Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua, đu đủ, thanh long sau thu hoạch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------   ------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm hệ enzyme
ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua,
đu đủ, thanh long sau thu hoạch”

Sinh viên thực hiện

: Dương Thị Thiện

Ngành

: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Đặng Xuân Nghiêm


“Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu
cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”.

HÀ NỘI - 2013


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của tôi với sự giúp đỡ tận
tình của thầy giáo hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trung
thực, chưa từng được sử dụng. Các thông tin, trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc và tôi
xin chịu trách nhiệm về những số liệu trong bài khóa luận này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2013

Sinh viên

Dương Thị Thiện

i


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, được sự quan tâm,
giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của
Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công nghệ
sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quan trọng và quý báu trong
suốt thời gian học tập, rèn luyện tại trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Đặng Xuân Nghiêm đã
tận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Văn Giang và các thầy cô đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ vi
sinh.
Tôi xin cảm ơn KS. Đỗ Hải Quỳnh, KS. Nguyễn Khắc Hải , KS. Nguyễn Thu
Hương đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực tập.

Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoa Công
nghệ sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp.
Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn
tới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo động
lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!
Sinh viên

Dương Thị Thiện

ii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AS

: Axit Sorbic

Cs.

: Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

ĐH

: Đại học
Internal Transcribed Spacer – vùng đệm bên

ITS

: trong được phiên mã của Rdna

KS.

: Kỹ sư

PCR

: Polymerase chain reaction

PDA

: Potato dextrose agar

ppm

: Parts per million (w/v)

Sbi

: Sodium Bisulphite

TS.

: Tiến sĩ

iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................iii
MỤC LỤC.................................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................................viii
TÓM TẮT................................................................................................................................viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu............................................................................................................2
1.2.1. Mục đích..................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu.....................................................................................................................2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................3
2.1. Khái quát về nấm mốc hại quả............................................................................................3
2.2 Nấm mốc trên ba loại quả....................................................................................................3
2.2.1. Nấm mốc hại quả cà chua........................................................................................3
2.2.2. Nấm mốc hại quả đu đủ...........................................................................................5
2.2.3. Nấm mốc hại quả thanh long...................................................................................7
2.3.Đặc điểm hệ enzyme ngoại bào nấm mốc...........................................................................8
2.3.1. Các loại enzyme chính có trong nấm mốc.......................................................................8
2.3.2. Mối tương quan giữa hoạt động của hệ enzyme ngoại bào và khả năng gây thối. 10
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...........................................................................12
3.1. Vật liệu..............................................................................................................................12
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................12
3.1.2. Hóa chất và môi trường..........................................................................................12
3.1.3. Máy móc thiết bị....................................................................................................13
3.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................14
3.2.1. Phân lập và lây nhiễm nhân tạo.............................................................................14
3.2.1.3. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo........................................................................15
3.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm mốc bằng phương pháp giải trình
tự vùng ITS - rDNA..........................................................................................................16
3.2.4. Phương pháp tách chiết enzyme ngoại bào nấm mốc............................................17
3.2.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme ngoại bào bằng
phương pháp khuếch tán đĩa thạch....................................................................................18
3.2.6. Thử khả năng sinh trưởng của nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất..........19

iv


PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................................20
4.1 Phân lập..............................................................................................................................20
4.2. Lây nhiễm nhân tạo...........................................................................................................20
4.2.1. Trên đu đủ..............................................................................................................21
4.2.2. Trên cà chua...........................................................................................................22
4.2.3. Trên thanh long......................................................................................................24
4.3. Định danh bằng phương pháp quan sát quan sát đặc tính hình thái và giải trình tự vùng
ITS – rDNA của các chủng nấm mốc................................................................................27
4.3.1. Định danh bằng quan sát đặc tính hình thái các chủng nấm mốc..........................27
4.3.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.....................................................29
Cây phát sinh chủng loại của chủng TH17 cho thấy chủng này có hệ số tin cậy với giá trị
Bootstrap lần lượt là 37 và 54 với 2 loài Fusarium verticillioides và Fusarium
oxysporum. Đối chiếu với đặc điểm hình thái của chủng TH17 có thể kết luận được
chủng TH17 thuộc loài Fusarium verticillioides...............................................................32
4.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme..................................32
4.4.1. Ảnh hưởng của pH.................................................................................................32
4.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ.........................................................................................37
4.5. Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất chống nấm
41
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................44
5.1. Kết luận.............................................................................................................................44
5.2. Kiến nghị...........................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................................45
Tài liệu Tiếng Việt....................................................................................................................45
Tài liệu Tiếng Anh....................................................................................................................45

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................iii
MỤC LỤC.................................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................................viii
TÓM TẮT................................................................................................................................viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu............................................................................................................2
1.2.1. Mục đích..................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu.....................................................................................................................2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................3
2.1. Khái quát về nấm mốc hại quả............................................................................................3
2.2 Nấm mốc trên ba loại quả....................................................................................................3
2.2.1. Nấm mốc hại quả cà chua........................................................................................3
2.2.2. Nấm mốc hại quả đu đủ...........................................................................................5
2.2.3. Nấm mốc hại quả thanh long...................................................................................7
2.3.Đặc điểm hệ enzyme ngoại bào nấm mốc...........................................................................8
2.3.1. Các loại enzyme chính có trong nấm mốc.......................................................................8
2.3.2. Mối tương quan giữa hoạt động của hệ enzyme ngoại bào và khả năng gây thối. 10
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...........................................................................12
3.1. Vật liệu..............................................................................................................................12
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................12
3.1.2. Hóa chất và môi trường..........................................................................................12
3.1.3. Máy móc thiết bị....................................................................................................13
3.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................14
3.2.1. Phân lập và lây nhiễm nhân tạo.............................................................................14
3.2.1.3. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo........................................................................15
3.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm mốc bằng phương pháp giải trình
tự vùng ITS - rDNA..........................................................................................................16
3.2.4. Phương pháp tách chiết enzyme ngoại bào nấm mốc............................................17
3.2.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme ngoại bào bằng
phương pháp khuếch tán đĩa thạch....................................................................................18
3.2.6. Thử khả năng sinh trưởng của nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất..........19

