Tải bản đầy đủ

Thưc hành kỹ thuật di truyền

Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Môn học:
Họ & tên SV:
Lớp:

MSSV:

Nhóm:

Tổ:

Thời gian thí nghiệm:
Bảng điểm
Bài
TH
1

Phần chuẩn bị bài

Điểm
Phần báo cáo Phần câu hỏi


Ghi chú
Tổng cộng

2
3
4
5
Điểm kiểm tra
Tổng điểm

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 1 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền

Thực tập Kỹ thuật di truyền
1. Giới thiệu tổng quan về các kỹ thuật thao tác thí nghiệm sinh học phân tử và kỹ thuật
di truyền:
Giới thiệu nội quy phòng thí nghiệm
Giới thiệu mục đích, nội dung thí nghiệm và các hình thức kiểm tra .
Giới thiệu sử dụng dụng cụ, thiết bị và pha hóa chất trong phòng thí nghiệm kỹ
thuật di truyền
2. Ứng dụng PCR trong kỹ thuật RFLP
3. Ứng dụng PCR trong kỹ thuật RAPD

Kế hoạch làm việc trong 6 tuần (30 tiết) học
Tuần
1

Ngày
11-18/09

Bài
1

Nội dung
Kỹ thuật RFLP


Thời gian
200 p

2

19-25/09

1

Kỹ thuật RFLP

200 p

3
4

26/09-02/10
03/09/10

1
1

Kỹ thuật RFLP
Kỹ thuật RFLP

200 p

5
6

10-16/10
17-23/10

2
2

Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Kỹ thuật
Khuyếch đại vùng
TrnL-TrnF
Kiểm tra mẫu
khuyếch đại
Tinh sạch mẫu
Kỹ thuật RFLP
Kiểm tra kết quả
và xử lý mẫu
RFLP

Điểm
60%

Kỹ thuật RAPD
Kiểm tra kết quả
RAPD

40%

Page 2 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền

Bài 1: Giới thiệu tổng quan về các kỹ thuật thao tác thí nghiệm sinh học

phân tử và kỹ thuật di truyền

1.

Pipette man (Micropipette)

Kiểm tra tình trạng hoạt động của pipette man trước khi sử dụng.
Chỉnh về thể tích cần sử dụng. Thao tác vặn nút nên nhẹ nhàng, tránh vặn quá nhanh, vặn đi
vặn lại nhiều lần hoặc vặn vượt quá thể tích cho phép của pipette man.
Không được trút ngược đầu pipette.
Chọn các đầu típ thích hợp cho từng loại pipette.
Cỡ nhỏ:
Cỡ trung bình:
Cỡ lớn:

1 - 10 µl
10 - 100 µl
100 - 1000 µl.

Khi hút: ấn nhẹ nút vặn xuống nấc thứ hai, cho đầu típ vào dung dịch và nhả từ từ để hút
đúng lượng thể tích cần dùng. Khi nhả dung dịch: ấn nút vặn xuống nấc thứ ba.

A

B

C

Hình 1.1: Pipette man (A &B), Đầu típ C)
(T-144: đầu típ nhỏ, T-155: đầu típ trung bình, T-166: đầu típ lớn)

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 3 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
2. Ống eppendorf
Là ống bằng nhựa polyethylene hoặc polypropylene, có thể tích từ
0.2 – 2 ml, chịu được nhiệt độ thấp – 20oC và các dung môi hữu cơ
như chloroform. Các eppendorf phải được khử trùng ở đều kiện
thông thường (1atm, 120oC, 20 phút) trước khi sử dụng.
Đánh số hoặc ghi tên lên nền nhám của ống.
Sau khi cho dung dịch vào ống, kiểm tra và đậy kín. Lau chùi sạch
những vết hóa chất dính bên ngoài ống.
3. Máy ly tâm

