Tải bản đầy đủ

POLYMERASE CHAIN REACTION

POLYMERASE CHAIN REACTION
Những khái niệm chính:
♦ PCR là khuếch đại những trình tự DNA cụ thể in vitro.
♦ PCR cần có 2 mồi (primer), một trong hai mồi đó sẽ bổ sung cho mỗi mạch
DNA và một DNA polymerase.
♦ Những chu kì nóng và lạnh được lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ làm khuếch đại
đoạn DNA ở giữa hai vị trí liên kết của mồi thành một số lượng lớn DNA tái
bản.
Kĩ thuật PCR khởi đầu vào giữa thập niên 1980 (Saiki et al., 1985; Mullis and
Faloona, 1987), không phải là không hợp lí khi nói rằng các tác động của PCR lên
sinh học phân tử, khoa học pháp lí, chuẩn đoán các bệnh lí về gen ở người đã trở nên
rộng mở hơn. Tự bản thân của quá trình này là một sự kéo dài cực kì đơn giản của chu
trình sao chép DNA, nhưng nó sử dụng nhiều cách khác nhau để tạo nên nhiều sự
nhân bản và thao tác trên DNA trong nhiều trường hợp thì dễ dàng và thích hợp hơn
trong lần đầu tiên. Khái niệm đơn giản nhất thì PCR là sự sao chép lặp lại nhiều lần
của một đoạn trên chuỗi DNA kép. Tiến trình này được trình bày sơ lược trong hình
4.1. Sự ưu việt của PCR là do nó có khả năng nhân bản một số lượng lớn các bản sao
từ một phân đoạn DNA cụ thể trong một thời gian ngắn. PCR cũng có thể khuếch đại
nhanh chóng một vùng nào đó trên phân tử DNA mạch đơn trong ống nghiệm để sinh
ra một lượng đủ có thể được nhân bản, nối dài, hoặc phân tích bằng cách xác định giới
hạn. Tác dụng của PCR đã được tôn vinh vào năm 1993 với giải thưởng Nobel hóa

học cho Kary Mullis cho sự đóng góp của ông với khoa học. Mullis đã viết về các
phát minh thú vị của mình (Mullis, 1990) và có thể tìm thấy cuốn tự truyện thú vị của
Mullis

trên

web

site

giải

Nobel

(http://www.nobel.se/chemistry/

laureates/1993/mullis-autobio.html). PCR liên quan đến hai mồi là hai chuỗi
oligonucleotide, thường có chiều dài khoảng 17 đến 30 nucletide, cái mà nhận diện
trình tự DNA mục tiêu để sao chép. Một trong hai mồi có trình tự giống với một mạch
DNA (sense - mồi xuôi) trong khi mồi còn lại thì có trình tự giống như chuỗi DNA
1


còn lại (antisense - mồi ngược). Mồi xuôi sẽ liên kết, bổ sung bắt cặp với các base,
với mồi ngược và bắt đầu tổng hợp mạch DNA mới. Tương tự, mồi ngược cũng liên
kết với mồi xuôi và tổng hợp mạch DNA mới của mồi xuôi mới. Chương trình PCR
được chia làm ba giai đoạn riêng biệt, mỗi giai đoạn thực hiện ở nhiệt độ khác nhau
(hình 4.1). Chu kì quá trình biến tính – bắt cặp với mồi (hay còn gọi là lai) – kéo dài
được lặp lại 20-30 lần để đạt được mức độ khuếch đại mong muốn của một trình tự
DNA cụ thể. Ba bước trong mỗi chu kì như sau:
♦ Biến tính: hai mạch của phân tử DNA được tách ra bằng nhiệt độ. Như
chúng ta đã biết trong chương 1, DNA có thể bị biến tính thuận nghịch bởi chu kì
nóng và lạnh. Bước này thường được thực hiện ở nhiệt độ là 94oC.
♦ Bắt cặp với mồi (lai): hai mạch mục tiêu sau đó được làm lạnh với sự có
mặt của các đoạn mồi oligonucleotide. Một mồi sẽ nhận diện và gắn vào mạch DNA
mục tiêu và một mồi khác cũng sẽ nhận diện và gắn vào mạch còn lại. Các mồi được
thiết kế sao cho đầu 3’ của mỗi đoạn mồi phải đối mã với cái còn lại, vì vậy sự tổng
hợp DNA diễn ra trên cả hai mạch trong vùng giữa hai mồi. Nhiệt độ để bắt cặp của
mỗi mồi với DNA mẫu thì phụ thuộc vào chiều dài và trình tự của mồi, và mức độ đặc
trưng của các phản ứng PCR cụ thể thì có trong chương 2. Nhiệt độ thông thường

được chọn trong phạm vi 45-60oC.
♦ Kéo dài: một DNA polymerase sẽ gắn vào đầu 3’ của mỗi liên kết
oligonucleotide và sử dụng dNTP để tổng hợp mạch DNA mới theo chiều 5’-3’. Các
thí nghiệm PCR đầu tiên sử dụng các phân đoạn Klenow DNA polymerase I như là
enzym sao chép, nhưng do bước biến tính nhiệt, các enzym được thêm vào trong suốt
mỗi chu kì. Một sự đột phá khi đưa ra Tag DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt
Thermus aquaticus (Lawyeret al., 1989). Tag DNA polymerase kháng với nhiệt độ
cao, nó có chịu được nhiệt độ 94 oC của giai đoạn biến tính và vẫn còn khả năng hoạt
động tốt. Điều này có nghĩa là enzym không cần phải được bổ sung trong suốt phản
ứng và các chu kì nóng - lạnh cần thiết trong PCR có thể được thiết kế tự động. Hơn
nữa Tag DNA polymerase có nhiệt độ tối ưu cho sự sao chép DNA là 72 oC. Ở nhiệt độ

2


cao mà lúc đó các phản ứng kéo dài vẫn có thể diễn ra thì có nghĩa là giai đoạn bắt
cặp mồi không bị sai sót.

Biến tính

Bắt cặp mồi (lai)

Kéo dài bằng DNA polymerase

Lặp lại

3


Sau mỗi vòng của quá trình nhân bản PCR, một phiên bản mới của mỗi mạch
DNA được tổng hợp, như minh họa trong hình 4.1. Vị trí bắt đầu của sự tổng hợp
DNA được quyết định bởi liên kết của đoạn mồi oligonucleotide với DNA mẫu. Cụ
thể trong quá trình lai thông qua liên kết hydro giữa cặp base, chính xác từng vị trí
mỗi nucleotide cho tới các trình tự, cái mà được bổ sung vào mạch mẫu. Không có gì
quá phức tạp, tuy nhiên sự tồng hợp DNA kết thúc như thế nào. Nếu chúng ta kiểm tra
kết quả của một phản ứng PCR điển hình trên gel agarose như trong hình 4.2, ta sẽ
thấy những dải đơn rời rạc được tạo thành. Điều này cho thấy những phân đoạn DNA
được tạo thành đồng nhất, và chúng bắt đầu và kết thúc ở cùng vị trí. Để hiểu điều này
xảy ra như thế nào, ta hãy xem các đoạn DNA được tạo thành trong suốt nhiều chu kì
của PCR.