vi


PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................................20
4.1 Phân lập..............................................................................................................................20
4.2. Lây nhiễm nhân tạo...........................................................................................................20
4.2.1. Trên đu đủ..............................................................................................................21
4.2.2. Trên cà chua...........................................................................................................22
4.2.3. Trên thanh long......................................................................................................24
4.3. Định danh bằng phương pháp quan sát quan sát đặc tính hình thái và giải trình tự vùng
ITS – rDNA của các chủng nấm mốc................................................................................27
4.3.1. Định danh bằng quan sát đặc tính hình thái các chủng nấm mốc..........................27
4.3.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.....................................................29
Cây phát sinh chủng loại của chủng TH17 cho thấy chủng này có hệ số tin cậy với giá trị
Bootstrap lần lượt là 37 và 54 với 2 loài Fusarium verticillioides và Fusarium
oxysporum. Đối chiếu với đặc điểm hình thái của chủng TH17 có thể kết luận được
chủng TH17 thuộc loài Fusarium verticillioides...............................................................32
4.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme..................................32
4.4.1. Ảnh hưởng của pH.................................................................................................32
4.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ.........................................................................................37
4.5. Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất chống nấm
41
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................44
5.1. Kết luận.............................................................................................................................44
5.2. Kiến nghị...........................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................................45
Tài liệu Tiếng Việt....................................................................................................................45
Tài liệu Tiếng Anh....................................................................................................................45

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Vị trí gắn mồi ITS1 và ITS4 trên cụm gene rDNA...................................................17
Hình 4.1: Nấm mốc TH25 gây thối trên 3 miếng đu đủ: (a) xanh, (b) ương, (c) chín..............22
Hình 4.2: Nấm mốc TH17 gây thối trên 3 miếng đu đủ: (a) xanh, (b) ương, (c) chín..............22
Hình 4.3: Nấm mốc TH12 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín.................................24
Hình 4.4: Nấm mốc TH25 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín.................................24
Hình 4.5: Nấm mốc TH3 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín...................................24
Hình 4.6. Nấm mốc TH3 gây thối trên quả thanh long tại 3 vị trí: (a) đầu, (b) giữa, (c) cuối..27
Hình 4.7. Nấm mốc TH23 gây thối trên quả thanh long tại 3 vị trí: (a) đầu, (b) giữa, (c) cuối27
Hình 4.8. Cây phát sinh chủng loại chủng TH9( số ở gốc nhánh là giá trị bootstrap)..............31
Hình 4.9. Cây phát sinh chủng loại chủng TH17 (số ở gốc nhánh là giá trị bootstrap)............32
Hình 4.10. Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau...........33
Hình 4.11. Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau..........34
Hình 4.12. Hoạt tính lipase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau...............35
Hình 4.13. Hoạt tính pectinase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau.........36
Hình 4.14.Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau............37
Hình 4.15. Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau...38
Hình 4.16. Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau..38
Hình 4.17. Hoạt tính lipase ngoại bào ở các nhiệt độ khác nhau..............................................39
Hình 4.18. Hoạt tính pectinase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau. 40
Hình 4.19. Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau...40
Hình 4.20. khả năng phát triển của nấm mốc trên các loại môi trường....................................43

TÓM TẮT

Nấm mốc là nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại nghiêm trọng đối với hoa quả
sau thu hoạch, với giả thiết mức độ gây thối có liên quan tới hoạt động hệ enzyme
ngoại bào của nấm mốc, tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc
điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua, đu đủ, thanh
long sau thu hoạch”.
Những công việc chính trong đề tài bao gồm phân lập các chủng nấm từ ba loại
quả cà chua, đu đủ, thanh long thối hỏng, thử lây nhiêm nhân tạo đánh giá mức độ gây

viii


thối trên ba loại quả cà chua, đu đủ, thanh long. Định danh các chủng nấm mốc phân
lập được dựa vào đặc điểm hình thái và phương pháp sinh học phân tử, khảo sát đặc
điểm của hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc.
Trong phạm vi đề tài, từ 14 mẫu quả bị thối hỏng, 25 chủng nấm mốc đã được phân
lập. Kết quả định danh dựa trên các đặc điểm hình thái và giải trịnh tự cho thấy các chủng
nấm mốc thuộc các chi: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Collectitrichum, Rhizopus,
Phoma, Cladosporium, Acremonium, Mucor, Lasiodiplodia. Đồng thời, kết quả lây nhiễm
ngược của các chủng nấm mốc với quả đu đủ và cà chua, thanh long cho thấy, tất cả các
chủng nấm mốc phân lập được đều gây thối quả đu đủ và cà chua, thanh long không bị
bệnh với mức độ gây thối khác nhau. Kết quả có chín chủng gây bệnh mạnh trên ba loại quả
đu đủ, thanh long và cà chua thuộc chi Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Mucor.
Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc cho thấy
21/25 chủng nấm mốc có hoạt tính pectinase; 17/25 chủng có hoạt tính cellulase và
lipase; 16/25 chủng có hoạt tính protease; 15/25 chủng có hoạt tính amylase. Chủng
TH9 gây thối mạnh trên cả quả đu đủ ương và chín có hoạt tính cellulase, pectinase,
amylase và lipase mạnh. Các chủng TH3, TH20, TH23, TH25 gây thối mạnh trên cả 3
loại quả nhưng không có hoạt tính cellulose và hoạt tính pectinase, amylase, lipase,
protease đều yếu.

