Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chất phân lập từ các chủng vi nấm nội sinh thuộc họ cam (rutaceae) và họ gừng (zingiberaceae) (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VÕ THỊ NGỌC MỸ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI
SINH CÓ KHẢ NĂNG TẠO HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TỪ CÂY THUỘC HỌ CAM (RUTACEAE) VÀ
HỌ GỪNG (ZINGIBERACEAE)

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01

TOÙM TAÉT LUAÄN AÙN TIEÁN SÓ SINH HỌC

Tp.HCM, năm 2016


Công trình được hoàn thành tại: Bộ Môn Vi Sinh – Kí Sinh Trùng, Khoa
Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp.HCM

Người hướng dẫn khoa học:
Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng
Phản biện 2: TS. Phạm Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện 3: TS. Đinh Minh Hiệp
Phản biện độc lập 1: TS. Phạm Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện độc lập 2: TS. Đinh Minh Hiệp

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
.................................................................................................................
.................................................................................................................
vào lúc

giờ

ngày

tháng

năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
-

Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên


GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Mở đầu
Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong các mô thực vật
nhưng không gây bệnh cho cây chủ. Trong đó, vi khuẩn và vi nấm là các vi
sinh vật nội sinh thường gặp nhất. Theo nghiên cứu gần đây của
Hawksworth và Rossman ước tính có đến 1,5 triệu loài vi nấm khác nhau,
nhưng chỉ khoảng 100.000 loài đã được mô tả. Vi nấm nội sinh có mối quan
hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn
tại, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon
sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật
gây bệnh. Nhiều tài liệu cho thấy, khi sống cộng sinh trong mô thực vật, vi
nấm nội sinh đã sinh ra nhiều hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm.
Họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam rất đa dạng,

trong đó cam, chanh, quýt, bưởi...là những cây trồng phổ biến, có nhiều ứng
dụng trong dược phẩm, thực phẩm… Từ những đặc tính trên cho thấy, tiềm
năng đây là những họ chứa hệ vi nấm nội sinh phong phú, sinh nhiều chất
biến dưỡng và có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh...Tuy vậy, cho đến nay, ở
Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung vẫn chưa có nhiều nghiên cứu
về vi nấm nội sinh trên các loài cây thuộc hai họ thực vật này. Do đó, việc
nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo ra các chất
biến dưỡng có lợi và có khả năng sinh các hoạt chất sinh học với hy vọng
dùng để điều trị bệnh cho người là một công việc hết sức thú vị và được
nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Từ đó chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên
cứu phân lập các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo hợp chất có hoạt
tính sinh học từ cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)”
với mục tiêu chính là tìm ra được các chủng vi nấm nội sinh có khả năng
sinh các hoạt chất sinh học cao từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ
Gừng (Zingiberaceae).
2. Tính cấp thiết của đề tài: Hiện nay, thực vật và các hoạt chất chiết từ
thực vật đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều loại bệnh. Theo
Balick và cộng sự năm 1996, trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại
có nguồn gốc từ thực vật, đây là các hợp chất đang được sử dụng ở nhiều
quốc gia. Trước thực tế này, một vấn đề được đặt ra là các hoạt chất sinh học
quí giá trong cây là do chính cây sinh ra hay là do mối liên hệ tương sinh với
các vi nấm nội sinh có ích trong mô thực vật. Trên thế giới có nhiều nghiên
cứu về các hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm được sinh từ vi nấm nội sinh,
và chúng chủ yếu thuộc về nhiều nhóm, bao gồm: alkaloid, peptid, steroid,
terpenoid, phenol, quinine và flavonoid… Điều này mang lại nhiều hứa hẹn
giải quyết được vấn đề kháng thuốc ở vi khuẩn vì các chất kháng sinh này là
các hợp chất mới và có hoạt tính cao.
1