Hình 2: Khuếch đại PCR của một gen từ DNA. Hai đoạn mồi oligonucleotide
được thiết kế để flank gen trong bộ gen người. Một phản ứng PCR diễn ra 25 chu kì,

4


một phần mười phản ứng được chạy trên gel agarose sắp xếp theo kích thước DNA.
Gel được nhuộm với ethium bromide và được chụp dưới kính hiển vi.

Hình 4.3: Các sản phẩm tạo thành trong suốt 3 chu kì đầu của một thí nghiệm
PCR. Một phân tử DNA mục tiêu (được mô tả bằng màu đỏ và xanh) chứa các trình tự
bổ sung với hai oligonucleotide. Các oligonucleotide có tác dụng như là điểm bắt đầu
cho sự nhân bản DNA. Các sản phẩm của mỗi chu kì PCR đều là mẫu cho sự nhân
bản DNA của chu kì tiếp theo. Trong hình là sản phẩm của chu kì đầu PCR (xanh lá),
chu kì hai (tím), chu kì ba (nâu). Sự hoàn thành chu kì dẫn đến hình thành hai phân tử
DNA mạch đôi (được đóng khung), cái mà đầu của mạch 5’ và 3’ thích hợp chính xác
với đầu của đoạn mồi oligonucleotide. Các chu kì tiếp theo dẫn đến sự gia tăng theo
cấp số nhân của phân tử DNA này.

5


Trong suốt chu kì PCR đầu tiên, hai mạch DNA mục tiêu được tách ra và quá
trình nhân bản DNA bắt đầu tại điểm liên kết với mồi. Hai mạch DNA mới được tổng
hợp ở cuối chu kì 1 (ở hình 4.3), sẽ có đầu 5’ xác định, như là được quy định bởi vị trí
liên kết với mồi, nhưng đầu 3’ không xác định. Quá trình tổng hợp DNA không giới
hạn ở một điểm cụ thể, nhưng nó sẽ chỉ dừng lại trong suốt bước biến tính nhiệt của
chu kì 2. Mỗi mạch DNA có ở cuối chu kì 1 sẽ tiếp nối vào chu kì kế tiếp của PCR, và
mỗi mạch sẽ có tác dụng như là mẫu cho sự liên kết với các mồi mới. Trong chu kì 2,
mồi sẽ gắn với mạch DNA mẫu ban đầu và các mạch được tổng hợp trong chu kì 1.
Liên kết giữa mồi với mạch mẫu ban đầu sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các sản
phẩm tương tự trong suốt chu kì 1.
Tuy nhiên, liên kết giữa mồi với mạch DNA được tổng hợp trong chu 1, tiếp
theo đó là sự nhân bản, dẫn đến việc tạo thành một mạch DNA với đầu ở đầu 3’ và 3’
đều xác định. Điều này xảy ra bởi vì sự nhân bản DNA sẽ chấm dứt khi không có
thêm trình tự DNA nào nữa được sao chép. Vì thế khi kết thúc chu kì 2 thì 2 mạch
DNA được tạo thành (thể hiện trên hình với màu tím) có đầu 5’ và 3’ xác định. Tuy
nhiên các base bắt cặp với các đoạn DNA có đầu 3’ không xác định. Một lần nữa, sản
phẩm trong chu kì 2 của tiến trình PCR sẽ đi vào chu kì 3, lần nữa mỗi mạch DNA
được sử dụng làm mẫu để mồi gắn vào. Vào cuối chu kì 3, phân tử DNA mạch đôi
được tạo thành và cuối mạch 5’ và 3’ bắt đầu và kết thúc tại những vị trí mồi gắn vào
trình tự DNA mục tiêu ban đầu.
Ngoài chu kì 3 của PCR, các chu kì biến tình nhiệt, bắt cặp mồi, kéo dài được
lặp lại sẽ dẫn đến sự nhân lên theo cấp số mũ của một đoạn DNA mục tiêu cụ thể
(hình 4.1). Sau 25 chu kì, thông thường của các thí nghiệm PCR, mong đợi sẽ khuếch
đại khoảng 30 triệu lần, và sự khuếch đại vẫn đạt được như vậy trong thực tế. Tất cả
các phản ứng PCR “bị nhiễm” bởi một lượng ít các phân đoạn DNA được tạo thành
không đúng với chủ định nhưng không đáng kể, bởi vì phần lớn là sự khuếch đại của
các phân đoạn DNA cụ thể.
Có nhiều yếu tố cần được xem xét khi khuếch đại một trình tự DNA cụ thể
bằng phương pháp PCR. Nó bao gồm việc chọn lựa DNA polymerse được sử dụng,
6


mẫu DNA, điều kiện phản ứng và trình tự mồi oligonucleotide. Chúng tôi sẽ thảo luận
ngắn gọn về mỗi vấn đề ở phía dưới như là các thí nghiệm về kĩ thuật gen có thể bị
ảnh hưởng như thế nào, nhưng cái độc giả hướng tới là các văn bản với những khía
cạnh thực tế của PCR theo chiều sâu hơn.
4.1 ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR
 Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm các thành phần:
 DNA (0.01–0.1 μg)
 Primer 1 (20 pmol)
 Primer 2 (20 pmol)
 Tris-HCl (20 mM, pH 8.0)
 MgCl2 (2 mM)
 KCl (25 mM) or KCl (10 mM) and (NH4)2SO4 (10 mM)
 Deoxynucleotide triphosphates (50 μMeach of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
 Thermostable DNA polymerase (2 units)
 A total reaction volume of 50–100 μL.
Chúng tôi sẽ nói về enzyme polymerase, DNA mục tiêu và mồi rõ hơn ở phần
dưới. Một số thành phần phản ứng (Tris, KCl and MgCl2), nồng độ của các ion magiê
trong phản ứng đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của một phản ứng PCR
(Hình 4.4). Mg là chất cần thiết cho DNA polymerase hoạt động, nhưng các đặc điểm
của bất kỳ phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ của Mg được sử dụng. Nồng độ Mg
thấp , phản ứng không xảy ra vì enzyme polymerase không hoạt động. Nồng độ Mg
cao, phản ứng sẽ mất đi đặc trưng và sản xuất nhiều sản phẩm không mong muốn.
Nồng độ tối ưu Mg cần phải được xác định bằng thực nghiệm cho mỗi bộ mồi PCR
riêng biệt, nhưng thường sẽ có trong khoảng từ 1-5 mM. Các thành phần đệm và muối
của phản ứng (Tris và KCl) thường được sử dụng thường xuyên, mặc dù làm giảm
nồng độ KCl kích thích DNA polymerase ở lại trên mẫu lâu hơn và đạt được một
chiều dài lớn hơn của sản phẩm khuếch đại (Foord và Rose, 1994).
7


