật độ và tiến hành bố trí thí nghiệm.
9

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3.2 Bố trí thí nghiệm
- Bể composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200 ppm, phơi
khô. Sau đó cấp nước vào bể, có sục khí. Nguồn nước là nước máy.
• Bể 500L dùng để trữ cá được đặt ngoài trời nơi có mái che.
• Bể 80L dùng để thí nghiệm cấp khoảng 50-60L nước. Bể được đặt
trong phòng kín.
- Thí nghiệm được bố trí trong hệ thống nước tĩnh.
- Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 8 con/bể.
- Không cho cá ăn suốt thời gian bố trí thí nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
- Thí nghiệm gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm gồm 4 nghiệm thức
với mật độ vi khuẩn khác nhau và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối
sinh lý.
Bảng 3.1: Nồng độ vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm
Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml)
Nghiệm thức
A. hydrophila E. ictaluri
1 2,16 × 10
3
1 × 10
5

2 2,16 × 10
4
1 × 10
6

3 2,16 × 10
5
1 × 10
7

4 2,16 × 10
6
1 × 10
8

- Tiêm 0,1 ml vi khuẩn cho mỗi con cá, mẫu đối chứng tiêm 0,1 ml dung dịch
nước muối sinh lý. Vị trí tiêm ở gốc vi ngực.
- Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 10 ngày.
3.3.3 Phương pháp thu mẫu
- Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý, số cá chết cá ở các mốc thời
gian 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 18h, 24h, ngày 2,…ngày 14 sau khi gây cảm
nhiễm.
- Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết và ghi nhận lại dấu hiệu bên
ngoài và bên trong cơ thể mẫu cá.
- Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng.
- Thu mẫu mô ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định mẫu bằng dung dịch
NBF trong lọ nhựa.



10

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3.4 Phương pháp lấy mẫu vi sinh
Mẫu vật: mẫu cá dung để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống hoặc vừa mới chết.
Trước khi giải phẫu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi
nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các
triệu chứng của bệnh.
Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng. Khi giải phẫu để tránh nhiễm các tạp
khuẩn từ bên ngoài, cần áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình phân
lập vi khuẩn. Dụng cụ lấy mẫu được đốt trên đèn cồn trước khi lấy mẫu ở các
cơ quan. Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch các
chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá.
3.3.5 Phương pháp xác định LD
50
(Lethal dose: Nồng độ vi khuẩn gây chết
cá 50%)
Xác định LD
50
theo phương pháp của Reed và Muench (1938). Xác định LD
50

để biết được khả năng năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các
chủng vi khuẩn.
LD
50
= 10
a - p.d
p.d =
%%
50%
H
L
L



¾ a: số lũy thừa mà tại đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%)
¾ H%: tỷ lệ cá chết cao nhất (dưới 50%)
¾ L%: tỷ lệ cá chết thấp nhất (trên 50%)
3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn
Chỉ tiêu về hình thái
- Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc
- Nhuộm Gram và hình dạng của vi khuẩn.
Chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa (Chi tiết xem phần phụ lục A)
- Tính di động,
- Các phản ứng Oxydase, Catalase, O/129, Decarboxylase, Voges-Proskauer
(VP), Indole, Citrate, Ure, Asculin, phản ứng tạo Nitrite từ Nitrate; Khả
năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test), khả năng sinh gas và
H
2
S, khả năng thủy phân Starch, Gelatin
Định danh vi khuẩn dựa theo phương pháp của Bergey (1974) và dòng chuẩn
vi khuẩn dựa theo dòng chuẩn của Inglis et al., (1993).
11

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3.7 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô (chi tiết ở phần phụ lục B)
Thu mẫu ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định bằng dung dịch NBF trong
lọ nhựa, sau đó thực hiện các bước sau:
- Rửa mẫu sau khi cố định
- Cắt tỉa và định hướng
- Quy trình xử lý mẫu (quy trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy)
9 Loại nước
9 Làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian)
9 Tẩm paraffin
- Đúc khuôn
- Cắt mẫu
- Dán mẫu lên lame
- Nhuộm mẫu (quy trình nhuộm mẫu được thực hiện trên máy)
- Dán lamelle vào lame
- Đọc kết quả













