Tải bản đầy đủ

Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh học tại việt nam

Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong
nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ
thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh
học tại Việt Nam

Lê Thị Phương

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Khoa học Môi trường; Mã số: 60 85 02
Người hướng dẫn: TS. Lê Đức Minh
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nêu những nguyên nhân gây ra suy giảm đa dạng tại Việt Nam và tính cấp
thiết cần xây dựng một cơ sở dữ liệu sinh học phân tử giúp cho các nhà quản lý và nhà
khoa học trong công tác bảo tồn đa dạng sinh học tại Việt Nam. Tổng quan các tài liệu
trên thế giới để nêu ra được tính ưu việt trong việc sử dụng ADN đặc biệt là các gen ty
thể trong việc nhận biết các loài bằng phương pháp này. Tổng hợp được tất cả các
chuỗi ADN thuộc 2 gen được dùng phổ biến nhất hiện nay là gen cyt b và gen COI từ
ngân hàng gen đối với các loài được ưu tiên bảo vệ trong Nghị định 32 của chính phủ.
Đánh giá được khả năng nhận dạng loài dựa vào khoảng cách di truyền gen COI và
Cyt b. So sánh được hiệu quả nhận dạng giữa hai kiểu gen Cyt b và COI. Đánh giá

được khoảng cách di truyền trong chủng loại ở cả hai kiểu gen Cyt b và COI. Xây
dựng cây phát sinh chủng loại cho tất cả các loài ở cả hai kiểu gen COI và Cyt b, qua
đó cho thấy những dữ liệu trên ngân hàng gen còn có nhiều thiếu sót và chưa thể sử
dụng ngay trong điều kiện Việt Nam. Kiến nghị cần phải có thêm những nghiên cứu
về nhận dạng loài dựa vào đặc điểm di truyền để hoàn thiện hơn cơ sở dữ liệu cho
nhận dạng loài.

Keywords: Khoa học môi trường; Bảo tồn sinh học; Quản lý động vật rừng

Content
1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Việt Nam là một nước có mức độ đa dạng sinh học cao với nhiều loài đặc hữu. Tuy nhiên đa
dạng sinh học tại Việt Nam trong những năm gần đây đang phải đối mặt với những mối đe
dọa vô cùng nghiêm trọng từ các hoạt động của con người như khai thác quá mức, phá hủy và
làm xuống cấp môi trường tự nhiên, ô nhiễm môi trường, sinh vật ngoại lai và gần đây tác
động của biến đổi khí hậu.
Để đối phó với những mối đe dọa về đa dạng sinh học này, chúng ta cần có những công cụ
hữu hiệu giúp cho những nhà khoa học và những nhà quản lý có thể kiểm soát tốt hơn những
hoạt động gây ảnh hưởng tới các loài hiện đang nguy cấp. Một trong những công cụ đang
được các nước trên thế giới phát triển là các cơ sở dữ liệu sinh học phân tử, cụ thể là các
chuỗi ADN đặc trưng cho các loài đang được quan tâm. Sử dụng công cụ này cho phép tăng
cường hiệu quả của công tác thực thi pháp luật, đặc biệt là kiểm soát nạn buôn bán đang diễn

2
ra tràn lan, cũng như giám sát các loài này trong môi trường sống của chúng giúp cho công
tác bảo tồn nguyên vị.
Tuy nhiên hiện nay nước ta chưa có một cơ sở dữ liệu nào có thể sử dụng vào những mục
đích nói trên. Chính vì vậy đề tài luận văn “Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong
nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh
học tại Việt Nam” đem lại ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần bước đầu đánh giá
tính khả thi cũng như những thiếu sót cần phải khắc phục trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu.
2. Sự suy giảm đa dạng sinh học ở Việt Nam
Hiện nay Việt Nam đang phải đối mặt với nguy cơ suy thoái đa dạng sinh học. Trong
hội nghị môi trường toàn quốc đang diễn ra ở Hà Nội, các nhà khoa học cho rằng sự suy thoái
đa dạng sinh học được thể hiện ở sự suy giảm của diện tích rừng có hệ sinh thái tự nhiên quan
trọng, số lượng cá thể của các loài sinh vật biển, các loài hoang dã, các nguồn gen hoang
dã Trong đó nổi bật nhất là sự suy giảm cũng như tuyệt chủng của các loài động thực vật
hoang dã.
Nhiều loài động vật, thực vật hoang dã của Việt Nam đang bị đe dọa nghiêm trọng,
ông Đặng Huy Huỳnh, Chủ tịch Hội động vật học Việt Nam, cảnh báo. Theo Sách Đỏ Việt
Nam 2007, tổng số các loại động-thực vật hoang dã trong thiên nhiên đang bị de dọa hiện nay
là 882 loài (418 loài động vật và 464 loại thực vật), tăng 161 loài so với thời điểm năm 1992.
Trong Sách Đỏ Việt Nam, phần động vật (1992), mức độ bị đe dọa của các loài chỉ mới dừng
lại ở hạng “nguy cấp”, thì đến thời điểm này đã có tới 9 loài động vật được xem đã tuyệt
chủng ngoài tự nhiên tại Việt Nam, cụ thể là: Tê giác 2 sừng (Dicerorhynus sumatrensis), Bò
xám (Bos sauveli), Heo vòi (Tapirus indicus), Cầy rái cá (Cynogale lowei), cá Chép gốc
(Procypris merus), cá Chình Nhật (Angilla japonica), cá Lợ thân thấp(Cyprinus multitaeniata),
Hươu sao (Cervus nippon), cá Sấu hoa cà (Crocodylus porosus). Trong hệ thực vật, một số
loài Lan hài Việt Nam đã tuyệt chủng ngoài thiên nhiên. Số lượng các loài thuỷ sinh vật, đặc
biệt các loài tôm, cá có giá trị kinh tế bị giảm sút nhanh chóng. Số lượng cá thể các loài cá
nước ngọt quý hiếm, có giá trị kinh tế, các loài có tập tính di cư bị giảm sút.
3. Các mối đe dọa đến đa dạng sinh học của Việt Nam
*Mối đe dọa gián tiếp
Sự gia tăng dân số và nghèo đói chính là các mối đe dọa gián tiếp đến sự suy giảm đa
dạng sinh học.
Dân số của đất nước tăng lên rất nhanh chóng vào thế kỷ 20 từ 15,6 triệu người vào
năm 1921 đến 54 triệu vào năm 1982, đến gần 80 triệu vào năm 2004; dân số có thể đạt đến
con số 150 triệu vào năm 2050. Khi dân số của đất nước tăng nhu cầu đối với tài nguyên thiên
nhiên cũng tăng theo. Sự tiêu thụ không bền vững nguồn tài nguyên nước và trên đất liền
khắp đất nước được thúc đẩy do nhu cầu của các thị trường tại địa phương, trong khu vực và
quốc tế, tạo ra mối đe dọa to lớn và trực tiếp đối với đa dạng sinh học của Việt Nam. Ngoài
ra, sự nghèo đói và yếu kém trong công tác quản lý nhà nước (thiếu hệ thống pháp luật, thiếu
sự điều hành và nguồn ngân sách) cũng là những mối đe dọa gián tiếp khác đến sự suy giảm
đa dạng sinh học ở nước ta.Việt Nam là một nước phụ thuộc vào nông nghiệp và tài nguyên
thiên nhiên. Trong các khu bảo tồn, 90% dân địa phương sống dựa vào nông nghiệp và khai
thác rừng. Đời sống của họ rất thấp, khoảng trên 50% thuộc diện đói nghèo. Họ bắt buộc phải
khai thác, bóc lột ruộng đất của mình, làm cho tài nguyên càng suy thoái một cách nhanh
chóng hơn.
*Mối đe dọa trực tiếp
Có nhiều mối đe dọa trực tiếp đến sự suy giảm đa dạng sinh học bao gồm: mất và suy
thoái sinh cảnh sống, ô nhiễm môi trường, biến đổi khí hậu, sự xâm nhập của các loài ngoại