Hình 4.4 : Ảnh hưởng của nồng độ Mg về hiệu quả và đặc trưng của một thí
nghiệm PCR. Một thí nghiệm PCR đã được thiết lập có chứa nồng độ MgCl 2 khác
nhau. Sau khi PCR, các sản phẩm đã được tách trên gel agarose và nhuộm với
ethidium bromide. Các kích thước của sản phẩm PCR thu được được so sánh với một
thang DNA mẫu (M). Tái sản xuất các yếu tố quan trọng cho thành công của PCR ,
của Qiagen GmbH.
Một khi các phản ứng PCR đã được thiết lập, nó thường được phủ một lớp dầu
để ngăn chặn sự bốc hơi của mẫu trong quá trình làm nóng - cách khác, một máy PCR
với một nắp sẽ ngăn chặn sự bốc hơi nước nóng - trước khi được chịu các nhiệt độ
khác nhau mà sẽ thúc đẩy sự biến tính, nhiệt luyện, và các thành phần mở rộng của
một chu kỳ PCR. Điều kiện một chu kỳ cho một thí nghiệm PCR có thể được
 94 ◦C, 30 s – giai đoạn biến tính
 60 ◦C, 30 s – giai đoạn lai
8


 72 ◦C, 1 min – giai đoạn kéo dài
Giai đoạn biến tính và lai ngắn, nhưng đủ để cho phép phá vỡ và gắn các liên
kết hydro giữa các sợi DNA. Bắt đầu bao gồm một bước biến tính ban đầu (94 0 C, 2
phút) để đảm bảo rằng các mẫu DNA ban đầu là chuỗi đơn. Điều này thường không
xảy ra khi tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao sẽ chặn lại trong DNA mẫu. Chiều dài của sản
phẩm PCR khuếch đại trong thời gian cho phép cho bước kéo dài của phản ứng. Hầu
hết các polymerase sử dụng trong PCR sẽ tái tạo DNA trong ống nghiệm với tỷ lệ
khoảng 500-1000 bp min-1 (Bảng 4.2). Thời gian mà các thí nghiệm PCR được ủ ở
nhiệt độ giãn được điều chỉnh tùy thuộc vào chiều dài của sản phẩm ban đầu.

Số chu trình PCR được thực hiện trong một thử nghiệm cá nhân phụ thuộc vào
số lượng cả hai mẫu DNA ban đầu trong phản ứng và lượng DNA cần thiết sau quá
trình khuếch đại. Nói chung, để tránh các lỗi sao chép (xem bên dưới), như vài chu kỳ
có thể sẽ được thực hiện. Điều này thường sẽ có trong khoảng 17-25 chu kỳ. Sau khi

9


hoàn thành các chu kỳ , phản ứng chuẩn PCR bao gồm một bước kéo dài cuối cùng
(72 0 C trong 5 phút) để đảm bảo rằng tất cả các DNA trong phản ứng này đã được
nhân lên thành dạng mạch đôi. Giai đoạn kéo dài cuối cùng có thể làm tăng hiệu quả
nhân bản của sản phẩm PCR (Li và Guy, 1996).
4.2. DNA POLYMERASE CHỊU NHIỆT:
Các vi khuẩn Thermus aquaticus lần đầu tiên được phát hiện tại một số suối
nước nóng ở Công viên quốc gia Yellowstone (Brock and Freeze, 1969). Từ đó nó
được tìm thấy sống trong môi trường nhiệt trên khắp thế giới. Sinh vật này sống ở
nhiệt độ từ khoảng 50 và 80

0

C, và nhiệt độ tối ưu tốc độ tăng trưởng của nó là

khoảng 70 0C. Taq ADN polymerase là enzym monomeric với trọng lượng phân tử 94
kDa được phân lập từ các sinh vật (Chien,Edgar và Trela, 1976; Luật sư và cộng sự,
1989).. Các enzyme chịu nhiệt, nó lặp DNA tại 74 0C và vẫn còn chức năng ngay cả
sau khi ủ ở 95 0 C. enzyme này bao gồm một hoạt động polymerase 5’ tới 3’ một hoạt
động exonuclease 5’tới 3’, nhưng nó thiếu một 3’tới 5’ exonuclease (proofreading)
hoạt động. Việc thiếu proofreading hoạt động có nghĩa là nếu một cơ sở không chính
xác được đưa vào chuỗi polynucleotide mở rộng, nó không thể được loại bỏ và do đó
Taq ADN polymerase là dễ bị lỗi và gây những đột biến cho các sản phẩm PCR
khuếch đại. Trong thử nghiệm in vitro, Taq ADN polymerase misincorporates một
base 104-105 những base lặp lại (Barnes năm 1992; Cline, Braman và Hogrefe,
1996). Các sự khác biệt lớn trong tỷ lệ lỗi ước tính là do, một phần, với những
phương pháp được sử dụng gây những đột biến. Theo ước tính mức độ thấp nhất, với
tỷ lệ lỗi của 10 -4 lỗi cho mỗi cặp base tái sử dụng, nếu một chuỗi 1 kb là khuếch đại
cho 25 chu kỳ với Taq sau đó khoảng 10 phần trăm của các sản phẩm khuếch đại sẽ
có đột biến. Tuy nhiên, vì những đột biến xảy ra trong một chu kỳ sẽ được khuếch đại
trong chu kỳ sau đó, thực tế tần số đột biến có thể khác nhau từ các thí nghiệm thử
nghiệm. Mức độ báo lỗi là không, tuy nhiên, ảnh hưởng đến ảnh hưởng đến kết quả
của một thí nghiệm.Nếu phản ứng PCR đang được thực hiện chỉ đơn thuần là để xác
định sự có mặt hay vắng mặt của một gen trong một phân tử DNA mục tiêu, sau đó sự
10