3. Những đóng góp mới của luận án: Đây là những nghiên cứu đầu
tiên về A. terreus phân lập được từ họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng
(Zingiberaceae) trong nước và trên thế giới. Nghiên cứu này mở ra một
hướng tiếp cận mới về nguồn và phương thức cung cấp hoạt chất kháng
khuẩn và chống oxy hóa, với những đóng góp mới cụ thể như sau:
- Phân lập và định danh được 16/32 chủng vi nấm nội sinh từ họ Cam
(Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) trong đó có 4 chủng A.terreus có
khả năng sinh hoạt chất sinh học cao.
- Khảo sát được điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng A. terreus R-TN3.
Nuôi cấy và chiết được chất chiết thô có hoạt tính kháng S. aureus và MRSA
của chủng A. terreus R-TN3.
- Chiết được hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn. Đã xác định được giá
trị MIC của hợp chất Y có hoạt tính kháng S. aureus và MRSA. Hợp chất Y
đã được xác định có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (ung
thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 và ung thư
phổi NCI-H460).
- Đã tách được hợp chất tinh khiết X1 và X2 có hoạt tính chống oxy hóa
cao và giải phổ để tìm ra cấu trúc hợp chất. Đây là các hợp chất mới chưa
được công bố trên bất cứ công trình nào trong nước và trên thế giới. Hai hợp
chất này có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, bao gồm các
dòng tế bào: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep
G2 và ung thư phổi NCI-H460. Hợp chất X1 cũng đã được chứng minh có
khả năng ức chế tế bào ung thư thông qua khả năng cảm ứng apoptosis trên
dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 ở các điều kiện khảo sát.
4. Bố cục luận án: Luận án gồm 124 trang, đặt vấn đề 2 trang, tổng
quan tài liệu 26 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết quả
nghiên cứu 51 trang, bàn luận 11 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang. Luận
án có 66 bảng, 24 hình, 6 sơ đồ, 15 biểu đồ, 91 tài liệu tham khảo, gồm 10
tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng Anh và 2 tài liệu tham khảo từ internet, 6
phụ lục thể hiện các kết quả thực nghiệm.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi nấm nội sinh: Khái niệm vi sinh vật nội sinh, vi
nấm nội sinh, đặc điểm vi nấm nội sinh, trình bày quan hệ giữa vi nấm nội
sinh và thực vật, nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh,
sự đa dạng của vi nấm nội sinh, một số vi nấm nội sinh sinh hoạt chất sinh
học.
1.2. Tổng quan về Aspergillus: Trình bày vị trí phân loại, đặc điểm hình
thể, đặc điểm sinh thái và phân bố của Aspergillus. Phân loại và mô tả đặc
điểm hình thể, đặc điểm sinh thái và phân bố của A. terreus, các điều kiện
2


ảnh hưởng đến sự sinh hoạt chất sinh học và một số hoạt chất sinh học do A.
terreus sản sinh.
1.3. Hệ thống phân loại Aspergillus: Định danh Aspergillus theo
phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử.
1.4..Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Trình bày các nghiên
cứu ở ngoài nước và trong nước.
1.5. Tổng quan về các phương pháp chiết và phân tách hoạt chất sinh
học
- Các phương pháp chiết, tách phân đoạn: Khái niệm về các phương
pháp chiết như chiết lỏng – lỏng, chiết lỏng rắn, chiết pha rắn. Các phương
pháp sắc ký như phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc kí cột cổ
điển.
- Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học như phương pháp
khuếch tán, tự sinh đồ hay phương pháp pha loãng.
- Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất: Phổ hồng
ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng
từ hạt nhân (NMR).
- Các phương pháp thử độc tính tế bào: Phương pháp xác định khả
năng ức chế tế bào và phương pháp xác định khả năng cảm ứng apoptosis:
Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, thử nghiệm DNA phân mảnh, thử nghiệm
caspase – 3.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Nguồn mẫu phân lập: Các cây thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) và
họ Cam (Rutaceae).
2.1.2. Vi sinh vật thử nghiệm: E.coli ATCC 25922; P.aeruginosa
ATCC 27853; S.aureus ATCC 29213; MRSA ATCC 43300; S. faecalis
ATCC 29212; C. albicans ATCC 10231.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy: PDA, PSB,TSB,TSA, SDA, CDA.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân lập vi nấm nội sinh từ thực vật
2.2.2. Sàng lọc vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất kháng
khuẩn, kháng nấm: Sử dụng phương pháp khuếch tán từ khoanh thạch thử.
2.2.3. Sàng lọc vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất chống oxy
hóa: Hoạt hóa vi nấm và chuẩn bị mẫu thử; xác định hoạt chất chống oxy
hóa của các chất do vi nấm nội sinh sản sinh bằng phương pháp nhuộm
DPPH nhanh.
2.2.4. Phương pháp định danh vi nấm: Các vi nấm nội sinh sẽ được
định danh theo khóa phân loại của Guy St. Germain, năm 1995.
3