12

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây cảm nhiễm
Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra
giống được thực hiện trong cùng địa điểm và điều kiện thí nghiệm. Mỗi thí
nghiệm gồm có 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức với 3 lần lặp lại và 1 nghiệm
thức đối chứng. Kết quả sau khi gây cảm nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều
xuất hiện cá chết, trừ nghiệm thức đối chứng. Tổng số cá thí nghiệm là 208
con.
Trong quá trình thí nghiệm, cá được gây cảm nhiễm A. hydrophila có những
biểu hiện bơi lờ đờ, gầy, có hiện tượng xuất huyết ở các gốc vây, hậu môn,
xung quanh miệng. Cá sắp chết thường ngửa bụng, thả trôi theo nước. Giải
phẫu bên trong thấy bóng hơi căng phồng, gan tái nhợt hoặc sưng, thận sưng,
ruột, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất huyết. Xoang bụng xuất huyết và có
nhiều dịch nhờn, có mùi hôi thối đặc trưng ngay cả khi cá còn sống (Hình 4.1).


A
Hình 4.1 Biểu hiện bên ngoài cá tra bị nhiễm A. hydrophila (¼)

A. Cá bị xuất huyết miệng, mắt. B. Cá bị xuất huyết vi bụng và hậu môn









Hình 4.2 Nội tạng cá tra nhiễm A. hydrophila bị xuất huyết (¼)
13

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Theo Aydin et al., (2004) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi cầu
vồng (Oncorhynchus mykiss Walbaum), cá bị bệnh có biểu hiện bơi lờ đờ, bỏ
ăn, da tối lại, mang bi sưng, tỳ tạng cũng sưng đỏ, gan và thận bị xuất huyết và
có dịch trong ruột. Bùi Quang Tề (2006) cho rằng cá bị nhiễm vi khuẩn này
còn có thể xuất hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét
còn có nấm và ký sinh trùng ký sinh.
Trong khi đó, cá nhiễm E. ictaluri cũng có hiện tượng cá bơi lờ đờ, gầy và
xuất huyết hậu môn. Da cá không còn màu xanh đen hay có ánh bạc mà trở
nên nhợt nhạt. Cá sắp chết thường nổi đầu. Đặc biệt, khi giải phẫu bên trong
nội quan ở gan, thận và tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng tròn, nhỏ, đường
kính khoảng 1-2,5mm, các cơ quan còn có hiện tượng sưng to. Trong thí
nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá tra giống, Lương Trần Thục Đoan
(2006) cũng ghi nhận được nhưng dấu hiệu bệnh lý như trên, ngoài ra còn có
hiện tượng nhũn ở thận.

Hình 4.3 Cá tra nhiễm E. ictaluri bị đốm trắng ở nội tạng ( ¼)
Qua những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong cho thấy trên cùng một
đối tượng vật chủ, cùng điều kiện thí nghiệm và chăm sóc như nhau, nhưng
dưới sự xâm nhập của 2 loài vi khuẩn khác nhau thì đều có những biểu hiện
bệnh lý đặc trưng khác nhau, đặc biệt là những biểu hiện ở các cơ quan nội
tạng.
4.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả LD
50
sau khi gây cảm nhiễm
4.2.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila
Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nồng độ vi khuẩn đều xuất hiện cá chết và
đều biểu hiện bệnh lý rất rõ. Ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau thì thời điểm
phát sinh bệnh ở các nghiệm thức cũng khác nhau (Bảng 4.1).