thành công của phản ứng này sẽ không bị ảnh hưởng bởi sự xuất hiện của lỗi vào
trong trình tự khuếch đại. Tuy nhiên nếu là để khuếch đại gen để nghiên cứu chức
năng, sau đó PCR sai sót có thể ảnh hưởng đến thử nghiệm. Các vấn đề về báo lỗi có
nghĩa là, tuy nhiên, sản phẩm PCR có thể bị phân tích trình tự DNA trước khi chúng
được sử dụng trong các thí nghiệm nhân bản. Ngoài ra, một số dòng vô tính PCR độc
lập nên được lựa chọn để đảm bảo rằng các trình tự thu là điển hình.
Một chức năng khác của Taq ADN polymerase tác động đến trình tự của sản
phẩm PCR cuối cùng là xu hướng của các enzyme để kết hợp một deoxynucleotide
(thường là một adenosine) một cách độc lập mẫu kết thúc ở đầu 3 ’của sợi DNA mới
tổng hợp. Một hệ quả của hoạt động này là sản phẩm PCR được sản xuất bởi Taq
không thể kết thúc, nhưng đã có đầu 3 ’ đơn A nhô ra dư lượng. Đặc tính này đã được
khai thác để hỗ trợ nhân bản của sản phẩm PCR (xem bên dưới). Kể từ khi tìm ra Taq
polymerase DNA, một số ADN polymerase chịu nhiệt khác đã được mô tả và đã được
sử dụng trong các thí nghiệm PCR. Trong khi Taq vẫn là thông dụng nhất của các
enzym chịu nhiệt cho PCR, polymerase từ các nguồn khác có tính chất khác nhau mà
làm cho chúng hữu ích cho các ứng dụng nhất định (Bảng 4.2).
Một số các DNA polymerase chịu nhiệt khác, ví dụ Pfu polymerase cô lập với
furiosis vật Pyrococcus, không có một hoạt động 3 ’tới 5’ exonuclease proofreading, và
như vậy tốc độ đột biến giảm. Sử dụng ví dụ trên, nếu là 1 kb phân đoạn của DNA
được khuếch đại hơn 25 chu kỳ với Pfu polymerase, sau đó chỉ có 0,1 phần trăm của
các sản phẩm khuếch đại sẽ có đột biến. Ngoài ra, một số các DNA polymerase chịu
nhiệt khác sản xuất sản phẩm PCR thấp (Bảng 4.2). Các hoạt động 5 ’ tới 3’
exonuclease của Taq polymerase DNA có nghĩa là enzyme có khả năng làm suy giảm
mồi oligonucleotide trong phản ứng PCR. Điều này đặc biệt có liên quan trong bước
biến tính đầu tiên của chu kỳ 1, khi các oligonucleotides không bị ràng buộc với các
mẫu DNA, và trùng hợp tự do trong dung dịch. Trong chu kỳ nóng nhất, nhiệt độ của
hỗn hợp PCR tăng từ nhiệt độ phòng (hoặc 4 0 C nếu phản ứng đã được thiết lập ở
nhiệt độ) tới 94 0 C. Điều này có nghĩa rằng, tại một số điểm, nhiệt độ trong ống sẽ
được 72 0 C - tối ưu cho polymerase - nhưng các enzyme sẽ không thể sao chép DNA
11


vì tái sử dụng trong số các oligonucleotides với mẫu DNA. Nhiệt độ vượt qua nhiệt
độ của enzyme mà sự sao chép không xảy ra sẽ có xu hướng dẫn đến suy thoái mồi,
và PCR không hiệu quả. Để khắc phục vấn đề này, và để ngăn chặn các sản phẩm
PCR không đặc trưng được tổng hợp trước chu kỳ, Taq polymerase DNA có thể được
thêm vào hỗn hợp phản ứng đã ở 94 0 C. Khi tăng nhiệt độ tăng cả sản lượng và đặc
trưng của phản ứng PCR. Ngoài ra, Taq polymerase DNA có thể được trộn với một
kháng thể cụ thể mà liên kết với enzyme và ức chế hoạt động của nó (Kellogg và cộng
sự, 1994.). Các kháng thể - ức chế enzyme phức tạp sao chép ở nhiệt độ thấp, nhưng
phức tạp không thể phục hồi phân ly ở nhiệt độ cao, sau đó enzyme là không ngăn cản
các chức năng của nó.
Sự tồn tại của một số ADN polymerase chịu nhiệt với những đặc tính khác
nhau đã dẫn đến sự "pha trộn" của polymerase cho các chức năng cụ thể. Ví dụ, Taq
ADN polymerase sản xuất sản lượng cao của sản phẩm PCR, nhưng dễ gây lỗi và có
kích thước sản phẩm PCR tối đa khoảng 5-7 kbp. Pfu DNA polymerase, mặt khác, là
ít hơn nhiều dễ gây lỗi, nhưng vẫn còn gặp khó khăn hiệu quả sản xuất sản phẩm PCR
trên 7 kbp. Một hỗn hợp của hai polymerase (15 phần Taq và 1 phần Pfu ) đã được tìm
thấy các mảnh DNA có hiệu quả khuếch đại lên đến 35 kbp dài với độ trung thực cao
(Barnes, 1994).
4.3. DNA KHUÔN MẪU
Hầu như mẫu DNA nào cũng có thể được sử dụng như một khuôn cho một
phản ứng PCR, bao gồm dạng thẳng, plasmit DNA dạng tròn và đóng xoắn, genome
DNA, cDNA… DNA có nguồn gốc từ những chất phi vật thể, do vậy PCR đơn thuần
là một chuỗi những phản ứng tiếp diễn. Với yêu cầu duy nhất là vị trí liên kết mồi tạo
thành chuỗi giữa chúng là nguyên vẹn.
Trong các trường hợp, nhìn về tương lai cho những lợi ích rõ ràng, chúng ta
cân nhắc kĩ cho việc khuyết đại DNA mục tiêu đơn. Khi điều này chắc chắn đạt được
trong thực tiễn và thường được tiến hành với quy mô số lượng DNA lớn. Khi với một
lượng nhỏ DNA được sử dụng nhưng khi bị nhiễm tạp chất trong phản ứng PCR có
12


thể trở nên một vấn đề nghiêm trọng. Khuếch đại đặc tính PCR trên quy mô lớn mà bị
nhiễm tạp chất vào DNA có thể gây hỏng thí nghiệm. Nhiễm tạp chất có thể do nhiều
nguyên nhân khác nhau bao gồm người đang tiến hành thí nghiệm,những mồi xuôi và
mồi ngược sử dụng để thiết lập phản ứng và enzyme hoặc các chất cần thiết trong
chính phản ứng. Trong một thí nghiệm PCR điển hình giữa 0,1 và 1 μg DNA sẽ được
thêm vào phản ứng với một lượng tương đối thấp số chu kỳ PCR nhưng vẫn có thể
được thực hiện được với nguyên liệu đầy đủ cho các thí nghiệm . Điều này làm giảm
khả năng gây tạp nhiễm vào sự khuếch đại mong muốn. Với bao nhiêu bản sao của
chuỗi mục tiêu đủ lượng DNA cần thiết? Nếu bạn thêm 1 μg DNA bộ gen của người
để cho một phản ứng PCR, điều này tương đương với 1×10 -6/ (6,4×109×650) = 2,4 ×
10-19 mol, khi đó DNA của người có khoảng 6,4×109 bp của DNA và khối lượng trung
bình của bp là 650 Da. Thành ra 1 μg DNA của người tương ứng 2,4 ×10 19