3
lai…nhưng sự khai thác quá mức và buôn bán động thực vật hoang dã chính là mối đe dọa
nghiêm trọng nhất.
Khai thác quá mức có nghĩa là khai thác đến khi số lượng của loài thấp hơn mức tối
thiểu mà loài có thể phục hồi. Vì thế dẫn đến sự tuyệt chủng của loài, gây suy giảm đa dạng
sinh học.
Các loài bị khai thác quá mức thường là những loài có giá trị kinh tế cao hoặc có giá
trị sử dụng đặc biệt như giá trị về thẩm mỹ, giá trị về dinh dưỡng …Việc khai thác quá mức
các nguồn tài nguyên thiên nhiên ở Việt Nam liên quan đến nhiều hoạt động trong đó có săn
bắt, đánh cá, khai thác gỗ và săn bắt động vật và thu hái thực vật không bền vững. Khai thác
quá mức đã trở thành một mối đe dọa nghiêm trọng đối với đa dạng sinh học của Việt Nam và
ngày càng mở rộng ra nhiều loài động thực vật khác trong khi đã có hàng trăm loài bị
ảnh hưởng.
- Khai thác và buôn bán thực vật
Khu hệ thực vật bị khai thác ở khắp nơi. Quả cây, hoa, vỏ cây, rễ, nhựa, gỗ và toàn bộ
cây được thu thập vì nhiều mục đích, từ làm thức ăn và thuốc cho đến làm thủ công mỹ nghệ,
dệt và sản xuất đồ đạc và phục vụ việc buôn bán cây cảnh. Những loài thực vật bị khai thác
nhiều nhất ở Việt Nam thường là các loài có giá trị kinh tế cao như: song mây, sâm, trầm
hương, các loại gỗ quý.
Ngoài ra thì việc khai thác và buôn bán các loại gỗ trái phép cũng là một vấn đề nóng
ở Việt Nam. Hai loài cây lá kim ở miền Bắc Việt Nam đang phải chịu sức ép ở mức độ
địa phương: Bách tán Đài Loan (Taiwania cryptomerioides) và loài Bách tán vàng Việt
Nam đặc hữu (Xanthocyparis vietnamensis) được mô tả vào năm 2002. Cả hai cùng có các
quần thể rất nhỏ và bị đe dọa do sự xuống cấp của sinh cảnh và việc khai thác trực tiếp loại gỗ
nhiều nhựa và có mùi thơm để phục vụ xây dựng, làm áo quan và đồ thủ công mỹ nghệ.
IUCN xếp các loài cây này vào nhóm cực kỳ nguy cấp.
- Đánh bắt thủy sản quá mức
Các hình thức đánh bắt thủy sản mang tính hủy diệt như dùng chất nổ, chất độc, sốc
điện, lưới mắt nhỏ dưới mức cho phép làm suy giảm đa dạng sinh học nghiêm trọng các hệ
sinh thái đất ngập nước ven biển, đe dọa sự tồn tại của hơn 80% các rạn san hô ở Việt Nam,
và hủy diệt các nguồn cá giống, tôm giống trong các vùng đất ngập nước ven bờ nội địa.
Thậm chí ở các khu bảo tồn biển như Khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang (Khánh Hòa) là khu
vực có hệ sinh thái đa dạng phong phú, được bảo vệ và cấm đánh bắt hải sản dưới mọi hình
thức. Tuy nhiên, vì lợi ích cá nhân, nhiều ngư dân đã khai thác trái phép hải sản ở đây, họ sử
dụng cả mìn để khai thác, theo ông Eniko d’ La Mancha, chủ trung tâm lặn và văn phòng du
lịch Amigos tại Nha Trang, thì họ dùng những loại mìn mà các thuyền đánh cá phi pháp
thường dùng, loại mìn nổ chìm dưới nước. Hay ở Vườn Quốc gia Đất mũi Cà Mau, theo ông
Trần Văn Mến, Phó Ban Quản lý và bảo tồn nguồn lợi thủy sản biển: nếu trước đây những
người khai thác nghêu, dùng tay cào hay te đẩy thì bây giờ họ dùng máy hút thổi nghêu vào
lưới.
- Săn bắn và buôn bán trái phép động vật hoang dã
Theo thống kê của các cơ quan chức năng, từ năm 1996 đến 2007, cả nước đã phát
hiện, xử lý 14.757 vụ việc liên quan, tịch thu 181.670 cá thể với khối lượng 635 tấn. Năm
2008 và 6 tháng đầu năm 2009, lực lượng kiểm lâm đã phát hiện, xử lý 1.946 vụ vi phạm các
quy định về quản lý và bảo vệ động vật hoang dã. Những địa phương, khu vực “nóng” nhất là
TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tây Ninh, Lâm Đồng, Thanh Hóa, Nghệ An, Điện Biên, Bình
Phước, Hà Nội Những kẻ chuyên hoạt động săn bắt, buôn bán động vật, thực vật hoang dã
quý hiếm tổ chức hoạt động rất chặt chẽ, tinh vi với đường dây quy mô ngày một lớn. Gần
đây nhất, qua vụ bắt giữ 25 tấn tê tê đông lạnh và vẩy tê tê vào tháng 10-2008 và vụ bắt 6,2
tấn ngà voi tại Cảng Hải Phòng cho thấy Việt Nam đang trở thành nơi trung chuyển động vật
hoang dã. Nơi tiêu thụ những loại động vật, thực vật hoang dã quý hiếm không ở đâu xa mà