14

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 4.1: Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh

Bảng 4.1 cho thấy ở nghiệm thức 2,16×10
6
CFU/ml có thời gian cá biểu hiện
bệnh lý sớm nhất 17 giờ và chậm nhất ở mật độ 2,16×10
3
CFU/ml là 26 giờ.
Trong khi đó thời gian xuất hiện bệnh ở nghiệm thức 2,16×10
5
CFU/ml là 18
giờ và nghiệm thức 2,16×10
4
CFU/ml là 18,5 giờ. Thời điểm xuất hiện bệnh
của thí nghiệm phù hợp với thời điểm xuất hiện dấu hiệu bệnh lý của chủng A
5

là 18,5 giờ trong thí nghiệm xác định LD
50
của A. hydrophila khi gây cảm
nhiễm trên cá chép (Cyprinus carpio) của Đoàn Nhật Phương (2001). Bên
cạnh đó, ở thí nghiệm xác định LD
50
của vi khuẩn này trên cá trắm cỏ
(Ctenopharyngodon) của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998) cũng đã ghi nhận thời
điểm làm cá chết 50% là 24 giờ.
Nghiệm thức (CFU/ml) Thời gian xuất hiện bệnh (giờ)
2,16×10
3
26
2,16×10
4
18,5
2,16×10
5
18
2,16×10
6
17

Trong khi đó, Thompson và Adams (1998) khi gây cảm nhiễm các dòng
A. hydrophila có độc lực khác nhau trên cá trê lai giống (Clarias gariepimes ×
C. macrocephalus), thu được thời điểm cá chết ở dòng vi khuẩn có độc lực
mạnh nhất (LD
50
khoảng 10
5
CFU/ml) là 18 giờ sau khi gây cảm nhiễm và 96
giờ ở các dòng vi khuẩn có độc lực yếu (LD
50
khoảng 10
8
CFU/ml). Ngoài ra,
khi xác định độc lực của dòng vi khuẩn này được phân lập từ cá chình giống,
Esteve et al., (1993) ghi nhận được thời điểm xuất hiện cá chết là 18 giờ.
Với thời gian biểu hiện bệnh lý của các mật độ vi khuẩn như trên cho thấy tính
nhạy cảm của ký chủ và khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn sử dụng gây
cảm nhiễm. Bên cạnh đó, cùng với thời gian biểu hiện bệnh lý của các mật độ
vi khuẩn thì tỉ lệ cá chết ớ các nghiệm thức cũng cho thấy được độc lực của
chủng vi khuẩn.
Bảng 4.2: Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila
Tỉ lệ trung bình cá chết trong thời gian theo dõi
(%/tổng số cá/ngày)
Nghiệm thức
(CFU/ml)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tỉ lệ cá chết
(%)
Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2,16×10
3
0 50 4,17 0 0 0 0 0 0 0 54,17±7,22
2,16×10
4
33,33 41,66 0 0 0 0 0 0 0 0 75±12,5
2,16×10
5
62,5 12,5 4,17 0 0 0 0 0 0 0 79,17±26
2,16×10
6
75 8,33 0 0 0 0 0 0 0 0 83,33±14,43
15

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Kết quả bảng 4.2 cho thấy ở nghiệm thức 2,16×10
6
CFU/ml cá chết với tỉ lệ
cao nhất 83,33%. Tỉ lệ chết thấp nhất 54,17% ở mật độ 2,16×10
3
CFU/ml.
Trong khi đó, ở hai nghiệm thức còn lại 2,16×10
4
CFU/ml và 2,16×10
5