mol×6×1023(Avogadro’s number)=khoảng 144.000 phân tử.Điều này có nghĩa là với

1 gen đơn trong 1 μg sẽ tạo ra 288.000 DNA đôi. Tám triệu lần khuếch đại của một
1000 bp trong genomic DNA, trải qua 25 chu kì PCR, khoảng 10 μg của 1000bp của
đoạn DNA. Với một phần nhỏ sản phẩm của PCR đủ để phát hiện bằng ethidium
bromide trên điện di agarose.
4.4 MỒI OLIGONUCLEOTIDE
Sự thành công trong một thí nghiệm PCR là gần như hoàn toàn phụ thuộc khi
mồi oligonucleotide. Các đoạn mồi cần phải được thiết kế để nhận ra đoạn DNA mà
chúng cần được nhân lên. Mồi có những đặc điểm sau đây.
+ Độ dài mồi khoảng 17-30 nucleotid
+ Số lượng G và C vào khoảng 50%
+ Cách tính nhiệt độ của các cặp mồi được tính theo công thức 2(A+T) +
4(G+C)- sử dụng làm thí nghiệm xấp sỉ bằng nhau.
+Các mồi riêng lẻ không nên bắt cặp bổ sung với nhau. Ví dụ, một mồi có trình
tự như sau 5’-GAGATCGATGCATCGATCTC-3’ có thể là một lựa chọn tốt cho mồi
PCR (dài 20 nucleotid, 50% GC, không có sự bắt cặp giữa các trình tự), nhưng nó sẽ
13


tạo thành cấu trúc kẹp nếu đầu 5’ kết thúc liên kết với 3’ kết thúc có thể gây khó khăn
trong việc bắt cặp của mồi trong phản ứng PCR nên không khuếch đại được.

Hình 4.5. Các vị trí của mồi để khuếch đại một phần của gen GAL4 từ
Saccharomyces cerevisiae .
(a) Các trình tự DNA, và acid amin tương ứng trình tự, một phần của gen
GAL4 . Các chuỗi ADN mã hóa đầu tiên 100 axit amin của protein Gal4p được thể
hiện với màu nâu. Các vị trí của mồi để khuếch đại trình tự này được hiển thị. Lưu ý
rằng mồi 1 là cùng trình tự như là mạch xuôi (sense strand) và sẽ do đó liên kết với
các mạch ngược (antisense strand) và DNA polymerase sẽ tổng hợp ra một sợi mới.
Tương tự như vậy, mồi 2 là trình tự giống như mạch antisense, để nó nhận ra các
mạch sense và sẽ dẫn đến sự hình thành của một mạch antisense mới.

14


(b) Các kết quả của thí nghiệm PCR được thực hiện với mồi của chính nó,
hoặc là sự kết hợp của cả hai mồi. Các sản phẩm PCR sẽ được nhìn thấy sau khi
ethidium bromide phát huỳnh quang trên gel agarose.
Không nên có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi hoặc trong đầu 3’ của một mồi.
Ví dụ, hai mồi sau đây lần nữa xuất hiện là một sự lựa chọn tốt:
5’-GATCGATCGATACGTGATCC-3’ và
5’-CGTAGCTAGCTAGGATCACG-3’.
Tuy nhiên, đầu 3’ của những đoạn mồi được bổ sung cho nhau và có thể xảy ra
việc tự bắt cặp mồi, điều này có thể sẽ được nhân lên trong các chu kỳ đầu tiên của
phản ứng PCR:

Hầu hết mồi phù hợp với các tiêu chí trên có thể được sử dụng trong thí
nghiệm PCR, nhưng một số gói phần mềm miễn phí sẵn có, bao gồm cả một số trong
đó được dựa trên web, đã được viết để hỗ trợ việc thiết kế mồi (Rozen và Skaletsky,
1998).
4.4.1 Tổng hợp mồi Oligonucleotide
Hầu hết các oligonucleotides được thực hiện trên việc tổng hợp acid nucleic
bằng cách sử dụng phương pháp

phosphoramidite hóa học. Phosphoramidite

oligonucleotide được tổng hợp hóa học đã được giới thiệu gần 20 năm trước
(McBride và Caruthers, 1983). Các khối được sử dụng để tổng hợp được DNA
phosphoramidite nucleoside (đôi khi được gọi là monome). Đây là những sửa đổi để
ngăn chặn sự bắt cặp hoặc phản ứng phụ không mong muốn khác xảy ra trong quá
trình tổng hợp. Chúng sửa đổi đầu 5’ (với một nhóm dimethoxytrityl) và đầu 3’ (với
15


một β- cyanoethyl bảo vệ nhóm 3’-phosphite), và cũng có thể bao gồm thêm sửa đổi
để bảo vệ các amin trong phản ứng chính có các cấu trúc vòng nucleoside.
Phosphoramidite dẫn đến việc tổng hợp oligonucleotide diễn ra trong bốn bước
như hình 4.6. Tự tổng hợp được thực hiện trên các chất hỗ trợ, thường dùng
polystyrene. Polystyrene được nạp vào một cột nhỏ như các buồng phản ứng. Một cột
nạp được gắn vào đường dây phân phối thuốc thử trên một tác nhân tổng hợp DNA và
hóa chất phản ứng tiến hành dưới sự kiểm soát máy tính. Căn cứ được thêm vào chuỗi
ngày càng tăng theo một chiều 3’-5’ (ngược với sự tổng hợp enzyme của polymerase
DNA). Tổng hợp là bắt đầu sử dụng polystyrene, đã tác động với base đầu tiên thông
một liên kết este tại 3’-hydroxyl (Hình 4.6 (a)).
Sự tổng hợp primer bắt đầu bằng sự phân cắt của nhóm 5’-trityl (hình 4.6 (b))
bằng cách sử lí với axit. Monomer kích hoạt bởi tetrazole được nối với 5’-hydroxyl
(hình 4.6 (c)) và kết quả là liên kết phosphite bị ôxi hóa thành phosphate bằng cách xử
lý với i-ốt (hình 4.6 (d)). Điều đó hoàn tất một 'chu kỳ' của tổng hợp oligonucleotide.

:
Hình 4.6. Sự tổng hợp của mồi oligonucleotide. Việc tạo thành 5’-AT-3’.
Phophoramidite nucleoside được biến đổi với một nhóm bảo vệ dimethoxytrityl ở đầu
16