ix


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Các sản phẩm rau quả của nước ta không chỉ phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước mà
còn là mặt hàng xuất khẩu được nhiều nước ưa chuộng. Hàng năm nước ta thu về hàng trăm
triệu USD từ việc xuất khẩu rau quả. Tuy nhiên, việc xuất khẩu vẫn có nhiều hạn chế, mà
nguyên nhân chủ yếu là do tình trạng hư hỏng của rau quả sau khi thu hoạch còn rất cao, theo
thống kê của Cục Chế biến, Thương mại Nông - lâm - Thủy sản và Nghề muối (Bộ Nông
nghiệp và PTNT), tổn thất sau thu hoạch đối với các loại quả lên tới 25%.
Các loại quả sau thu hoạch có thể bị nhiều tác nhân gây bệnh xâm hại đặc biệt là
nấm mốc. Chất lượng của các loại trái cây phụ thuộc vào chất lượng và hàm lượng của
các loại đường, vitamin, acid amin, acid hữu cơ và một số chất thiết yếu khác trong
chúng. Trong khi đó, các loại nấm hại làm hỏng, biến dạng, gây thối quả làm giảm đáng
kể chất lượng quả sau khi thu hoạch (Rathod và cs, 2012; Awoite và cs, 2013). Vì vậy việc
nghiên cứu các loại nấm hại sau thu hoạch rất cần thiết để làm tiền đề cho nghiên cứu các
biện pháp xử lý, bảo quản hiệu quả.
Cà chua, đu đủ, thanh long là những loại quả phổ biến, dễ trồng, cho năng suất
cao và giá trị kinh tế lớn, ngoài ra chúng còn là những thực phẩm quan trọng nên xuất
hiện trong khẩu phần ăn hàng ngày nhằm bổ sung chất dinh dưỡng và các loại vitamin
cần thiết cho cơ thể con người. Nhưng các loại quả này lại rất dễ bị hư hỏng do nấm
mốc trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
Sự phát triển của bệnh sau thu hoạch trên quả phụ thuộc vào khả năng tiết
enzyme thủy phân các polymer pectic không hòa tan và các thành phần khác của nấm
mốc để dẫn đến mất liên kết mô và tế bào. Các tế bào của các mô sẽ bị tăng tính thấm
và chết, cho phép các chất chuyển hóa của quả khuếch tán ra bên ngoài, cung cấp dinh
dưỡng cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển. Như vậy khả năng gây thối của các loại
nấm mốc có thể có liên quan đến hoạt động của hệ enzyme ngoại bào.
Xuất phát từ các lý do trên tôi đã lựa chọn đề tài:“Nghiên cứu đa dạng di
truyền và đặc điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà
chua, đu đủ, thanh long sau thu hoạch” nhằm tìm ra mối tương quan giữa hoạt động
của hệ enzyme ngoại bào của nấm mốc và khả năng gây thối quả của chúng.

1


1.2. Mục đích và yêu cầu

1.2.1. Mục đích
- Phân lập được các chủng nấm mốc từ các mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh long
thối hỏng, đánh giá được khả năng gây thối quả của các chủng nấm mốc.
- Sơ bộ định danh được các chủng nấm mốc.
- Khảo sát được hoạt tính của hệ hoạt tính enzyme ngoại bào.
- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các chủng nấm gây thối quả dựa vào đặc
điểm hình thái, hóa sinh học và giải trình tự đoạn ITS trong vùng gene mã hóa cho
rRNA của nấm mốc.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập được các chủng nấm mốc từ các mẫu quả (cà chua, đu đủ, thanh long)
thối hỏng.
- Đánh giá khả năng lây nhiễm trên các loại quả (cà chua, đu đủ, thanh long) từ
những chủng nấm đã phân lập.
- Nghiên cứu đa dạng của các chủng bằng hình thái và giải trình tự ITS.
- Nghiên cứu đặc điểm hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc.
- Phân tích kết quả để tìm ra mối liên hệ giữa hoạt tính của hệ enzyme và khả
năng gây thối quả.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về nấm mốc hại quả
Thiệt hại sau thu hoạch của hoa quả có thể rất lớn, chiếm tới 25% tổng sản
lượng ở các nước công nghiệp hóa và trên 50% ở các nước đang phát triển nơi
mà các điều kiện bảo quản và xử lý sau thu hoạch không được tối ưu. Đối với
các loại quả, phần lớn những tổn thất này là do sự tấn công của một vài loại nấm
bệnh gây ra. Nguyên nhân do quả có nhiều dinh dưỡng, nước, pH thấp và hơn
nữa do sau khi thu hoạch quả mất đi hầu hết các cơ chế bảo vệ từ cây (Droby và
cs, 1992). Khác với các tác nhân gây bệnh tấn công trên đồng ruộng, hầu hết các
tác nhân gây bệnh sau thu hoạch không thể tấn công trực tiếp qua lớp cutin của
quả mà thường thông qua các tổn thương trên quả, xuất hiện trong quá trình thu
hái, vận chuyển, đóng gói và lưu trữ (Barkai, 2001). Các nấm bệnh hại sau thu
hoạch quan trọng nhất bao gồm một số loài thuộc chi Alternaria, Aspergillus,
Botrytis, Fusarium, Geotrichum, Gloeosporium, Mucor, Monilinia Penicillium,
Rhizopus và các chi khác (Barkai, 2001).
2.2 Nấm mốc trên ba loại quả
2.2.1. Nấm mốc hại quả cà chua
Cà chua (Solanum lycopersicum) là loại rau ăn quả rất được ưa thích vì
phẩm chất ngon và có nhiều cách chế biến. Cà chua được trồng trên toàn Thế
giới do có khả năng sinh trưởng trong nhiều điều kiện khác nhau. Hơn nữa trong
cà chua còn chứa nhiều chất dinh dưỡng, các chất khoáng vi lượng và các
vitamin có lợi đối với sức khỏe ( Bảng 2.1).