CFU/ml cá chế với tỉ lệ 75% và 79,17%. Riêng ở lô đối chứng không thấy có
cá chết.
Cá bắt đầu chết vào ngày đầu tiên ở các nghiệm thức 2,16×10
6
CFU/ml,
2,16×10
5
CFU/ml và 2,16×10
4
CFU/ml. Trong đó nghiệm thức 2,16×10
6
CFU/ml và 2,16×10
5
CFU/ml cá chết tập trung vào ngày thứ nhất với tỉ lệ
75% và 62,5%. Nghiệm thức 2,16×10
4
CFU/ml cá bắt đầu chết vào ngày đầu
tiên nhưng chết nhiều vào ngày thứ 2 với tỉ lệ 41,66% và không thấy cá chết
vào ngày thứ 3. Riêng mật độ 2,16×10
3
CFU/ml xuất hiện cá chết vào ngày
thứ 2 và chỉ xuất hiện trong vòng 2 ngày.
Qua kết quả thí nghiệm nhận thấy rằng, cá chỉ chết tập trung chỉ trong vòng 2-
3 ngày, những ngày sau đó không thấy xuất hiện cá chết. Ở các nghiệm thức
cá đều chết với tỉ lệ cao từ 75% đến 83,33%. Riêng ở nghiệm thức với mật độ
vi khuẩn thấp nhất 2,16×10
3
CFU/ml cũng có tỉ lệ chết khá cao là 54,17%.
Kết quả của thí nghiệm không xác định được giá trị LD
50
của chủng vi khuẩn
A. hydrophila đem gây cảm nhiễm, vì ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn thấp
nhất đã có tỉ lệ cá chết trên 50%. Trong khi đó, thí nghiệm xác định LD
50
vi
khuẩn này trên cá chép, Đoàn Nhật Phương (2001) đã kết luận chủng
A. hydrophila có độc lực mạnh nhất với giá trị LD
50
từ 2,64×10
6
CFU/ml đến
4,52×10
6
CFU/ml. Chủng A. hydrophila trong thí nghiệm của Ngô Thị Ngọc
Thủy (1998) cũng ghi nhận giá trị LD
50
= 1,35×10
7
CFU/ml.
Ngoài ra, trong thí nghiệm so sánh độc lực của các dòng A. hydrophila có ECP
(Extracellular products) khác nhau, Thompson và Adams (1998) đã kết luận
những dòng có độc lực mạnh có giá trị LD
50
khoảng 10
5
CFU/ml với protein
của ECP có trọng lượng phân tử từ 88kDa đến 52kDa. Ngược lại những dòng
vi khuẩn có độc lực yếu có giá trị LD
50
khoảng 10
8
CFU/ml và protein của
ECP khoảng 31kDa. Bên cạnh đó, báo cáo của Esteve et al., (1993) cho rằng
các dòng vi khuẩn đã được phân lập trong thời gian xảy ra dịch bệnh, sau đó
được gây cảm nhiễm trên cá chình (Anguilla anguilla) đã thu được các giá trị
LD
50
từ 10
5,4
CFU/ml đến 10
7,2
CFU/ml, ngược lại ở các dòng vi khuẩn được
phân lập tại các thời điểm khảo sát khác thì thu được giá trị LD
50
từ
10
6,2
CFU/ml đến 10
7,4
CFU/ml.
Takahashi et al., (1986) cũng thu được giá trị LD
50
=1,4×10
4
CFU/ml khi gây
cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở cá thơm (ayu Plecogrossus). Bên cạnh
đó, trên cá rô phi (Oreochromis mossambicus) với vi khuẩn A. hydrophila
16