Hình 1.2: eppendorf

Máy ly tâm phải luôn được vệ sinh sạch sẽ và giữ trong điều kiện
khô ráo.
Khi ly tâm phải cân bằng các ống ly tâm và đặt theo kiểu đối
xứng nhau từng cặp một.
Thể tích dịch ly tâm thường chiếm ¾ thể tích của ống ly tâm.
Không ly tâm dung dịch quá mức cho phép.
Chỉnh tốc độ quay, thời gian và nhiệt độ ly tâm thích hợp.
Vặn nắp thật chặt trước khi ly tâm. Máy được khởi động trong
tình trạng êm nhẹ, nếu máy rung mạnh có thể là do thể tích trong
ống không đều, cần dừng lại ngay và điều chỉnh lại thể tích trong
các ống.

Hình 1.3: Máy ly tâm

Vệ sinh máy lý tâm sau khi sử dụng. Lau sạch ngay khi phát hiện có hoá chất và dung dịch
vương vãi lên máy.
4. Một số nguyên tắc pha hóa chất
Nguyên tắc chung
Hóa chất được pha chế trong tủ hút.
Sử dụng găng tay, khẩu trang khi pha chế các dung dịch chất độc tiềm năng như acrylamide
(độc dược thần kinh), ethidibromua (chất gây ung thư) hoặc các chất gây bỏng nặng như
phenol, acid, base đậm đặc.
Pha loãng dung dịch từ dung dịch mẹ.
Với hầu hết hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử phải được pha với nước khử ion được
chưng cất (nếu có) và phải được hấp khử trùng trước khi sử dụng (đối với hóa chất không bay
hơi)

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 4 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Các bước pha chế dung dịch
Chuẩn bị lọ đựng sạch, dán nhãn rõ ràng.
Cân hóa chất đúng theo lượng cần dùng. Chovào cốc thuỷ tinh với một ít nước cất 2 lần và
thanh khuấy từ. Đợi đến khi chất rắn tan hoàn toàn hoặc các pha trộn lẫn đều vào nhau thành
một pha duy nhất.
Bổ sung nước cất cho đến thể tích xác định cuối cùng.
Chỉnh pH về điểm cần thiết (nếu có)
Khử trùng dung dịch (nếu có)
Kiểm tra độ trong, tạp chất và độ nhiễm lần cuối trước khi cho vào lọ vô trùng để bảo quản
hay sử dụng. Các dung dịch đệm và dung dịch chế phẩm sinh học cần được bảo quản trong
điều kiện lạnh và thời gian ngắn.
5. Bảo quản chế phẩm sinh học
Các chế phẩm DNA hoặc RNA phải được bảo quản trong chế độ rất nghiêm ngặt.
Dung dịch ethanol có thể gây hỏng ADN nếu có mặt ion kim loại nặng.
Da người có Nuclease nên không tiếp xúc trực tiếp với mẫu bằng da trần. Các Rnase thường
rất bền ngay cả khi đã được rữa sạch và khử trùng chúng vẫn còn bám lại trên bề mặt của các
chai lọ.
5oC là nhiệt độ cần thiết để bảo quản các sinh phẩm.
- 20oC có thể làm gẩy các DNA.
- 70 oC là nhiệt độ dùng để bảo quản lâu dài các chế phẩm với điều kiện trong môi trường có
nồng độ muối hơn 1M, có mặt của EDTA (hơn 10mM) ở pH = 8,5: hoặc bảo quản trong dịch
nổi CsCl với EtBr trong tối ở 5 oC.