3


Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong 100 g cà chua
Thành phần
Nước (%)
Năng lượng (cal)
Protein (g)
Lipid (g)
Glucid (g)
Chất xơ (g)
Tro (g)
Ca (mg)
P (mg)

Số lượng
Thành phần
Số lượng
95,0
Fe (mg)
0,8
19,9
Na (mg)
4,0
1,0
K (mg)
266,0
0,2
Vitamin A (I.U.)
735,0
4,1
Vitamin B1 (mg)
0,06
0,6
Vitamin B2 (mg)
0,04
0,6
Vitamin B12 (mg)
0,60
18,0
Vitamin C (mg)
29,0
18,0
(Nguồn: Asian Vegetable Research and Development Center, 1972)

Quả cà chua bị tấn công bởi nhiều tác nhân gây bệnh, chủ yếu là do
nấm (Taskeen-un-Nisa và cs, 2011). Theo nghiên cứu của Sharma (1994) sản lượng cà
chua sau thu hoạch bị thối do nấm là 0,5-19,7% và trong đó 81,3% là do nấm Fusarium
equisetica, Fusarium pallidoroseum, Geotrichum candidum, Didymellaly copersici,
Alternaria alternata và Phytophthora nicotianae var. parasitica. Một nghiên cứu khác
của Mallek và cs (1995) chỉ ra rằng Alternaria alternata, Rhizopus stolonifer và
Aspergillus niger là những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất và gây thiệt hại lần lượt là
52,7%, 35,9% và 25% sản lượng cà chua sau thu hoạch ở Ai Cập. Ngoài ra 91,8% thiệt
hại do thối Phytophthora ( do nấm Phytophthorainfestans) và 30-70% vào bệnh thán thư
do Collectotrichum coccodes cũng được ghi nhận tại Mỹ bởi Byrne và cs (1997).
Bệnh đốm vòng (do nấm Alternaria solani và Alternaria tenuis) vết bệnh xuất
hiện đầu tiên ở cuống hoặc tai quả, hình tròn, màu nâu sẫm, hơi lõm xuống, cũng hình
thành những đường vòng đồng tâm màu đen, quả dễ rụng. Thối Alternaria đã được
xem như là bệnh phổ biến nhất trên quả cà chua và là nguyên nhân gây tổn thất nặng
nề về chất lượng của các loại trái cây (Douglas, 1922). Alternaria là nguyên nhân
chính gây ra những vết thối đen trên quả cà chua sau thu hoạch (Thomas, 1944).
Bệnh mốc sương (do nấm Phytophthora Infestans, Phytophthora nicotianae
var. parasitica) vết bệnh thường xuất hiện ở phía trên của quả từ khi còn xanh với

4


những đốm màu xanh xám, ướt, sau vết bệnh lớn dần, chuyển màu nâu sẫm, hơi lõm,
ủng và nhăn nheo có rìa phân cách rõ rệt, bên trong quả bị thối nhũn (Mills,1940).
Bệnh thán thư (do nấm Colletotricum coccodes, Colletotricum sp.) vết bệnh
tròn nhỏ, hơi ướt và lõm xuống. Trong điều kiện ẩm ướt,vết bệnh lan rộng nhanh làm
thối cả quả. Bệnh phát sinh trên đồng ruộng và làm thối quả khi bảo quản (Illman và
cs, 1959; Stevenson, 1991)
Ngoài ra, quả cà chua sau thu hoạch còn bị thối hỏng do một số chủng nấm mốc
Phoma destructiva, Fusariumspp. (Ali và cs, 2005; Iqbal và cs, 2003; Jones, 1991;
Patel và cs, 2005), thối mốc xanh do Penicillium spp. (Kwon và cs, 2008).
2.2.2. Nấm mốc hại quả đu đủ
Đu đủ (Carica papaya) là cây ăn quả ngắn ngày, sớm cho thu hoạch, đạt sản
lượng cao, chiếm ít diện tích, thích hợp với nhiều loại đất, có thể trồng xen với các cây
trồng khác. Quả đu đủ được sử dụng với nhiều mục đích như sử dụng trực tiếp, làm
rau, chế biến, làm thức ăn chăn nuôi. Quả đu đủ chín có giá trị dinh dưỡng cao, được
thị trường các nước châu Âu, châu Mỹ, Nhật Bản rất ưa chuộng. Quả đu đủ xanh chứa
khoảng 60 - 70% các chất dinh dưỡng so với quả chín. Chúng rất được coi trọng ở
vùng ít có điều kiện sản xuất rau (Trần Thế Tục và Đoàn Thế Lữ, 2002).Tuy nhiên,
việc bảo quản sau thu hoạch của đu đủ gặp nhiều khó khăn. Đu đủ thành phẩm thường
bị các loài nấm mốc tấn công làm giảm phẩm chất và giá trị dinh dưỡng.
Bênh thán thư (do loài nấm Colletotrichum gloeosporioides). Quá trình xâm
nhiễm thường xảy ra rất sớm, từ những giai đoạn đầu tiên trong quá trình phát triển
của quả, tuy nhiên chúng thường tồn tại ở trạng thái ủ bệnh cho đến khi quả chín. Nấm
có thể xâm nhập trực tiếp vào quả bằng vòi xâm nhập (Dickman và Alvarez,1983).
Khi những quả bị nhiễm nấm chín, chúng tiết ra những hạt nhựa mủ trên bề
mặt, có hình giọt nước. Khi quá trình xâm nhiễm phát triển, có một vết lõm hình tròn
có rìa màu nâu sáng. Xuất hiện các sợi bào tử và bào tử ở giữa vết tổn thương có màu
cam sáng hoặc màu hồng. Các mô ở phần thịt quả tại chỗ vết thương cứng và có màu
xám trắng sau hóa nâu. Một lớp callose tại các tế bào nhu mô cho phép vùng tổn
thương nổi lên trên bề mặt của quả (Stanghellini và Aragaki, 1966).
Bệnh thối khô gây ra bởi nấm Mycosphaerella sp. Loại nấm này không có khả
năng tiết ra các loại enzyme để xâm nhập qua lớp vỏ cutin của quả, do đó, sự xâm