5’ (đỏ) và một cyanoethyl β-bảo vệ nhóm 3’-phosphite (màu xanh). Ngoài ra, một tác
nhân biến đổi khác (màu xanh) bảo vệ cho các amin của mồi diễn ra ở bất cứ mọi nơi
trong phân tử. Xem các đoạn văn để biết chi tiết về chu kỳ phản ứng
Phản ứng ngưng tụ nucleoside có hiệu quả cao, với ít hơn 1 phần trăm của
những nhóm 5’-hydroxyl không phản ứng với các nucleoside mới gắn vào. Để ngăn
chặn các phân tử chưa phản ứng này tham gia trong các phản ứng tiếp theo dẫn đến
việc xóa cắt không mong muốn, các nhóm chưa phản ứng 5’-OH bị khóa bằng cách
acetyl hóa các acetic anhydride trước khi diễn ra bước oxy hóa. Hiệu quả của việc bắt
cặp đảm bảo rằng mồi lên đến chiều dài khoảng 60 nucleotide chiều có thể được tạo
thành một cách dễ dàng.
Sau khi tổng hợp xong, oligonucleotide được cắt từ sự hỗ trợ của hydroxit
amoni ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục trong amoniac ở nhiệt độ cao sẽ tác động đến các
nhóm phosphat thông qua xoá gốc β của nhóm cyanoethyl và cũng loại bỏ các nhóm
bảo vệ từ các vị trí dị vòng. Các oligonucleotide hoàn thành có thể được tinh sạch từ
các hóa chất bị nhiễm do sai sót, và chuỗi trình tự đầy đủ thường bị phân lập bằng
cách lọc qua HPLC.
Các lợi thế lớn cho tổng hợp hóa học mồi là bất kỳ trình tự nào cũng có thể
được sản xuất nhanh chóng và tương đối rẻ (<0,5 % cho mỗi base). Các trình tự của
mồi cũng có thể được trộn lẫn. Ví dụ, với các mồi được nêu trong HÌNH 4.6 nếu một
hỗn hợp 01:01 của DT và DC monome đã được thêm vào để phản ứng ở giai đoạn C,
sau đó sơn lót kết quả có thể có trình tự của một 5’-TA-3’ hoặc 5’-CA-3’. Các sản
phẩm cuối cùng sẽ là một hỗn hợp bằng nhau của hai loài. Bởi kiểm soát số lượng của
mỗi monomer thêm ở bước ngưng tụ, các mồi có thể được pha tạp với bất kỳ nồng độ
quy định tại vị trí bất kỳ trừ 3’-kết thúc. Ngoài ra, thay đổi cơ sở (ví dụ như những
phosphothioates chứa, hoặc có nhãn với biotin) có thể được thêm vào trình tự mồi.
4.5 MỒI BẤT XỨNG (không khớp)
Các đoạn mồi oligonucleotide dùng trong thí nghiệm PCR không cần phải phù
hợp một cách chính xác với trình tự mục tiêu. Đặc biệt là khi tạo sự thay đổi, gây đột
17


biến chuỗi DNA khuyếch đại hay để tìm kiếm trình tự gen tương đồng với một trình
tự gen đã biết. Chúng tôi sẽ đưa ra một số ứng dụng đơn giản của đột biến dựa trên
PCR nhưng phương thức tối ưu gây đột biến sẽ được biết ở chương 7. Nơi duy nhất
trong đoạn mồi phù hợp với trình tự mục tiêu là đầu 3’. Nếu đầu 3’ của đoạn mồi
không phù hợp với trình tự mục tiêu thì khi đó các polymerase sẽ không thể kéo dài
mồi. Kết quả là quá trình PCRse4 thất bại, không đạt hiệu quả. Điều này sẽ gặp trong
chẩn đoán đột biến điểm ở gen (xem bên dưới). Người ta nghĩ đến việc dùng PCR
trong đột biến để khuyếch đại sản phẩm từ những đoạn mồi. Các mồi bắt đầu quá
trình sao chép DNA nhưng chúng sẽ hợp nhất vào sản phẩm cuối cùng. Do đó, bất kì
sự thay đổi giữa mồi và DNA mẫu đều sẽ được chuyển vào sản phẩm khuyếch đại. Vì
thế không thể thấy những đột biến xảy ra ở đầu 3’ của mồi. Nơi tốt nhất cho ta thấy
những thay đổi, đột biến đó là đầu 5' của mồi. Ở trường hợp này, chúng tôi cũng
khuyếch đại cùng trình tự như trong hình 4.5. Tuy nhiên lần này các mồi
oligonucleotide chứa các trình tự bổ sung tại điểm 5 kết thúc. Mồi 1 trong trường hợp
này chứa trình tự nhận biết enzyme giới hạn EcoRi ở điểm 5 kết thúc của chuỗi, và
được sử dụng để nhận biết những gen GAL4. Mồi 1 và mồi trong hình 4.5 sẽ liên kết
giống nhau với chuỗi DNA mẫu. trình tự nhận biết EcoRi không tương xứng với trình
tự mẫu, không đủ để ngăn chặn khả năng lien kết của mồi. Trình tự nhận biết EcoRi
sẽ được sát nhập vào sản phẩm cuối cùng của PCR như trong hình 4.7. Mồi 2 trong
trường hợp này chứa trình tự nhận biết enzyme giới hạn BamHi, ezym này cũng sẽ
được sát nhập vào sản phẩm cuối cùng. Việc nhân bản sản phẩm cuối trở nên đơn giản
khi được cắt bởi 2 enzym giới hạn, tuy nhiên không chắc là bản than sản phẩm PCR
sẽ không có EcoRi hay BamHi. Thong thường đòi hỏi các enzyme giới hạn cắt đúng
chỗ nhằm tách một cách hiệu quả. Vì vậy 3-6 dư lượng bổ sung sẽ được thêm vào
điểm 5 kết thúc của mồi trước khi nhận biết enzym . Đây thường là G hoặc C(kẹp
GC) để hiệu quả cắt là tối ưu. Bất kì sự không tương thích nào giữa mồi và DNA mẫu
đều sẽ được chuyển tiếp vào sản phẩm PCR cuối cùng. Vì vậy, sự đột biến có được
dựa trên các sản phẩm PCR cuối cùng bằng cách thay đổi trình tự của mồi. Đặc biệt
muốn thay đổi trình tự gen mã hóa từ đó thay đổi trình tự acid amin của protein hay
18


muốn thay đổi việc sử dụng codon của một gen. VD: enzyme giới hạn được nhận biết
nhưng vẫn không thay đổi trình tự acid amin của protein kết quả hoặc sử dụng codon
nếu protein kết quả được thể hiện ở mức độ cao. Hai mồi không trùng khớp với nhau
được sử dụng trong việc tìm kiếm các gen mã hóa cho một protein đặc biệt và tìm
kiếm gen tương đồng. Đặc tính biệt lập của protein phổ biến trong sinh hóa. VD: bạn
có thể cô lập một protein và kết thúc một trình tự amino để tìm kiếm các acid amin
Met-Ile-TRP-Phe. Mã di truyền thoái hóa khi trình tự acid amin này có thể được mã
hóa cho các chuỗi DNA sau. Với trình tự protein ở chỉ tay, nó không thể biết codon
nào sẽ được sử dụng trong một gen đặc biệt để mã hóa một acid amin đơn lẻ. Do vậy
để khuyếch đạitrình tự gen mã hóa protein, chúng ta phải thiết kế sự thoái hóa mồi.
Các mồi chỉ có thể liên kết với các tổ hợp mà có thể mã hóa cho các trình tự
protein.Mồi dưới đây có thể được tổng hợp theo tính chất này.