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 5 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Bài 2: Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
1. Tổng quan lý thuyết:
RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn. RFLP biểu hiện
sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới
hạn.
RFLP là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên
độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA .
RFLP cổ điển được thưc hiện bằng đoạn DNA quan tâm cần phải chọn lọc bằng cách , chạy
điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu
phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Tiếp theo đoạn DNA quan tâm được cắt bằng các
enzyme cắt giới hạn và khảo sát độ dài bằng điện di. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ
tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. Kỹ thuật này thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với
sức khoẻ người nghiên cứu, DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ
thuật này.
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi
oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được
khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc
bạc. RFLP-PCR bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp
RFLP cổ điển.
NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) là công cụ để phân nhóm
dữ liệu. Trong sinh học, NTSYS được áp dụng như một phần mềm thống kê sự giống và khác
nhau về mặt di truyền của các cá thể hay quần thể. Dựa vào việc so sánh và phân tích dữ liệu,
NTSYS sẽ sắp xếp thành một khối số liệu có tình tương quan lẫn nhau. Khối số liệu này có
thể biễu diễn dưới dạng biểu đồ hình cây (cây tiến hóa).
2. Mục đích: Sử dụng enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) khảo sát sự đa hình chiều dài
đoạn DNA, đồng thời xây dựng bản đồ cắt giới hạn
3.Vật liệu thiết bị
Vật liệu:
DNA toàn phần
RE: Pst I, EcoRV, Hind III
RE Buffer
Vật liệu chạy PCR: mồi, dNTP, Tag polymerase, buffer, MgCl2,

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 6 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Vật liệu chạy điện di: agarose, ethidium bromide, thang DNA 100bp, loading dye,
TAE 1X
Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR: Chloroform: isoamyl,Ethanol: 100%, NaOAc 3M

Thiết bị: PCR, bộ chạy điện di, Dolphin Doc
4 Thực hành
Bước 1: Khuếch đại vùng TrnL-trn F
Cho vào 2 eppendorf 0.2ml các thành phần rồi tiến hành chạy chương trình PCR như
bảng sau. Sau đó xem kết quả chạy PCR bằng điện di.
Bảng 1. Thành phần và chương trình chạy một phản ứng PCR
Thành phần trong eppendorf 0,2 ml

Chương trình chạy PCR

Thành phần

Mẫu

Đối chứng
âm

Nhiệt
độ
(oC)

Thời
gian

Chu
trình

DNA mẫu

60 ng

0 L

1st denaturation

94

1 phút

1

Mồi

5pM

5Pm

DNA denaturation

94

45 giây

35

DNTPs

125L

125L

Primer annealing

55

45 giây

35

MgCl2

2.5mM

2.5mM

Primer extension

72

3 phút

35

Tag polymerase

0.25L

0.25L

Last extension

72

10 phút

1

Mineral oil

25L

25L

Nước cất tiệt
trùng

0 L

60ng

Tổng cộng

25 L

25 L

Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR
Hút 50µL sản phẩm PCR với 50µL phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) vào
eppendorf 1.5ml, trộn đều, ly tâm lạnh 13000rpm trong vòng 2phút.Thu dịch nổi, bỏ cặn
Cho tiếp 5µL NaOAc 3M và 150µL ethanol 99.7% ủ ở 20oC trong 15phút. Ly tâm thu
tủa.
Kiểm tra sản phẩm tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di.
Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 7 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Bước 3: Phản ứng cắt
Chuẩn bị một eppendorf, lần lược cho các thành phần phản ứng vào: 34 L nước khử ion tiệt
trùng, 5L buffer (10X), 0.5L (100X)BSA, 10L DNA ( 1g/L) Trộn đều hỗn hợp bằng
cách hút nhả.
Cho 0.5L enzyme cắt giới hạn (10U/L) spin. (với đối chứng âm: không cho RE). Ủ ở 37oC
trong 2 giờ
Bước 4: Xem –xử lý kết quả
-Xem kết quả bằng kỹ thuật điện di
- Xử lý kết quả bằng chươngtrình NTSYS
Thiết lặp bảng kết quả bằng Excel (bảng 2)
Hàng 1: thiết lập các thông số của bảng số liệu. Trong đó hàng 1 cột 1 là số 1 (ma trận hình
chữ nhật), 2 (ma trận vuông có số liệu không đối xứng) hoặc 3 (ma trận vuông có số liệu đối
xứng). Hàng 1 cột 2: ghi số hàng , hàng 1 cột 4 ghi số cột (chỉ tính hàng và cột số liệu, không
tính hàng và cột ký hiệu). Hàng 1 cột 4 sẽ là 0 nếu không có số liệu thiếu hay là 1 nếu có số
liệu thiếu.
Hàng 2: đánh ký hiệu mẫu. Cột 1 ( bắt đầu từ hàng 3) ghi ký hiệu mồi.
Quy định về số liệu: ở dạng nhị phân, có xuất hiện vạch sẽ là 1 còn không xuất hiện vạch sẽ
là 0.
Bảng 2: Bảng số liệu
1
OPA1-1
OPA1-2
OPA1-3
OPN1-1
OPN1-2