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
chủng SAH 93 và thu được kết quả LD
50
= 10
6,22
CFU/ml, cá bị nhiễm bệnh có
những biểu hiện bệnh lý rất rõ (Azad et al., 2001).
Hơn nữa, ở thí nghiệm xác định độc lực của các chủng A. hydrophila khác
nhau, De Figuerredo và Plumb (1977) đã gây cảm nhiễm trên cá nheo Mỹ và
đưa kết luận chủng A. hydrophila được phân lập từ cá bệnh có giá trị
LD
50
= 6,4×10
4
CFU/ml, trong khi đó chủng phân lập từ môi trường có
LD
50
= 1,5×10
8
CFU/ml.
Qua các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy vi khuẩn gây bệnh cho ký chủ
ở mức nào còn tuỳ thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn ấy đối với ký
chủ và các điều kiện tác động.
Trong khi đó ở thí nghiệm gây cảm nhiễm vi
khuẩn A. hydrophila trên cá tra, tuy không xác định được LD
50
nhưng ở
nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×10
3
CFU/ml đã có tỉ lệ chết
54,16% chỉ trong vòng 2 ngày. Kết quả cho thấy chủng A. hydrophila trong
thí nghiệm có giá trị LD
50
< 2,16×10
3
CFU/ml chứng tỏ chủng vi khuẩn này có
độc lực cao hơn những chủng A. hydrophila trong các nghiên cứu trước đây.
Bên cạnh đó, cá thí nghiệm đã được thuần hóa 2 tuần trước khi gây cảm
nhiễm, nên đủ để cá thích nghi với điều kiện thí nghiệm. Trong thời gian này
cá vẫn không có biểu hiện gì bất thường. Hơn nữa trước khi gây cảm nhiễm
thì cá đã được kiểm tra vi sinh và ở tất cả các bể hoàn toàn không có sự nhiễm
khuẩn, nhất là A. hydrophila. Đặc biệt trong suốt thời gian thí nghiệm thì bể
đối chứng không có cá chết hay cá bị nhiễm khuẩn. Qua đó đã thế hiện được
tính sạch bệnh và khỏe mạnh của đàn cá thí nghiệm. Ngoài ra, theo Roselynn
và Stevenson (1988) độc lực của vi khuẩn A. hydrophila có giá trị LD
50
trong
khoảng từ 10
4
CFU/ml đến 10
5
CFU/ml, nếu vi khuẩn không gây chết ở mật độ
10
7
CFU/ml thì chủng vi khuẩn không có độc lực. Do đó chủng vi khuẩn
A. hydrophila trong thí nghiệm gây cảm nhiễm là có độc lực.







17

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
4.2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
Cũng như ở thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, ở thí nghiệm
này, sau khi gây cảm nhiễm đều xuất hiện cá chết ở tất cả các nồng độ vi
khuẩn và xuất hiện bệnh lý ở những mốc thời gian khác nhau.
Ở nghiệm thức 1×10
8
CFU/ml có thời gian cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất 37
giờ và chậm nhất ở mật độ 1×10
5
CFU/ml là 86 giờ. Trong khi đó thời gian
xuất hiện bệnh ở nghiệm thức 1×10
6
CFU/ml là 72,5 giờ và nghiệm thức
1×10
7
CFU/ml là 61 giờ (Bảng 4.3)
Bảng 4.3: Bảng thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh

Nghiệm thức (CFU/ml) Thời gian xuất hiện bệnh (giờ)

1×10
5
86

1×10
6
72,5
1×10
7
61

1×10
8
37

Kết quả cho thấy, thời điểm cá bắt đầu biểu hiện bệnh của thí nghiệm chậm
hơn so với những nghiên cứu trước đây. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm
tiêm vi khuẩn này trên cá tra giống của Lương Trần Thục Đoan (2006) đã thu
được cá chết vào ngày thứ 2 ở mật độ 1×10
6
CFU/ml. Lawrence et al., (1997)
gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá nheo và ở nghiệm thức 1,3×10
6
CFU/ml cá
chết đã được ghi nhận ở thời điểm 24 giờ sau khi gây cảm nhiễm.
Ngoài thời điểm biểu hiện bệnh lý thì tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức cũng
phản ánh khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn lên vật chủ.
Bảng 4.4:
Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
Tỉ lệ trung bình cá chết trong thời gian theo dõi
(%/tổng số cá/ngày)
Nghiệm
thức
(CFU/ml)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tổng tỉ lệ cá
chết (%)
Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1×10
5
0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 25±12,5
1×10
6
0 0 4,17 25 4,17 0 0 0 0 0 33,33±14,43
1×10
7
0 0 50 12,5 4,17 0 0 0 0 0 66,67±7,22
1×10
8
0 50 41,66 0 0 0 0 0 0 0 91,67±7,22
Kết quả bảng 4.4 cho thấy ở nghiệm thức 1×10
8
CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao
nhất 91,67%. Tỉ lệ chết thấp nhất 25% ở mật độ 1×10
5
CFU/ml. Trong khi đó,
ở hai nghiệm thức còn lại 1×10
7
CFU/ml và 1×10
6
CFU/ml cá chết với tỉ lệ
66,67% và 33,33%. Riêng ở lô đối chứng, cá đều có trạng thái sinh lý bình
18