Hình 4.7: Mồi để khuếch đại một phần của gen GAL4 từ genome của
Saccharomyces cerevisiae và để bao gồm các enzyme nhận diện các vị trí đặc trưng.
Các sản phẩm PCR cuối cùng chứa các trình tự có trong các mồi.
Trong đó N là một hỗn hợp đẳng mol của A T C G. Các mồi trên sẽ được sản
xuất như là một hỗn hợp của 24 cặp mồi khác nhau. Chỉ một trong 24 cặp mồi này sẽ
mã hóa chính xác trình tự protein, những cặp mồi còn lại sẽ khác nhau bởi một
nucleotide duy nhất từ trình tự mục tiêu và vẫn phát huy hiệu quả PCR. Trường hợp ở
đây cho thấy, quá trình PCR đòi hỏi một mồi bổ sung phải nhận biết đến 3 trình tự.
Bốn nucleotide sẽ thay nhau sử dụng inosine tại một vị trí trên mồi. Inosine là một
19


purine,có trong tRNA có khả năng bắt cặp với C, T, A. Cặp đôi inosine-A sẽ không
trùng khớp với DNA kép như là cặp purine-purine. Do đó, sẽ có một lượng năng
lượng bị mất mát khi xoắn những chỗ phình ra trong lúc kết nối. Khi được yêu cầu,
inosine có thể được sử dụng trên mồi tại vị trí bất kì trong 4 base trên. Mỗi inosine
được dung sẽ làm giảm sự thoái hóa mồi xuống 4 lần. Sự không tương thích giữa
inosine-G có thể xảy ra nhưng sẽ được khắc phục tại những vị trí khác trên mồi sao
cho sự bắt cặp là chính xác. Sử dụng inosine trong mồi đòi hỏi các DNA polymerase
dung trong thí nghiệm PCR phải có khả năng tổng hợp DNA trong một mẫu có chứa
inosine. Taq polymerase có thể làm được điều này, nhưng một số polymerase khác
không thể làm được như Vent và Pfu (Knittel và Picard, 1993). Trong cùng một loài
nhiều gen có trình tự acid amin giống nhau (do đó trình tự gen cũng tương tự) mã hóa
chức năng giống nhau trên những protein khác nhau. PCR có thể được sử dụng để
xác định các thành viên trong cùng 1 loài them 1 lần với 1 số đặc trưng. Để minh họa
điều này, quan sát 1 vài ví dụ đơn giản nhất. VD: K.POU- vùng chứa protein, là 1
loạt những nhân tố phiên mã tham gia bảo tồn vùng DNA ( figure 4.8a). miền này có
nguồn gốc bởi 4 miền đặc trưng là 3 protein động vật có vú Pit-1, Oct-1, Oct-2 và
gen-86 UNC từ giun tròn. Hai vùng có độ bảo tồn cao của miền là Pou và Pou
homeodomain. Sau này có homeobox chứa protein kiểm soát sự phát triển ở ruồi
giấm. Sự thay đổi trong những gen này sẽ tác động dến sự phát triển của sinh vật.
chẳng hạn những thay đổi trong gen Pit-1 (chuột)dẫn đến thất bại trong sự phát triển
của tuyến yên và sự sản xuất những con chuột người lùn(lietal..,1990). Để xác định
Othermembers của miền Pou mồi phải được thiết kế cho hầu hết các vùng bảo tồn cụ
thể là Pou và homeobox Pou (hình 4.8b). Những đoạn mồi thoái hóa rất cao dựa trên
sự thoái hóa của mã di truyền, nhưng được sử dụng thành công để xác định các miền
Pou được bổ sung từ nhiều nguồn khác nhau(Lillycrop et al,1992). Hai mồi được hiển
thị ở hình 4.8c đã đươc tìm thấy để khuyếch đại 1 đoạn DNA khoảng 400bp. Tính
không đồng nhất là do sự khác biệt trong chiều dài của các gen mã hóa vùng Pou
được khuyếch đại từ các mẫu DNA. Vấn đề này đã dẫn đến việc xác định nhiều gen
mới bao gồm Brn-3 có trong các tế bào thần kinh, được đánh giá cao cho thấy sự khác
20


biệt và quyết định sống còn của các tế bào thần kinh cảm giác và vận động ( Erkman
et al,1996).
4.6. PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH DO GEN QUY ĐỊNH:
Khả năng của PCR để khuyếch đoạn DNA cụ thể là một công cụ hữu ích trong
việc chuẩn đoán bệnh về sự thiếu sót hay đột biến của gen. PCR đòi hỏi phải biết kiến
thức cơ bản về chuổi DNA mà đoạn này sẽ được khuyếch đại, vùng đột biến sẽ được
biết khi phân tích PCR có thể dẫn đến thất bại. Thuận lợi của phương pháp PCR là chỉ
cần một lượng nhỏ DNA được dùng để chuẩn đoán. Mẫu của máu hoăc tế bào từ bên
trong mô cung cấp đủ khoán chất để làm chuẩn đoán, trong khi mẫu nhỏ của màng
long tơ có thể sử dụng để làm một chuẩn đoán trong utero.
PCR được sử dụng để tìm ra cả đột biến chèn và đột biến điểm. 1 phạm vi rộng
của công nghệ có thể được phát triển để tìm ra đột biến=PCR. Chúng tôi sẽ tập trung
vào 1 cặp mẫu, nhưng người đọc sẽ nhận thấy rằng tồn tại nhiều thay đổi.
Đột biến chèn hay bỏ: hội chứng Wardenburg một bệnh thừa hưởng nhiễm sắc
thể trổi mà bệnh có đặc điểm biểu hiện bởi 1 sự kết hớp của bệnh điếc và màu da
không bình thường. Bệnh này có thể chiếm hơn 2% trường hợp của người điếc trưởng
thành, và thường hay lien kết với bệnh đớm trắng của tóc ở trước tráng và long mi
trắng. Chắc chắn những dạng của hội chứng Waardenburg được gây ra bởi đột biến
trong gen PAX-3 liên quan một yếu tố dịch mã trong sự phát triển của bệnh nhân bị
phôi. Một trong những điểm đầu tiên được tìm thấy trong gen PAX-3 từ những hội
chứng Waardenburg la mất 18 base trong DNA mã hóa.
DNA trội trong yếu tố phiên mã, đột biến mất thể tìm ra trong những bệnh
nhân bị bệnh Waardenburg bằng PCR. Mới có thể được thiết kế bên cạnh vùng đột
biến (hình 4.9). khuếch đại của chuỗi . Sẽ hình thành một đoạn lớn DNA ( 156bp
trong hình 4.9 ),trong khi sự khuếch đại của chuỗi đột biến sẽ hình thành 1 vùng DNA
nhỏ hơn (138 bp trong hình 4.9) kích thước của những nhánh này dễ dàng nhận ra trên
gel polyacrylamide hoặc gel agarose. Thật vậy, sự biểu hiện của đột biến có thể được
quyết định bởi kích thước của sản phẩm PCR. Trong trường hợp này, do bệnh là gen
21


trội , hầu hết người chịu đựng là dị hợp tử, có một bảng coppy của gen wild – type và
bản coppy của gen đột biến, PCR khuếch đại của thể dị hợp sẽ mang lại 2 vùng DNA
có kích thước khác nhau.