5


nhiễm của chúng có liên quan đến các vết thương cơ giới. Các vết nhăn trên bề mặt
quả là những triệu chứng ban đầu và các vết thương màu nâu có mép mờ xuất hiện
tiếp sau. Một lớp mô cứng ở phía dưới vị trí xâm nhiễm, phân tách phần nhu mô màu
tối với lớp biểu bì của quả đu đủ (Hine và cs, 1965; Hunter và Buddenhagen, 1972).
Bệnh thối ướt do nấm Phomopsis sp. thường hiếm khi xuất hiện nhưng gây hại
trên diện tích lớn. Toàn bộ vết bệnh trở nên mềm và trong. Các túi bào tử có thể xuất
hiện ở giữa vết bệnh. Bệnh phát triển nhanh chóng từ bề mặt vào bên trong quả và các
mô bệnh có thể nổi lên so với các vùng khác (Hunter và Buddenhagen, 1972).
Bệnh thối Alternaria có các triệu chứng bao gồm các vết bệnh tròn hoặc hình
oval màu đen và sau đó mọc lên các sợi sinh bào tử của nấm Alternaria alternata trên
toàn bộ vết bệnh. Vết thương thường phân tách trên bề mặt của quả và không gây nên
những vết thối nghiêm trọng ở phần thịt quả. Việc bảo quản lạnh trong quá trình vận
chuyển là nguyên nhân khiến bệnh phát triển mạnh hơn và các triệu chứng thường ít
xuất hiện ở các quả không được bảo quản lạnh (Alvarez và cs, 1977).
Bệnh đốm quả với triệu chứng là các vết thương nhỏ, tròn, màu nâu sẫm là do
sự xâm nhiễm của nấm Stemphylium. Vết thương sau đó phát triển rộng và có viền
màu nâu đỏ đến tím. Lớp bào tử dày, màu xanh đậm phủ lên trên vết bệnh, xuất hiện
các sợi nấm màu trắng đến xám ở trung tâm vết bệnh, bệnh này và thường xuất hiện ở
các quả bị tổn thương do nhiệt hoặc trong quá trình bảo quản lạnh (Chau và Alvarez,
1983; Glazener và cs, 1984)
Bệnh thối Fusarium, vết bệnh nhỏ khô, phát triển trên bề mặt quả, sau đó
chuyển dần sang màu trắng do các sợi nấm đan xen chặt tạo thành. Tác nhân gây bệnh
được cho là do Fusarium solani. Bệnh thường ít gặp trên quả sau khi thu hoạch
(Hunter và Buddenhagen, 1972).
Bệnh đốm Guignardia có liên quan đến các loại nấm thuộc chi Guignardia với
triệu chứng xuất hiện các vết lõm, màu xanh đậm. Bệnh này thường được quan sát
thấy ở những quả đu đủ được xử lý trong nước nóng 42 0C trong 40 phút trong quá
trình diệt ruồi hại quả. Nhưng tỷ lệ nhiễm giảm xuống khi giảm thời gian ngâm trong
nước nóng xuống còn 30 phút (Hine và cs, 1965).