4
chính trong cộng đồng dân cư chúng ta, tập trung chủ yếu ở các thành phố, thị xã với nhan
nhản các cửa hàng ăn “chim trời, thú rừng”, nhiều cửa hàng bày bán hàng trăm bình rượu
ngâm thú rừng các loại Có “cầu” làm việc “cung” ngày càng phát triển; làm việc ngăn chặn
việc săn bắt, vận chuyển động thực vật hoang dã quý hiếm như “muối bỏ biển”, rừng ngày
càng bị tàn phá, môi trường tự nhiên ngày càng xấu đi từ chính bàn tay và “dạ dày” con
người.[11]
Phần lớn các thành phố và thị trấn lớn ở Việt Nam có chợ buôn bán động vật hoang dã nơi có
rất nhiều loài động vật sống là đại diện của tất cả các nhóm động vật có xương sống chủ yếu,
từ tắc kè, rùa và ếch đến tê tê, hươu và linh trưởng. Các quán ăn đặc sản thường xuyên phục
vụ thịt động vật hoang dã, đôi khi quảng cáo các món ăn với những bảng giá được đặt cạnh áp
phích được in nhằm phục vụ mục đích giáo dục bảo tồn. Những người đến ăn có thể thường
xuyên xem các loài động vật bị nhốt trong chuồng (trong đó có các loài bị đe dọa toàn cầu)
như cầy và rắn. Cùng với các loài động vật hoang dã và thịt để tiêu thụ, những người bán
hàng còn tiếp thị rất nhiều loại chim sống ở các chợ lớn nhất ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí
Minh. Điều này một phần cũng là do ý thức của người dân Việt Nam như lời Anh Hoàng
Mạnh Cường, một chủ trang trại nuôi thú quý hiếm tại thành phố Buôn Ma Thuột cho biết:
“Người nước ngoài rất có ý thức cái điều là có sử dụng động vật hoang dã làm thực phẩm.
Nhưng thói quen của Việt Nam mình thì càng hoang dã thì họ càng thích dùng làm thực
phẩm.”
4. Tổng quan về phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nhận dạng loài
Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ việc nhận dạng các loài phục vụ nghiên cứu đa dạng
sinh học và ngăn chặn buôn bán trái phép động vật hoang dã các nhà khoa học thuộc nhóm
nghiên cứu của dự án Mã vạch sự sống quốc tế (iBOL) đã thiết lập một thư viện các loài sinh
vật có nhân chuẩn dựa trên một dạng phân tích mới gọi là mã vạch ADN. Công nghệ mã vạch
ADN ra đời sẽ hứa hẹn một tương lai mới, nơi mà con người có thể cập nhật nhanh chóng các
thông tin như tên, thuộc tính sinh học… của bất cứ loài sinh vật nào trên trái đất. Phương
pháp phân tích mã vạch ADN cũng sẽ là một công cụ quan trọng trong việc bảo tồn và theo
dõi các loài có tác động xấu đến sức khỏe của con người cũng như lợi ích kinh tế từ chúng.
Hiện tại, các nhà nghiên cứu đã thu thập được mã ADN của hơn 80.000 loài. Dự kiến đến
năm 2015, thư viện sẽ có được danh mục ADN của khoảng năm triệu mẫu sự sống, đại diện
cho 500.000 loài trên trái đất . Đây chỉ là một nhóm đáng kể trong tổng số 1,7 triệu loài mà
con người biết đến hiện nay . Hy vọng công nghệ này sẽ thúc đẩy việc khám phá ra rất nhiều
loài còn chưa đươ
̣
c biết đến trên trái đất.
Phương pháp mã vạch phân tử là một kỹ thuật dùng để xác định đặc điểm của các loài
sinh vật bằng cách sử dụng một trình tự ADN ngắn từ một vị trí gen tiêu chuẩn đã được kiểm
chứng. Cũng giống như mô hình độc đáo của mã vạch trong nhận dạng sản phẩm, một mã
vạch ADN là một mô hình duy nhất của trình tự ADN có thể sử dụng để nhận diện một thực
thể sống. Mã vạch ADN ngắn, khoảng 700 nucleotit, có thể được sản xuất nhanh từ hàng
nghìn mẫu vật và được phân tích rõ ràng trên các phần mềm máy tính. Mã vạch ADN cho
phép những người không phải chuyên gia nhận dạng các loài một cách khách quan, thậm chí
từ những vật liệu nhỏ, bị hư hỏng và đã được chế biến công nghiệp.
Ứng dụng công nghệ dựa trên ADN vào việc điều tra tội phạm buôn bán và tiêu thụ
động vật hoang dã đã mở ra khả năng tăng cường hiệu quả thực thi pháp luật. Ví dụ trong
trường hợp sử dụng kính kiển vi để xác định loài được cho là Linh dương Tây Tạng từ những
chiếc khăn quàng được dệt, việc xác định tới cấp độ loài có thể được thực hiện bằng cách sử
dụng việc xác định kiểu ADN nơi mà kết quả không dựa vào phán đoán chủ quan của người
kiểm tra.
*Các bước thực hiện:
- Thu thập mẫu vật động vật hoang dã trong khu vực hoặc vùng lân cận.