5
T1
0
1
0
1
0

6
T2
1
1
1
0
0

0
T3
0
0
1
1
1

T4
1
0
1
0
1

T5
1
1
0
0
1

T6
0
1
1
0
0

Tạo bảng thể hiện hệ số tương quan giữa các mẫu: Bật chương trình NTSYS, click chuột vào
“similarity”, tiếp tục click vào “Qualitative data”. Double click vào “input file” để chọn file
số liệu trong excel, đặt tên cho “output file”. Các thông số khác không thay đổi. Click chuột
vào “compute”. Như vậy ta có 1 file mới “*.NTS” thể hiện bảng hệ dố tương đồng giữa các
mẫu
Xây dựng cây: Chọn “clustering”, tiếp tục chọn” SAHN”, nhập input là file “*.NTS” vừa tạo
phía trên. Đặt tên cho Out put và nhấn “compute”.

- Dùng PCR và mồi đăc hiệu khuếch đại một target gene (Chloroplast DNA)
Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 8 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
- Tinh sạch sản phẩm PCR
- Sử dụng enzyme cắt giới hạn:
Dung dịch mẫu gồm: 34 L nước khử, 5L buffer (10X), 0.5L (100X)BSA, 10L
DNA ( 1g/L) trong eppendorf (đã được tiệt trùng). Trộn đều
Cho 0.5L enzyme cắt giới hạn (10U/L) spin. (với đối chứng âm: không cho RE)
Ủ ở 37oC trong 2 giờ
- Xem kết quả bằng điện di
5. Yêu cầu cho phần viết báo cáo.
-Nêu ý nghĩa/mục đích của bài thực hành
-Trinh bày quy trình thí nghiệm
Kết quả
1. Kết quả điện di (hình ảnh): Khuếch đại và RFLP
2. Bảng thể hiện tỉ lệ tương đồng (SM coefficient)
3. Sơ đồ cây quan hệ chủng loài
4. Sơ đồ enzyme cắt giới hạn
Nhận xét kết quả: nhận xét kết quả khuếch đại, từ sơ đồ hình cây có nhận xét gì về mối tương
quan của các mẫu.