6


Bệnh do nấm Mycosphaerella sp. với triệu chứng ban đầu là các vùng trong
mờ xuất hiện quanh cuống. Trong những giai đoạn đầu tiên, khi nấm tấn công vào hệ
mạch, chỉ xuất hiện màu nâu nhạt ở trên cuống. Khi sự xâm nhiễm tăng lên, rìa của vết
bệnh ở dạng mờ, trong khi các mô bị nhiễm bệnh trở nên đen, nhăn, khô. Sợi nấm
trắng mọc ở phần núm quả (Hunter và Buddenhagen, 1972).
Nấm Botryodiplodia theobromate Có triệu chứng các mô bị nhũn ướt, có mép
rộng, bề mặt xù xì bởi các túi bào tử bị vỡ ra có dạng không bình thường. Xuất hiện
các khoang rỗng phần nhu mô ở vùng nhiễm bệnh, sau đó, sợi nấm xuất hiện dày đặc ở
các khoang này. Vết cắt dọc theo vùng nhiễm bệnh, các mô bị nhiễm bệnh có màu
xanh đen hơi trong, giống với sự xâm nhiễm do Mycosphaerella. Ngược lại, sự xâm
nhiễm do Stemphylium lycopersici có đặc tính là nhu mô màu nâu đỏ, trong và mép
giữa mô bệnh và mô lành có màu đỏ sáng đến tím (Hunter và Buddenhagen, 1972).
Bệnh do nấm Rhizopus stolonifer gây ra hiện nay đang là bệnh hại sau thu hoạch
có sự tàn phá mạnh nhất. Nấm tấn công vào vị trí tổn thương, và nhanh chóng làm thối
toàn bộ quả, để lại lớp cutin bên ngoài. Khi lớp cutin bị chọc thủng, nấm sẽ phát triển các
sợi nấm thô xám và các túi bào tử đen bao bọc quanh quả (Anne và Wayne, 1987)
2.2.3. Nấm mốc hại quả thanh long
Thanh long (Hylocereus undatus) được nhiều nước biết đến như loại trái cây
đặc trưng của Việt Nam, là loại cây nhiệt đới, chịu hạn tốt nên được trồng ở những
vùng nóng. Theo số liệu thống kê của Viện cây ăn quả Miền Nam (2009), ở Việt Nam,
thanh long được trồng ở Tây Nam Bộ với diện tích 9.800 ha và Đồng bằng sông Cửu
Long 3.991 ha). Thanh long có vị ngọt, mát nên được nhiều người tiêu dùng ưa
chuộng, được xuất khẩu qua nhiều nước trên thế giới.
Cũng như những loại quả khác, quả thanh long sau thu hoạch cũng bị một số loại
sâu, bệnh gây hại. Các bệnh được ghi nhận trên quả Thanh long như: Bệnh thán thư gây ra
do nấm Collectotrichum gloeosporioide, bệnh thối Fusarium do nấm Fusarium sp., bệnh
đốm nâu đen do Ascochyta sp., v.v. Trong đó, bệnh thán thư là bệnh nghiêm trọng nhất,
gây nhiều thiệt hại cho cây và sản lượng cả trước và sau thu hoạch.
Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra, ngoài việc làm
giảm năng suất, bệnh còn làm giảm chất lượng quả nghiêm trọng. Vết bệnh là những

7


đốm tròn hoặc gần tròn, có tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh có những vòng
đồng tâm nâu sậm, sau đó phát triển nhanh thành những mảng thối lõm vào vỏ. Bệnh
tấn công trên quả sau khi đã thu hoạch làm thối, gây thất thoát rất lớn trong quá trình
vận chuyển, bảo quản. Nấm bệnh lan truyền trong gió, nước, con người đi lại chăm
sóc. Điều kiện thời tiết mưa nhiều, ẩm độ, nhiệt độ cao thì bệnh càng dễ phát triển, lây
lan nhanh (Masanto và cs, 2009a)
Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh tắc kè tác nhân gây bệnh là nấm
Neoscytalidium dimidiatum. Lúc đầu triệu chứng trên quả là những đốm tròn nhỏ màu trắng,
vết bệnh trũng thấp so với bề mặt quả, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên
những vết ghẻ có màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng (He và cs,
2012).
Bệnh bồ hóng do nấm Capnodium sp. gây ra triệu chứng bồ hóng phát triển tạo
thành một lớp mụi đen (khói đèn) trên quả. Trong trường hợp nhiễm bệnh nặng sẽ làm
cho vỏ quả bị xù xì và làm giảm giá trị thương phẩm (Lin và cs, 2006).
Bệnh thối nhũn do nấm Rhizopus sp. gây ra. Bệnh thường xuyên xuất hiện ở
giai đoạn quả non, triệu chứng ban đầu là quả có vết bị thối nhũn, có bọt khí nổi trên bề
mặt vết bệnh, bên trên vết bệnh có xuất hiện lớp tơ nấm màu đen và lan rộng rất nhanh
chóng làm thối cả quả, có mùi hôi và có dịch nhựa màu nâu vàng chảy ra. Ngoài ra, bệnh
cũng có thể tấn công và gây thối nhũn đầu quả (Tarnowski và cs, 2010).
2.3.Đặc điểm hệ enzyme ngoại bào nấm mốc
2.3.1. Các loại enzyme chính có trong nấm mốc
Amylases là một nhóm các enzyme sản xuất bởi một số vi sinh vật bao

gồm nấm (Fadel, 2000). Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh
vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội
phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R’ + H-OH  RH + R’OH
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và
exoamylase (enzyme ngoại bào) (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004).
Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide [- CO – NH -]
giữa các loại amino acid trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptide) thành acid

8


amine và peptide đơn giản khác (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004). Nó có thể được
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật (nấm và vi
khuẩn). Protease là một nhóm enzyme phân giải protein (gồm protease, peptidase,
desaminase v.v) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào.
Theo phân loại quốc tế các loại thuộc nhóm này được chia thành 4 phân nhóm phụ:
 Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptide ở đầu nitơ của
mạch polypeptide.
 Cacboxypeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptide ở đầu cacbon
của mạch peptide.
 Dipeptihydrolase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết dipeptide.
 Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết.
Sự hoạt động của protease phụ thuộc vào các yếu tố sau: nồng độ enzyme, nồng
độ cơ chất, các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa, nhiệt độ, nồng độ muối, pH. Ngoài ra
còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu
âm, tia bức xạ v.v. Do đó nó ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng enzyme.
Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc chi
Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Pinicillium v.v. Trong đó Trichoderma và
Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất.
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-Oglucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ
gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase
hay

cellobiohydrolase

(EC

3.2.1.91)



β-glucosidase

hay

β-D-glucoside

glucohydrolase (EC 3.2.1.21).
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ
có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật. Các
chủng vi sinh vật thường sử dụng: Nấm mốc (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,