5
- Chiết xuất và tinh chế ADN từ mẫu mô hoặc vật liệu được chế biến.
- Khuếch đại một khu vực cụ thể của gen lục lạp hoặc ty lạp thể bằng cách PCR và
phân tích sản phẩm PCR bằng phản ứng điện li keo.
- Sử dụng Blast (Basic Local Alignment Search Tool ) để nhận diện các trình tự trong
cơ sở dữ liệu.
- Sử dụng các công cụ sắp xếp nhiều trình tự và xây dựng cây để phân tích các mối
quan hệ phát sinh loài.
* Vai trò của ADN
Bộ gen ty thể ở tế bào nhân chuẩn có 37 gen, 22 gen mã hóa ARN vận chuyển
(tARN), 2 gen mã hóa ARN ribosomal (rARN) và 13 gen khác mã hóa protein chủ yếu liên
quan đến quá trình hô hấp oxi hóa. Số lượng gen trên hệ gen ty thể phần lớn là bất biến cho
tất cả các hệ gen ty thể của các loài động vật có xương sống nhưng thứ tự của các gen có thể
thay đổi. Thứ tự của các vị trí trên hệ gen ty thể thì tương tự nhau trong các loài động vật có
vú nhưng có thể khác nhau giữa các bậc phân loại: ví dụ thứ tự khác nhau giữa gen ty thể của
gia cầm và động vật có vú.
Một lý do chính cho việc sử dụng ADN ty thể (mtADN) là không có một sự tái tổ hợp
của mtADN. Với tất cả các thành phần mã hóa của hệ gen ty thể mã hóa cho protein hoặc
phân tử ARN liên quan đến hô hấp, người ta hi vọng rằng sẽ có một sự bảo vệ các trình tự khi
bất kỳ một sự thay đổi nào ở protein hoặc phân tử ARN có thể tác động tiêu cực đến sinh vật.
Không giống như hạt nhân, không có lỗi xảy ra trong việc đọc enzyme tồn tại trong ty thể để
sữa chữa những gốc ADN được thêm vào một cách không chính xác trong suốt quá trình sao
chép. Do vậy, sự tích tụ của những thay đổi cơ sở riêng lẻ trong ty thể là cao hơn gấp 5 lần so
với những lỗi do sự sao chép trong hạt nhân. Ngoài ra có nhiều bản sao của ADN ty thể trên 1
tế bào so với 2 bản sao của ADN hạt nhân. Trong mỗi tế bào có nhiều ty thể phụ thuộc vào
loại tế bào và trong mỗi ty thể có nhiều ADN ty thể. Các ty thể có một lớp protein để bảo vệ
các mtADN khỏi sự phân hủy. Các vật liệu sinh học đã bị phân hủy cao , do đó, có khả năng
tuân theo việc xác định kiểu mtADN nhiều hơn là sự cần thiết sinh ra một hồ sơ di truyền từ
ADN hạt nhân khi xác định kiểu răng, xương hoặc tóc.
*Vị trí gen được sử dụng trong phân loại
Các vị trí gen của sự lựa chọn cho nhận dạng pháp y các loài được dựa vào các nghiên
cứu có nguồn gốc từ phân loại và cây phát sinh loài và chủ yếu được tìm thấy ở bộ gen ty thể.
Trong phạm vi mtADN một số trình tự gen được cho là thể hiện ít sự biến đổi trong cùng
chủng loại (trong các thành viên của cùng một loài) nhưng lại thể hiện đầy đủ sự biến đổi
không trong chủng loại (giữa các loài khác nhau) để cho phép ước lượng về mức độ liên quan
và số lần sai khác qua đồng hồ phân tử được hiệu chỉnh. Vị trí chính được sử dụng trong các
nghiên cứu về phân loại và phát sinh chủng loại cho đến gần đây là gen cytocrome b (cyt b)
cái mà xuất hiện giữa hai bazo 14747 và 15887 trong mtADN của người và mã hóa 1 protein
có chiều dài 380 amino axit. Vị trí cyt b đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân
loại và pháp y, bao gồm các bộ phận cơ thể của hổ, trứng rùa, vỏ và da cá sấu, sừng tê giác,
ngà voi, con công trống , mật gấu. Gần đây hơn, việc sử dụng gen cytochrome c oxidase I
(COI) đã tăng lên chủ yếu do sự thông qua của tổ chức mã vạch của sự sống (Barcod of life
consortium- CBOL). COI được tìm thấy giữa các bazo 5904 và 7945 ở mtADN người. COI
ban đầu được sử dụng để nhận dạng các loài động vật không xương sống. Chẳng bao lâu sau
nó đã trở thành vị trí lựa chọn trong côn trùng học pháp y để nhận dạng ấu trùng bọ cánh cứng
trên xác chết. Vì đây là một vị trí có thể nhận dạng những loài này, nó đã được sử dụng nhiều
hơn với mục tiêu trở thành vị trí được lựa chọn cho nhận dạng tất cả các loài động vật.
Các vị trí gen khác trên hệ gen ty thể cũng đã được sử dụng trong nhận dạng một số
loài. Chúng bao gồm các vị trí rARN 12s và 16s và họ gen NDH. D- loop (Displacement-
loop) được sử dụng ít trong nhận dạng các loài nhưng nhiều hơn trong nhận dạng các loài
trong cùng chủng loại. Bởi vì sự biến đổi lớn hơn ở các trình tự không được mã hóa, nó bây