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 9 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Bài 3: Kỹ thuật Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
1. Tổng quan lý thuyết:
RAPD: Đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên. Kỹ thuật này được phát hiện bởi
William và Welsh năm 1990-1991.
RAPD là kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR nhằm khuyếch đại các đoạn DNA bằng mồi ngẫu
nhiên. Mồi ngẫu nhiên là những đoạn oligonucleotide có chiều dài 5-12nu. Mồi càng ngắn
khả năng bắt cặp càng cao trong khi đó mồi càng dài khả năng bắt cặp càng chính xác. Trong
kỹ thuật này, cặp mồi không được sử dụng như PCR thông thường mà thay vào đó là bộ mồi
đơn (nhiều hơn 5mồi). Tuy nhiên các thành phần khác như DNA polymerase chịu nhiệt,
dNTP, đệm và các điều kiện nhiệt được thiết lập như PCR thông thường. Chính các mồi ngẫu
nhiên này giúp khuếch đại được các đoạn DNA khác nhau tồn tại trong DNA tổng số. So
sánh các đoạn DNA đa hình giữa các cá thể dưới sự hổ trợ của các phần mềm tin học sẽ giúp
vẽ được sơ đồ cây, thể hiện mối tương quan di truyền giữa chúng.
Như vậy kỹ thuật RAPD gồm các 3 bước cơ bản: bước 1, tách chiết rồi thu nhân DNA tổng
số; bước 2, chạy PCR bằng bộ mồi ngẫu nhiên; bước 3 chạy điện di và phân tích kết quả
2. Mục đích: Sử dụng mồi ngẫu nhiên và PCR để xác định tính đa dạng và nguồn gốc di
truyền
3. Vật liệu thiết bị
Vật liệu: mồi ngẫu nhiên (Primer): OPA04. OPA1, OPA17, OPA19, OPA20, OPN 04, OPN
11, OPN 13, OPN 19, OPN 20
Hóa chất chạy PCR: dNTPs, Tag polymerase, Đệm/MgCl2. Nước cất 2 lần tiệt trùng
Hóa chất chạy điện di: agarose, loading dye, TAE 1X, ethidium bromide, thang 100bp
Thiết bị: máy PCR, bộ thiết bị chạy điện di, Dolphin Doc
4. Thực hành:
1. Chạy PCR với mồi ngẫu nhiên:
Chuẩn bị 2 eppendorf 0.2ml, eppendorf 1 làm mẫu đối chứng âm (chỉ cần một ống đối chứng
âm cho một lần chạy PCR), eppendorf 2 chứa mẫu. Thêm vào 2 eppendorf những thành phần
như bảng 1. Cho 2 eppendorf vào buồng chạy PCR, đóng nắp và thiết lập chương trình chạy
PCR như bảng 1.
Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 10 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
Sau khi chạy PCR, kết quả được thể hiện bằng kỹ thuật điện di
Bảng 1: Thành phần và chương trình chạy PCR cho mồi ngẫu nhiên trong RAPD
Thành phần trong eppedorg 0.2ml
Thành phần

Mẫu

Chương trình PCR

Đối chứng Giai đoạn

T (oC)

âm

Thời

Chu

gian

kỳ

DNA mẫu

60 ng

0 ng

Biến tính ban đầu

94

4 mins

1

Mồi

2.5L

2.5L

Biến tính

94

45 sec

45

dNTPs

2.5L

2.5L

Bắt cặp

37

1min

45

MgCl2

2.5mM

2.5mM

Kéo dài

72

2mins

45

Tag polymerase

0.25L

0.25L

Kéo dài cuối

72

7 mins

1

Đệm

25L

25L

Trữ

4

H2O tiệt trùng

Thêm đủ 25L

Tổng thể tích

25 L

1

25 L

b. Xử lý kết quả bằng NTSYS
5. Yêu cầu cho phần viết báo cáo.
Nêu ý nghĩa/mục đích của bài thực hành
Trình bày quy trình thí nghiệm
Kết quả
5. Kết quả điện di (hình ảnh)
6. Bảng thể hiện tỉ lệ tương đồng (SM coefficient)
7. Sơ đồ hình cây
Nhận xét kết quả: từ sơ đồ hình cây có nhận xét gì về mối tương quan của các mẫu

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 11 of 12


Thực hành Kỹ thuật Di truyền
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
Das, M, Bhattacharya, S Singh, P, Filgueiras, T, Pal, A 2008, ‘Bamboo Taxonomy and
Diversity in the Era of Molecular Markers’, Elsevier Ltd, vol. 47, pp. 225-268.
Das, P, Rout, G, Nayak, S , 2003 ‘Evaluation of the genetic variability in bamboo using
RAPD markers’, Plant Soil Environ, vol 49, pp.24–28.
Gollan, P & Phillip, R 2010, Applications of Bioinformatics, Swinburne university of
technology
Karcher, S 1995 Molecular biology: a project approach , Acadamic Press, California
Nicholl, D 2008, An introduction to genetic engineering,Cambridge, 3rd edn, New York
Nguyễn, N.T 2009, Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể thông đỏ tại Lâm
Đồng bằng kỹ thuật sinh học phân tử, Luẫn văn thạc sĩ.

Ths Trần Hồng Bảo Quyên

Page 12 of 12



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×