9


Aspergillus candidus v.v), xạ khuẩn (Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli v.v),
vi khuẩn (Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis v.v).
2.3.2. Mối tương quan giữa hoạt động của hệ enzyme ngoại bào
và khả năng gây thối
Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được tổng hợp bên trong tế
bào sau đó được bài tiết ra bên ngoài nhằm thủy phân các chất thành dạng dễ hấp thụ
giúp tế bào sinh trưởng và phát triển (Sinsabaugh, 1994). Khi đã hoàn thành quá trình
xâm nhập qua bề mặt quả (vỏ) và thiết lập mối quan hệ ký sinh, nấm tiến hành phân
hủy cấu trúc tế bào và các hợp chất hữu cơ khó tan thành dễ tan để hấp thụ chất dinh
dưỡng cần thiết. Để thực hiện quá trình này, nấm mốc tiết vào môi trường các enzyme
ngoại bào. Quá trình sản sinh ra enzyme pectinase, cellulase bởi nấm mốc đóng một
vai trò quan trọng trong việc phân giải pectin, cellulose làm suy yếu các tế bào để tạo
điều kiện cho nấm thâm nhập vào mô ký chủ. Protease, amylase, lypase là những
enzyme phân hủy các hợp chất tương ứng như protein, carbohydrate và chất béo cần
thiết để dinh dưỡng và phát triển (Hà Viết Cường, 2008).
Bất kỳ một loài vi sinh vật nào khi gây bệnh trên thực vật thì đều phải tiết các
enzyme ngoại bào làm phân hủy thành tế bào thực vật (Jonathan, 1994). Tác nhân gây
bệnh liên quan đến bệnh lý sau thu hoạch sản xuất một hoặc nhiều pectic enzyme endopolygalacturonase, endopectin lyase và endopectatelyase (Bateman và Basham,
1976). Mặc dù pectic enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết glycosidic trong các
polygalacturonan gây ra nhũn mô (macerate tissue) và làm chết tế bào. Các enzyme
khác cũng có thể đóng một vai trò trong sự phát triển của bệnh.
Mặc dù quá trình thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glycosidic trong các
polygalacturonan là đủ để gây ra nhũn mô và chết tế bào, cellulase và các
hemicellulase cũng có thể tham gia gây bệnh. Sự nhiễm bệnh của quả bị kích thích bởi
chính các thành phần hóa học của nó, trong khi một số chất khác lại có khả năng ức
chế tác nhân gây bệnh trên quả. Khi xâm nhiễm trên quả, nấm mốc sản sinh các độc tố
sau đó chúng tiết ra các enzyme gây phá hủy các mô của quả . Bước tiếp theo của quá
trình nhiễm bệnh phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng, tiết enzyme của nấm và sức đề
kháng của quả (Joseph và Malinie, 1983).

10


Nghiên cứu về vai trò của enzyme phân huỷ thành tế bào trong quá trình thâm
nhập đã được thực hiện bởi Wattad và cs (1994). Enzyme pectinase làm mềm và thâm
nhập vào của mô của quả bị ức chế bởi epicatechin, một hợp chất phenolic có trong vỏ
của quả chưa chín. Trong quá trình chín, hàm lượng epicatechin giảm đến một ngưỡng
không ức chế với các pectic enzym và nấm gây thối quả.

11


PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm mốc được phân lập từ các mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh long
đã bị thối hỏng.
3.1.2. Hóa chất và môi trường
3.1.2.1. Hóa chất
Hoá chất dùng trong đề tài từ nhiều nguồn khác nhau được thống kê trong bảng
3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Hoá chất sử dụng
Hoá chất

Hãng sản xuất

Agarose

Biozyme

Agar
Tinh bột
Cellulose

Long Hải
Sigma
Sigma

Nước sản xuất
Mỹ
Việt Nam
Mỹ
Mỹ

Chloroform

Merck

Đức

Gelatin
Glycerol
Axit Sorbic
Sodium Bisulphite

Sigma
Sigma
NIPPON GOHSEI
AR

Mỹ
Mỹ
Nhật Bản
Trung Quốc

3.1.2.2. Môi trường
Môi trường nuôi cấy và khảo sát dùng trong đề tài bao gồm:
- Môi trường PDA (Potato dextrose agar):
Khoai tây:

200

g

Glucose:

20

g

Thạch:

20

g

(Khoai tây bỏ vỏ, thêm nước cất, nấu nhừ, lọc lấy 1 lít nước, pH 7,0 ± 0,2)
- Môi trường Czapek- Dox lỏng:
NaNO3:

2

g

12


K2HPO4:

1

g

MgSO4 . H2O:

0,5

g

KCl:

0,5

g

FeSO4:

0,01

g

Glucose:

30

g

Thạch:

15

g

Nước cất dâng đến: 1 lít, pH 7,3 ± 0,2
- Môi trường xốp: gạo lứt nấu chín, hấp vô trùng ở 120ºC, 1.5atm trong 20 phút.
3.1.3. Máy móc thiết bị
Các máy móc thiết bị dùng trong đề tài thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ
Vi sinh- Khoa Công nghệ Sinh học - trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài
Tên thiết bị
Bể điện di TV50
Bể ổn nhiệt JSWB - 22T
Cân kĩ thuật PB 602 – S
Cân phân tích AB204 – S
Kính hiển vi LEICA DM750
Lò vi sóng EM – G4777S
Máy cất nước WSC/4D
Máy đo pH bàn Meter S20
Máy khuấy từ gia nhiệt ARE
Máy li tâm lạnh thu sinh khối lớn