6
giờ đang được sử dụng như một công cụ để nhận dạng sự có mặt của một loài đặc biệt trong
hỗn hợp nhiều loài khác nhau.
*Sự biến đổi trong loài và khác loài gen Cyt b và COI
Bằng cách sử dụng mô hình2 tham số Kimura (K2P- Kimura 2-parameter model),
nhìn chung các tác giả nhận định rằng sự thay đổi trong cùng loài nằm trong phạm vi < 2-3%
(giữa 7.93% và 0.43% với loài chim cho COI; giữa 5.7% và 1.5% với loài Stenella cho Cyt
b). Khi những bất thường nảy sinh, điều này được hiểu là các loài ẩn sinh mặc dù các loài ẩn
sinh này có thể được dựa vào biến đổi trong loài từ chỉ 2 cá thể.
5. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
*Đối tượng nghiên cứu
Các loài động vật được nghiên cứu trong đề tài nằm trong nghị định 32/2006/ND-CP
về quản lý động vật rừng, thực vật rừng nguy cấp, quí hiếm tại Việt Nam, gồm 62 loài động
vật nghiêm cấm khai thác sử dụng và 89 loài hạn chế khai thác sử dụng. (xem phần Phụ lục)
Xác định được trình tự gen từ Ngân hàng gen (gen bank) của : 112 loài, 106 loài có trình tự
gen Cyt b và 42 loài có trình tự gen COI.
- 222 trình tự gen Cytb
- 83 trình tự gen COI
*Phương pháp nghiên cứu
- Sử dụng phần mềm Mega để ước tính sự sai khác dựa vào khoảng cách các trình tự ADN
của các loài
Tất cả các trình tự sau khi tải từ ngân hàng gen (Genbank) về sẽ được sắp xếp ở dạng
matrix bằng cách sử dụng phần mềm Paup 4.0 beta 10 win. Trước khi được sắp xếp thành
dạng ma trận chúng sẽ được sắp xếp đúng thứ tự trong phần mềm Bioedit để có độ dài đoạn
gen bằng nhau. Sau khi đưa dữ liệu trình tự vào phần mềm Mega5.05 các trình tự sẽ được cắt
tỉa ở vị trí có chiều dài 650 nucleotit. Thành phần trình tự và mô hình thay thế cho toàn bộ bộ
dữ liệu, số lượng của nucleotit và các vị trí amino axit có thể thay đổi và sự sai lệch của cặp
trình tự 2 thông số Kimura (K2P) trong phạm vi nhóm ở nhiều mức độ phân loại (trong cùng
loài, giữa các loài cùng chi và giữa các loài ở các chi khác nhau trong cùng một họ) đã được
tính toán trong Mega5.05. Các loài được sắp xếp vào một trong bốn loại sau dựa vào khoảng
cách cặp K2P: loại I (khoảng cách trong loài lớn nhất <2%, khoảng cách giữa các loài bé nhất
<2%); loại II (khoảng cách trong loài lớn nhất = 2%, khoảng cách giữa các chủng loại bé nhất
<2%); loại III (khoảng cách trong loài lớn nhất <2% và khoảng cách giữa các loài bé nhất
£2%); loại IV (khoảng cách trong loài lớn nhất = 2% và khoảng cách giữa các loài bé nhất
£2%). Ở những loài mà chỉ có một cá thể được lấy mẫu thì các loại I, II, III và IV được bỏ qua
vì chỉ có khoảng cách giữa các loài khác nhau được ước lượng.
- Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài
Hai cây phát sinh loài theo phương pháp p- distance được xây dựng cho tất cả các
trình tự gen Cyt b và COI trong Mega5 để có thể hình dung được nguồn gốc phát sinh của các
loài cũng như kiểm tra được liệu có loài nào bị xác định nhầm kiểu gen hay không.
-Phương pháp đánh giá mức độ hiệu quả trong nhận dạng loài dựa vào khoảng cách
Bằng cách thống kê các số liệu và tính toán tỷ lệ % thông thường để đưa ra những kết
quả cần thiết và đánh giá kết quả đó thông qua sự so sánh.
6. Các kết quả đạt được
*Khoảng cách di truyền gen Cyt b
Bảng 1: Khoảng cách di truyền trung bình gen Cyt b
STT
Họ
K/c di truyền trung
bình gen Cytb

7
1
Mustelidae (họ Chồn)
35.3%
2
Felidae (họ Mèo)
26.8%
3
Cervidae (họ Hươu nai)
5.6%
4
Moschidae (họ Hươu xạ)
43.3%
5
Phasianidae (họ Trĩ)
26.3%
6
Pteropodidae (họ Dơi quạ)
0.8%
7
Sciuridae (họ Sóc)
14.6%
8
Accitripidae (họ Ưng)
0.00%
9
Psitacidae ( họ Vẹt)
5.1%
10
Tytonidae (họ Cú lợn)
10.8%
11
Sturnidae (họ Sáo)
0.00%
12
Varanidae (họ Kỳ đà)
0.00%
13
Colubridae (họ Rắn nước)
0.3%
14
Elapidae (họ Rắn hổ)
29.6%
15
Geoemydidae (họ Rùa đầm)
17%
16
Testudinidae (họ Rùa cạn)
21.5%
17
Crocodylidae (họ Cá sấu)
1.4%
18
Cadinae (họ Chó)
10.6%
19
Chelydridae
0.00%
20
Papilionidae (họ Bướm phương)
0.00%
21
Hylopatidae (họ Vượn)
15.2%
22
Cynocephalidae (họ Chồn)
5.9%
23
Lorisidae (họ Cu li)
4.5%
24
Cercopithecidae (họ Khỉ)
35.1%
25
Ursidae (họ Gấu)
28.5%
26
Elephantidae (họ Voi)
2.1%
27
Bovidae (họ Bò)
19.2%
28
Viveridae (họ Cầy)
12.5%
29
Tragulidae (họ Cheo Cheo)
7.1%
30
Bucerotidae (họ Hồng hoàng)
8.7%
31
Timaliidae (họ Khướu)
9.8%
32
Pythonidae (họ Trăn)
26%
33
Salamandridae (họ Kỳ giông)
0.1%
34
Threskiornithidae (họ Cò quăm)
42.4%
35
Manidae (họ Tê tê)
0.4%