Hình 4.9: PCR phát hiện đột biến do mất đoạn. Các trình tự DNA tự nhiên
(wild-type) của mạch xuôi là một phần của exon 2 từ gen Pax-3 ở người. Trình tự cho
thấy phần đầu tiên của sự bắt cặp, là nơi có độ bảo tồn cao, có chức năng như là một
yếu tố phiên mã. Một số bệnh nhân bị hội chứng Waardenburg vì bị xóa các trình tự
được in đậm. Điều này dẫn đến việc xoá bảy amin axit (MAHHGIR) và sự hình thành
của một codon mới (Agg mã hóa arginine). Tiếp theo là việc xoá sáu axit amin
(MAHHGI) từ protein. Mồi được thiết kế sao cho nhận biết được vị trí xóa.
(b) PCR khuếch đại DNA của cá thể bình thường với mồi 1 và 2 sẽ mang một
đoạn ADN 156 bp. Khuếch đại DNA từ một cá thể bị đột biến Waardenburg với hai
đoạn DNA

dài 156 bp và nhỏ hơn 138 bp. Các chuỗi nhỏ có nguồn gốc

từ các nhiễm sắc thể có chứa bp 18 bị xóa. Bởi vì hội chứng Waardenburg có tính chất
đặc biệt, đa số những người bệnh là dị hợp tử.

22


Đột biến điểm: phương pháp mô tả ở trên không thể được sử dụng để tìm ra đột
biến điểm với một gen. Mồi sẽ tạo ra 2 vùng DNA có cùng kích thước cho cả đột biến
và tự nhiên (wild-type). Sản phẩm của PCR có thể đưa ra để phân tích PCR nhưng
điều này sẽ tốn thời gian. Điều này thì đòi hỏi là PCR đồng nhất đột biến bazơ đơn.
PCR khai thác dựa vào đặc điểm của allen đặc biệt, theo cách này làm tăng khả năng
kéo dài của DNA polymerase 1 mồi cần chính xác đầu 3’.
PCR khuếch đại allen cụ thể của gen đột biến với β-globin là nguyên nhân gây
ra bệnh lưỡi cầu hình liềm. Để tìm ra đột biến điểm của 1 gen 3 mồi phải được thiết
kế để tham gia vào 2 phản ứng PCR mồi (mồi 3 trong hình 4.10) thì hiện diện ở cả hai
phản ứng, trong khi đó những mồi khác (mồi 1 và mồi 2) được tìm ra sự có mặt hoặc
là wild-type hoặc chuỗi DNA đột biến. Sự khuếch đại của wild –type chuỗi DNA với
mồi 1 và 3 được thực hiện. Tuy nhiên, nếu mồi 2 va 3 được sử dụng phản ứng sẽ thất
bại bởi vì sự ghép đôi không đối xứng giữa chuỗi wild- type và đuôi 3’ của mồi 2 .
như vậy sự khuếch đại của chuỗi DNA đột biến với mồi 1 và 3 sẽ thất bại, PCR sẽ
được thực hiện bình thường với mồi 2 và 3 sử dụng cho chuỗi đột biến như mẫu. Kết
quả của 1 phân tích thì được trình bày trên biểu đồ trong hình 4.10. Chúng tôi so sánh
1 chuỗi DNA wilp-type với một nhân vạt người mã bị đột biến đồng hợp tử. Nếu 1 cá
thể ở dạng dị hợp ,khi đó phản ứng PCR sẽ thực hiện bình thường từ cả alen sẽ được
biểu hiện trong DNA mẫu. Để chắc chắn rằng tất cả phản ứng PCR làm việc một cách
chính xác, 1 sự thiết lặp mồi sự khuếch đại 1 vùng không lien quan đến gen thì bao
gồm những kinh nghiệm làm PCR , vì thế một nhánh sẽ luôn luôn được biểu hiện,
điều kiện PCR, và sự có mặt hoạc váng mặt 1 nhánh phụ thì được nghiên cứu.
4.7. TẠO DÒNG CÁC SẢN PHẨM PCR
Như chúng ta đã biết, có thể tạo dòng các sản phẩm PCR bằng cách chèn thêm
các trình tự phụ vào trên các đầu 5’ của các mồi để các enzym nhận diện được phối
hợp. Cũng có thể tạo dòng các sản phẩm PCR một cách chính xác, thuận lợi bằng các
tác dụng vận chuyển giới hạn của Tag DNA polymerase để thêm vào một lượng A tự
do vào đầu 3’ của các sản phẩm PCR. Kết quả của việc này là hầu hết các phân tử
23


DNA được khuếch đại sử dụng Tag polymerase có mạch đơn 3’ chứa các trình tự A bị
dư ra (kí hiệu là 3’-A). Trong một quá trình gọi là tạo dòng TA, điều đó có thể tạo nên
bằng cách sử dụng vector tuyến tính T, cái mà có mạch 3’ chứa các trình tự T ở cả hai
đầu tạo nên sự chính xác, hiệu quả tạo dòng cao đối với các sản phẩm PCR (Zhou,
Clark and Gomez–Sanchez, 1995;Marchuk et al., 1991). Việc bổ sung giữa các sản
phẩm PCR 3’-A và các vector 3’-T làm tăng thêm hiệu quả ràng buộc, cái mà không
xảy ra với các phân tử DNA có kết thúc như thường. Tiến trình tạo dòng TA được thể
hiện sơ lược trong hình 4.11.

Hình 4.10: PCR dò đột biến điểm.
a). Bệnh hồng cầu lưỡi liềm gây ra do đột biến một cặp base một sự biến đổi A thành
T làm chuyển đổi Glu6 thành Val, trong gen β-globin ở người. Đối với cá nhân đồng
hợp tử loại đột biến này, sự thay thế trong đơn phân β-globin trong hemoglobin dẫn
đến việc giảm độ hòa tan của deoxyheamoglobin và hồng cầu có hình dạng bất
thường.
b). Xác định sự thay đổi của một base trong DNA sử dụng PCR với alen cụ thể.
24


Hình 4.11: Quá trình tạo dòng TA của các sản phẩm PCR. Một vector plasmid
được cắt bằng enzym cắt giới hạn tạo thành các đầu cùn, ví dụ EcoRV. Vector đã cắt
sẽ tương tác với Tag DNA polymerase khi có deoxythymine triphosphate (dTTP). Tác
dụng chuyển đổi có giới hạn của polymerase xúc tác thêm vào lượng dT đơn vào đầu
3’-hydroxyl của DNA. Kết quả là vector T được pha trộn với một sản phẩm Taqgenerated PCR và cả hai đều sử dụng DNA ligase. Kết quả là sản phẩm PCR được tạo
dòng chuyển vào trong vector T.

25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×