Hãng
SCIE- PLAS
JSR
METTLER TOLEDO
METTLER TOLEDO
LEICA
SANYO
HAMILTON
METTLER TOLEDO
VELP
EPPENDORF

Centrifure 5810R
Máy li tâm lạnh Universal 320R
Máy rửa siêu âm S 60 H
Máy sản xuất đá lạnh FIM 95A
Máy ủ ấm eppendorf 1.5
Máy vortex ZX3
Nồi hấp HVE – 50
Tủ ấm JSBI – 150C
Tủ ấm nuôi cấy Memmert 100 - 800

HETTICH
ELMA
EVERMED
EPPENDORF
VELP
HYRAYAMA
JSR
MEMMERT

13

Nước sản xuất
Anh
Hàn Quốc
Thuỵ Sỹ
Thuỵ Sỹ
Trung Quốc
Nhật Bản
Anh
Thuỵ Sỹ
Italy
Đức
Đức
Đức
Italy
Đức
Italy
Nhật Bản
Hàn Quốc
Đức


Tủ cấy vô trùng JSCB – 1500SB
Tủ lạnh GN-185SS
Tủ lạnh sâu -20ºC DFUD 3744AE
Tủ lạnh sâu -80ºC ULF 240 W PR02
Tủ sấy dụng cụ JSOF – 100

JSR
LG
OPERON
EVERMED
JSR

Hàn Quốc
Việt Nam
Hàn Quốc
Italy
Hàn Quốc

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập và lây nhiễm nhân tạo
3.2.1.1. Phân lập các chủng nấm mốc
Lấy 1g mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh long bị thối hỏng cho vào 99 ml nước cất
vô trùng, lắc ở 150vòng/ phút trong 30 phút, để lắng, đem pha loãng lên các nồng độ
10-5 và 10-6. Lấy50 µl dịch đã pha loãng cấy trải trên lên đĩa petri chứa môi trường
PDA đặc (nguyên tắc Koch).
Các đĩa petri đã cấy nấm được nuôi ở nhiệt độ 28ºC – 30ºC trong 3 – 4 ngày.
Các khuẩn lạc đã mọc được cấy chuyển và làm thuần bằng phương pháp cấy chấm
điểm sang môi trường PDA mới.
3.2.1.2. Giữ giống
Nấm mốc được giữ giống trong thạch nghiêng bằng cách cấy zích zắc trên môi
trường PDA trong ống nghiệm thủy tinh, được nuôi ở nhiệt độ 30°C cho đến khi mọc
đẹp trước khi được bảo quản ở tủ 4°C. Các mẫu giữ giống được cấy chuyển hàng
tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
Nấm mốc được giữ giống ở - 80°C trong glycerol 40%. Hệ sợi, bào tử nấm mốc
cùng với một ít môi trường nuôi cấy được gảy vào 1 ml glycerol 40% trong ống
eppendorf, lắc đều nhẹ và bảo quản trong tủ lạnh -80°C.

14


3.2.1.3. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Các chủng nấm mốc đã phân lập và giữ giống được tiến hành lây nhiễm để thử
khả năng gây bệnh trên các quả cà chua, đu đủ và thanh long bình thường, không bị
bệnh. Quả đu đủ (xanh, ương, chín), quả cà chua (ương, chín), quả thanh long (chín)
được rửa bằng NaClO trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô. Cắt đu
đủ thành các miếng mỏng đặt vào đĩa petri. Đặt cả quả cà chua vào cốc đựng đã vô
trùng, dùng dao vô trùng rạch tạo vết thương trên vỏ quả (do cà chua có lớp vỏ pectin
tương đối dày). Quả thanh long được đặt vào hộp đã vô trùng, dùng dao vô trùng rạch
tạo vết thương trên vỏ quả ở ba vị trí khác nhau chia theo dọc quả. Dùng que cấy gạt
bào tử nấm, chấm lên trên vỏ quả đu đủ trên đĩa và vết thương đã tạo trên quả cà chua,
thanh long. Bọc kín cốc lại, để vào tủ ổn nhiệt 25 0C và quan sát trong vòng 10 ngày
(Anna và cs, 2002).
3.2.2. Định danh sơ bộ bằng quan sát đặc tính hình thái của các
chủng nấm mốc
Quan sát đặc điểm hệ khuẩn ty nấm mốc
Nấm mốc, sau khi cấy chuyển sang thạch nghiêng, được tiến hành tạo khuẩn lạc
như sau: bào tử nấm từ ống giống được trộn trong 1ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo
dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng
chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa petri, tiến hành cấy trên 3 đĩa. Lưu ý không để
điểm chấm loang trên mặt thạch. Nấm được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 0C trong 5
ngày. Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc: kích thước, màu sắc, hình dạng khuẩn
lạc, đặc điểm dạng sợi nấm mọc ở trên mặt khuẩn lạc.
Quan sát vi thể nấm mốc
Làm tiêu bản tạm thời để quan sát được đặc điểm của sợi khí sinh, cuống đính
bào tử và bào tử (màu sắc, hình dạng). Tiến hành lau cồn cho lam kính và lamen trước
khi làm tiêu bản. Cho 1 giọt nước hoặc glycerol 50% hoặc xanh methylen (pha thành 3
dung dịch riêng biệt: dung dịch 1: 0,9 g Na2HPO4 trong 500ml nước cất, dung dịch 2:
13,6 g KH2PO4 trong 500 ml nước cất, dung dịch 3: 0,1 g methylen xanh hòa vào 500
ml nước cất. Hỗn hợp có: 0,25 ml dung dịch 1 + 99,75 ml dung dịch 2 + 100 ml dung
dịch 3 (Lương Đức Phẩm, 2004) vào giữa lam kính, lấy 1 lượng nhỏ nấm mốc hòa vào

15


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×