Khoảng cách trung bình tối đa
43.3%

8


*Khoảng cách di truyền gen COI
Bảng 2: Khoảng cách di truyền trung bình gen COI
STT
Họ
K/c di truyền trung
bình gen COI
1
Mustelidae (họ Chồn)
0.5%
2
Felidae (họ mèo)
43.6%
3
Cervidae (họ Hươu nai)
0.00%
4
Moschidae (họ Hươu xạ)
0.6%
5
Phasianidae (họ Trĩ)
0.2%
6
Pteropodidae (họ Dơi quạ)
1.7%
7
Sciuridae (họ Sóc)
10.4%
8
Accitripidae (họ Ưng)
0.00%
9
Psitacidae (họ Vẹt)
9.6%
10
Tytonidae (họ Cú lợn)
0.2%
11
Sturnidae (họ Sáo)
0.00%
12
Varanidae (họ Kỳ đà)
12.6%
13
Colubridae (họ Rắn nước)
18.5%
14
Elapidae (họ Rắn hổ)
11%
15
Geoemydidae (họ Rùa đầm)
9.2%
16
Testudinidae (họ Rùa cạn)
6.8%
17
Crocodylidae (họ Cá sấu)
53%
18
Cadinae (họ Chó)
37.5%
19
Chelydridae
4.1%
20
Papilionidae (họ Bướm phượng)
31.4%
21
Muscicapidae
0.4%

Khoảng cách trung bình tối đa
53%

Khoảng cách trung bình chung
33.6%

* So sánh khoảng cách di truyền trung bình giữa hai gen Cyt b và COI
Bảng 3: So sánh khoảng cách di truyền trung bình ở một số họ giữa kiểu gen Cyt b và
COI

Khoảng cách trung bình chung
40.3%
STT
Họ
Cyt b
COI

9

-
Nhậ
n
xét:

Tron
g số
12
họ
nêu
trên
thì:
+Có
1 họ
là:
Accitripidae có khoảng cách di truyền trung bình bằng nhau và bằng 0% ở cả 2 kiểu gen COI
và Cyt b.
+Có 5 họ (Moschidae,Sciuridae,Elapidae,Testudinidae,Geoemydidae) mà ở đó khoảng cách
di truyền trung bình theo kiểu gen Cyt b lớn hơn COI, nằm từ 14.6%- 43.3%.
+Có 6 họ (Pteropodidae,Psitacidae,Sturnidae,Chelydridae,Cadinae,Crocodylidae) mà ở đó
khoảng cách di truyền trung bình theo kiểu gen COI lớn hơn theo kiểu gen Cyt b, nằm từ
0.1%- 53%.
+Khoảng cách di truyền trung bình lớn nhất với kiểu gen Cyt b là 43.3% ở họ Moschidae (họ
Hươu xạ), với kiểu gen COI là 53% ở họ Crocodylidae (họ Cá sấu).
+ Khoảng cách di truyền trung bình cho toàn bộ các loài trong 13 họ nêu trên là: 36.5% với
Cyt b và 32.5% với COI.
*Khoảng cách di truyền trong loài






1
Moschidae
43.3%
0.6%
2
Pteropodidae
0.8%
1.7%
3
Sciuridae
14.6%
10.4%
4
Accitripidae
0.00%
0%
5
Psitacidae
5.1%
9.6%
6
Sturnidae
0.00%
0.1%
7
Elapidae
29.6%
11%
8
Geoemydidae
17%
9.2%
9
Testudinidae
21.5%
6.8%
10
Crocodylidae
1.4%
53%
11
Cadinae
10.6%
37.5%
12
Chelydridae
0.00%
4.1%

Khoảng cách trung bình lớn
nhất
43.3%
53%

Khoảng cách trung bình
chung
36.5%
32.5%

10


Bảng 4: Thống kê các thông số về khoảng cách trong loài theo tỷ lệ %
Kiểu gen
Các
Thông số
Cyt b
COI
Số loài
%
Số loài
%
Tổng số loài có khoảng cách di
truyền trong loài
68
100%
22
100%
Số loài có k/c di truyền trong
loài từ trung bình đến cao
(>2%)
17
25%
4
18%

Số loài có k/c di truyền trong
loài biến đổi từ thấp đến cao
15
22%
4
18%
Số loài có k/c di truyền trong
loài nằm ở mức thấp (0- 2%)
36
53%
14
64%
*Nhận xét:
+Với cả 2 kiểu gen thì chiếm một tỷ lệ lớn vẫn là số loài có khoảng cách di truyền trong loài
ở mức thấp: 53% ở Cyt b và 64% ở COI.
+ Với số loài có khoảng cách di truyền ở mức trung bình đến cao thì gen Cyt b chiếm tỷ lệ
cao hơn Cyt b một chút (25% so với 18%). Tương tự về tỷ lệ như thế là số loài có khoảng
cách biến thiên từ thấp đến cao.
* So sánh khoảng cách di truyền trong loài giữa hai kiểu gen COI và Cyt b






Bảng 5: So sánh khoảng cách trong loài ở một số loài

STT
Loài
Khoảng cách
trong loài gen Cyt
b
Khoảng cách
trong loài gen
COI
Tên tiếng Việt
Tên khoa học
1
Hổ
Panthera tigris
31%
0 - 63%

11
2
Hươu vàng
Axis (Cervus)
porcinus
0 - 1%
0%
3
Hươu xạ
Moschus
berezovskii
43.3%
3 - 9%
4
Gà lôi trắng
Lophura
nycthemera
50.2%
0 - 5%
5
Dơi ngựa lớn
Pteropus vampyrus
0.7 - 1.3%
1.7%
6
Cáo lửa
Vulpes vulpes
1%
0%
7
Triết nâu
Mustela nivalis
0.1 - 6.4%
0.2 - 0.8%
8
Diều hoa miến
điện
Spilornis cheela
0%
0%
9
Cú lợn lưng xám
Tyto alba
0 - 8%
0.2%
10
Nhổng
Gracula religiosa
0%
0.1%
11
Rắn ráo trâu
Ptyas mucosus
0.3%
18.5%
12
Rắn cạp nia bắc
Bungarus
multicinctus
0%
0 - 0.2%
13
Rùa đầu to
Platysternum
megacephalum
0%
0.3 - 6.1%
14
Rùa núi vàng
Indotestudo
elongata
29%
0.5%
15
Rùa núi viền
Manouria impressa
0%
0.2 - 0.8%
16
Cá sấu hoa cà
Crocodylus porosus
0%
75%
17
Cá sấu nước
ngọt
Crocodylus
siamensis
0%
75%

*Nhận xét: Trong số 17 loài có cả khoảng cách di truyền trong loài theo cả hai kiểu gen trên
thì:
+ Có 6 loài có khoảng cách di truyền trong loài theo kiểu gen Cyt b lớn hơn COI.
+ Có 8 loài có khoảng cách di truyền theo kiểu gen COI lớn hơn Cyt b.
+ Với gen Cyt b khoảng cách di truyền trong loài lớn nhất là 50.2% ở loài Gà lôi trắng
(Lophura nycthemera), với gen COI là 75% ở loài cá sấu hoa cà (Crocodylus porosus) và cá
sấu nước ngọt (Crocodylus siamensis).