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
thường trong suốt thời gian thí nghiệm nên thể hiện được tính thích nghi của
cá đối với điều kiện môi trường.
Cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 ở nghiệm thức 1×10
8
CFU/ml với tỉ lệ 50%. Ở
nghiệm thức 1×10
7
CFU/ml và 1×10
6
CFU/ml xuất hiện cá chết vào ngày thứ
3 và không thấy cá chết vào ngày thứ 6. Trong đó nghiệm thức 1×10
7
CFU/ml
cá chết tập trung vào ngày thứ 3 với tỉ lệ 50%. Riêng mật độ 1×10
5
CFU/ml
chỉ xuất hiện cá chết vào ngày thứ 4.
Từ kết quả thí nghiệm, LD
50
của dòng vi khuẩn E. ictaluri thu được trong thí
nghiệm gây cảm nhiễm có giá trị LD
50
= 10
6,5
CFU/ml. Trong khi đó, Lương
Trần Thục Đoan (2006) sử dụng mật độ vi khuẩn 1×10
6
CFU/ml và 1×10
5

CFU/ml tiêm trên cá tra giống đã thu được tỉ lệ chết 100% và 66,7% trong
khoảng thời gian theo dõi 10 ngày, trong đó mật độ 1×10
6
CFU/ml cá bắt đầu
chết ở ngày thứ 2 và 1×10
5
CFU/ml là ngày thứ 3. Ở thí nghiệm xác định khả
năng bộc phát bệnh của vi khuẩn này lên cá tra sau khi tiêm, sử dụng mật độ
1,5x10
5
CFU/0,1ml và 1,5x10
6
CFU/0,1ml đã thu được tỷ lệ chết ở cả 2 nồng
độ là 100% trong 6 ngày thí nghiệm (Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004). Ngoài ra,
Williams và Lawrence (2005) sử dụng mật độ 5,2x10
4
CFU/ml và 5,2x10
5

CFU/ml tiêm trên cá nheo giống trong khoảng nhiệt độ nước 26
0
C đã gây chết
100% (trích dẫn bởi Lương Trần Thục Đoan 2006).
So sánh với kết quả thí nghiệm trên, nhận thấy độc lực của vi khuẩn trong thí
nghiệm gây cảm nhiễm yếu hơn so với độc lực của vi khuẩn ở thí nghiệm của
Lương Trần Thục Đoan và Phan Thị Mỹ Hạnh, tỉ lệ cá chết thấp hơn so với
những thí nghiệm trước có cùng mật độ vi khuẩn.
Trong báo cáo của Lawrence et al., (1997) gây cảm nhiễm bằng phương pháp
tiêm trên cá nheo với hai dòng vi khuẩn E. ictaluri: dòng vi khuẩn phân lập từ
tự nhiên và dòng LSU-E2 đã được làm giảm độc lực, kết quả ở dòng LSU-2
thu được giá trị LD
50
= 5,1×10
7
CFU/ml, còn ở dòng tự nhiên không xác định
được LD
50
do ở nồng độ vi khuẩn thấp nhất 1,3×10
2
CFU/ml đã có tỉ lệ cá chết
trên 50%. Hơn nữa, Baxa et al., (1990) sử dụng mật độ từ 4×10
6
CFU/ml đến
4×10
8
CFU/ml ngâm trên cá hồi trắng, theo dõi trong 14 ngày, đã ghi nhận
được giá trị LD
50
= 3,4×10
7
CFU/ml và ở nồng độ 4×10
8
CFU/ml có tỉ lệ chết
cao nhất là 92%.
Qua các nghiên cứu trước đây cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể của ký
chủ tạo nên sự nhiễm bệnh hay không, ở mức nào còn tuỳ thuộc vào khả năng
gây bệnh của vi khuẩm đối với ký chủ và điều kiện tác động. Với kết quả thí
nghiệm trên, tuy độc lực của dòng vi khuẩn đem gây cảm nhiễm không cao
nhưng theo Santos (1988) vi khuẩn được xem như không có độc lực khi có giá
19

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×