12








*Cây phát sinh loài gen Cyt b

13

Hình 1: Cây phát sinh loài gen Cyt b


Kiểm tra cây phát sinh loài với gen Cyt b thì có một số loài đã bị xác định nhầm là:
+Gà lôi mào trắng (Lophura edwardsi) và Gà lôi Hà Tĩnh (Lophura hatinhensis).

14


Hình 2: Một minh họa cho việc một số loài đã bị đặt nhầm chỗ trên cây phát sinh loài
Cyt b.
Như có thể nhìn thấy từ hình vẽ thì 2 loài là Gà lôi mào trắng (Lophura edwardsi) và
Gà lôi Hà Tĩnh (Lophura hatinhensis) đã bị xem là 1 loài.








*Cây phát sinh loài gen COI

15

Hình 3: Cây phát sinh loài gen COI
Kiểm tra cây phát sinh loài gen COI thì không có loài nào bị đặt nhầm chỗ.

*Thảo luận

Với đối tượng nghiên cứu là các loài động vật hoang dã nằm trong nghị định 32-
ND/CP của chính phủ về quản lý động thực vật rừng nguy cấp bao gồm 151 loài động vật

16
thuộc 52 họ thì nghiên cứu đã xác định được trình tự gen Cyt b và COI của tất cả 112 loài.
Trong đó 106 loài có trình tự gen Cyt b và 42 loài có trình tự gen COI.
*Về khả năng nhận dạng loài của mã vạch ADN gen Cyt b và COI:
- Với khoảng cách di truyền trung bình cho toàn bộ các loài có trình tự gen Cyt b và COI lần
lượt là 40.3% và 33.6% có thể thấy rằng đây là khoảng cách tương đối lớn, cho phép chúng ta
có thể phân biệt được các loài động vật. Tuy nhiên khoảng cách di truyền không ổn định và
tương đồng ở từng loài với nhau. Điều này được thể hiện qua sự biến đổi của khoảng cách di
truyền trung bình trong từng họ. Có những họ khoảng cách bằng 0% nhưng có những họ
khoảng cách lên tới trên 50% ở cả hai kiểu gen. Cụ thể với từng kiểu gen như bảng sau:
Bảng 6: Thống kê các thông số về khoảng cách di truyền 2 kiểu gen ty thể Cyt b và COI

Cyt b
COI
Số loài
106
42
Số họ
35
21
K/c di truyền TB cho toàn bộ
loài
40.3%
33.6%
K/c di truyền TB lớn nhất theo
họ
43.3 ở họ Moschidae (họ
Hươu xạ)
53% ở họ
Crocodylidae (họ Cá
sấu)
Tỷ lệ % số họ có k/c di truyền
TB thấp (0 - 2%)
31.5%
43%
Tỷ lệ % số họ k/c di truyền TB
cao(>= 2%)
68.5%
57%
*So sánh khả năng nhận dạng loài của 2 gen Cyt b và COI:
Chọn ra 12 họ có sự tương đồng nhất về số loài có cả trình tự gen Cyt b và COI để so
sánh thì có thể thấy rằng mặc dù khoảng cách di truyền trung bình lớn nhất nằm ở gen COI
(53% so với 43.3% của Cyt b) nhưng gen Cyt b vẫn thể hiện sự vượt trội hơn về khả năng
nhận diện loài với khoảng cách di truyền trung bình gen Cyt b lớn hơn COI (36.5% so với
32.5%) và tỷ lệ % số họ có khoảng cách trung bình cao (>= 2%) lớn hơn (68.5% so với 57%).
*Về khoảng cách trong loài
- Theo phân tích ở phần trên thì với cả hai kiểu gen khoảng cách trong loài của 68 loài theo
kiểu gen Cyt b và 22 loài theo kiểu gen COI có sự biến đổi từ thấp đến cao (0 % - >50%). Tuy
nhiên chiếm một tỷ lệ lớn vẫn là sự sai lệch trong loài ở mức thấp (0 – 2%). Điều này cho
thấy việc sử dụng mã vạch ADN đã phân biệt được một phần lớn các loài. Với những loài mà
có khoảng cách trong loài cao như: Hươu xạ (Moschus berezovskii) 43.3%, Gà lôi trắng
(Lophura nycthemera) 50.2% cần có thêm những phân tích sâu hơn để xác nhận tính chính
xác của các trình tự đã được đưa lên ngân hàng gen.
* Về cây phát sinh loài

17
Qua cây phát sinh loài chúng ta có thể thấy rằng có một số loài đã bị xác định sai trình
tự gen trên Genbank, tức là nếu như trên Genbank đó là hai loài khác nhau thì trong cây phát
sinh loài đó lại chỉ là cùng là một loài. Với cây phát sinh loài Cyt b chúng ta đã phát hiện
được 2 loài bị xác định nhầm là Gà lôi mào trắng (Lophura edwardsi) và Gà lôi Hà Tĩnh
(Lophura hatinhensis). Còn với cây phát sinh loài gen COI đã không có loài nào bị xác định
nhầm. Nguyên nhân gây ra sự sai sót này có thể là sự thiếu cẩn thận trong quá trình sequence
trình tự gen nhưng phần lớn là sự nhầm lẫn ở khâu định loại.

7. Kết luận và kiến nghị
+ Nêu ra được những nguyên nhân gây ra suy giảm đa dạng tại Việt Nam và tính cấp thiết
cần xây dựng một cơ sở dữ liệu sinh học phân tử giúp cho các nhà quản lý và nhà khoa học
trong công tác bảo tồn đa dạng sinh học tại Việt Nam.
+ Tổng quan các tài liệu trên thế giới để nêu ra được tính ưu việt trong việc sử dụng ADN
đặc biệt là các gen ty thể trong việc nhận biết các loài bằng phương pháp này.
+ Tổng hợp được tất cả các chuỗi ADN thuộc 2 gen được dùng phổ biến nhất hiện nay
là gen cyt b và gen COI từ ngân hàng gen đối với các loài được ưu tiên bảo vệ trong Nghị
định 32 của chính phủ (151 loài). Xác định được trình tự gen từ Ngân hàng gen (gen bank)
của : 112 loài, 106 loài có trình tự gen Cyt b và 42 loài có trình tự gen COI.
- 222 trình tự gen Cytb
- 83 trình tự gen COI
+ Đánh giá được khả năng nhận dạng loài dựa vào khoảng cách di truyền gen COI và Cyt b.
Nhìn chung, với cả 2 kiểu gen thì khoảng cách di truyền trung bình cho toàn bộ các loài là
tương đối lớn: 40.3% với Cyt b và 33.6% với COI.
+ So sánh được hiệu quả nhận dạng giữa hai kiểu gen Cyt b và COI. Cụ thể là xét trong phạm
vi 12 họ có sự tương đồng nhất về trình tự gen Cyt b và COI thì mặc dù khoảng cách di truyền
trung bình theo họ lớn nhất nằm ở gen COI (53% so với 43.3% của Cyt b) nhưng gen Cyt b
vẫn thể hiện sự vượt trội hơn về khả năng nhận dạng các loài.
+ Đánh giá được khoảng cách di truyền trong chủng loại ở cả hai kiểu gen Cyt b và COI. Có
thể thấy rằng chiếm một tỷ lệ lớn là khoảng cách trong chủng loại bằng 0% và nhỏ hơn 2% ở
tất cả các loài. Chỉ có 25 % số loài ở gen Cyt b và 18% ở gen COI là có khoảng cách trong
chủng loại lớn (> 2%).
+ Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho tất cả các loài ở cả hai kiểu gen COI và Cyt b, qua
đó cho thấy những dữ liệu trên ngân hàng gen còn có nhiều thiếu sót và chưa thể sử dụng
ngay trong điều kiện Việt Nam. Vì vậy cần phải chuẩn hóa cơ sở dữ liệu này.


18
+ Kiến nghị cần phải có thêm những nghiên cứu về nhận dạng loài dựa vào đặc điểm di
truyền để hoàn thiện hơn cơ sở dữ liệu cho nhận dạng loài và cần xác định các trình tự gen
Cytb và COI còn thiếu trên cơ sở dữ liệu genbank để có những đánh giá chính xác hơn.

References
Tiếng Việt
1. Nguyễn Nghĩa Thìn (2008), “Đa dạng sinh học Việt Nam và vấn đề
bảo tồn”, Kỷ yếu hội thảo quốc tế Việt Nam học lần thứ ba.
2. Pilgrim, J. D. và Nguyễn Đức Tú (2007), “Thông tin cơ sở về các loài bị đe dọa và
các loài ngoại lai tại Việt Nam và các đề xuất cho nội dung của Luật Đa dạng Sinh
học”, Báo cáo trình Vụ Môi trường, Bộ Tài nguyên và Môi trường, Hà Nội, Chương
trình BirdLife Quốc tế tại Việt Nam.
3. Eleanor Jane Sterling, Martha Maud Hurley, Lê Đức Minh (2006), “Lịch sử tự nhiên
VN”, NXB Yale University Press, Lon Don.
4. Lê Xuân Cảnh, Hồ Thanh Hải (2010), “Hiện trạng và suy thoái đa dạng sinh học ở
Việt Nam”, Báo cáo Hội nghị khoa học về đa dạng sinh học tại Việt Nam, Viện tài
nguyên và sinh thái sinh vật.
Website
5.http://www.rfa.org/vietnamese/in_depth/Wildlife-trade-and-consumption-in-vietnam-vha-
07192009110242.html
6.http://www.cpv.org.vn/cpv/Modules/Preview/printPreview.aspx?co_id=10008&cn_id=5341
23.
7.http://dangcongsan.vn/cpv/Modules/Preview/PrintPreview.aspx?co_id=7338497&cn_id=35
7168.
8.http://baodatviet.vn/Home/congdongviet/10-loai-vat-da-bien-mat-hoan-toan-o-Viet-
Nam/201110/174787.datviet.
9.http://www.monre.gov.vn/v35/default.aspx?tabid=428&cateID=24&id=103482&code=QC5
C103482
10.http://www.baomoi.com/Home/ThoiSu/www.cpv.org.vn/Tich-cuc-gop-phan-dau-tranh-
chong-nan-buon-ban-dong-vat-hoang-da.
11.http://www.cuuchienbinh.com.vn/index.aspx?Menu=1314&Chitiet=1225&Style=1.
12. http://www.thanhniennews.com/2010/Pages/20110605163024.aspx
Tiếng Anh

19
13. Adrian Linacre1*, Shanan S Tobe2 (2011), “An overview to the investigative approach
to species testing in wildlife forensic science”, Linacre and Tobe Investigative Genetics 2011
(http://www.investigativegenetics.com/content/2/1/2).
14. “A New Tool for Identifying Biological Specimens and Managing Species Diversity”
(www.dnabarcodes.org)
15. Using DNA Barcodes to Identify and Classify Living Things
(http://www.dnabarcoding101.org/introduction.html)
16. B. N. REID,* M. LE,†‡§ W. P. MCCORD,¶ J. B. IVERSON,** A. GEORGES,†† T.
BERGMANN,‡‡G. AMATO,§§ R. DESALLE§§ and E . NAR O- MAC IE L §§¶¶ (2011),
“Comparing and combining distance-based and character-based approaches for barcoding
turtles”, Molecular Ecology Resources.
17. Vietnam Biodiversity Report (2005)
18. Nguyen Van Sang, Ho Thu Cuc, Nguyen Quang Truong (2009), “Herpetofauna of
Vietnam”, Edition Chimaira, 768 pp.

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×