2.2.5. Chọn chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất sinh
học: Sử dụng phương pháp khuếch tán từ khoanh thạch thử.
2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên sự sinh hoạt chất
kháng khuẩn của A. terreus R-TN3: A. terreus R-TN3 được nuôi trên môi
trường PDB với pH môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 4, 5, 6, 7,
8.
2.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh hoạt chất
kháng khuẩn của A. terreus R-TN3: Chủng vi nấm nội sinh được nuôi
trong môi trường PDB ở 37 oC và nhiệt độ phòng (25 – 30 oC).
2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen, độ thông khí
lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn: Thiết kế mô hình thực nghiệm D –
Optimal bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6 với các thành phần môi trường
và điều kiện nuôi cấy (xi) được xác định dựa vào đường kính vòng ức chế
trên MRSA, S.aureus.
2.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của dầu lên sự sinh hoạt chất kháng
khuẩn của A. terreus R-TN3: Nuôi cấy A. terreus R-TN3 trên môi trường
đã được bổ sung 1 % dầu mè, dầu hướng dương, dầu đậu nành, dầu bắp, dầu
olive.
2.2.10. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu: Thiết kế mô hình thực
nghiệm bằng phần mềm Design - Expert 6.0.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi
cấy bằng phần mềm BC Pharsoft và nuôi cấy 3 lô kiểm chứng.
2.2.11. Nuôi cấy chủng A. terreus R-TN3 trong môi trường tối ưu: A.
terreus R-TN3 được nuôi cấy trên môi trường tối ưu đã khảo sát ở điều kiện
nuôi cấy tĩnh, nhiệt độ phòng (25 – 30 oC).
2.2.12. Chiết hoạt chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy A. terreus RTN3: Sử dụng các phương pháp để chiết hoạt chất sinh học của cao chiết thô
như: Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy; Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
của chất chiết thô; Phương pháp tự sinh đồ và phương pháp vi pha loãng.
2.2.13. Tách các phân đoạn cho hoạt tính sinh học từ chất chiết thô
2.2.13.1. Sắc ký lớp mỏng: Chất chiết thô từ môi trường nuôi A. terreus
R-TN3 được hòa trong MeOH với nồng độ 8 mg/ml, chấm dung dịch chất
thử lên bản mỏng và phát hiện kết quả bằng phương pháp soi dưới đèn
UV254, UV365, thuốc thử VS.
2.2.13.2. Sắc kí cột cổ điển: Hệ dung môi được dùng để triển khai cột là
chloroform - methanol với tỷ lệ thay đổi theo hướng methanol tăng dần.
Triển khai cột, hứng các phân đoạn và kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký
lớp mỏng. Xác định phân đoạn cho hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp
tự sinh đồ. Xác định phân đoạn cho hoạt tính chống oxy hóa bằng phương
pháp định tính nhanh bằng DPPH.
4


2.2.14. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất: Các chất thu được qua
sắc ký cột được xác định cấu trúc dựa trên các phương pháp phổ: Phổ khối
phun mù điện tử (ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1HNMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY).
2.2.15. Thử độc tính tế bào: Phương pháp thử độc tính tế bào in vitro
được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độc tính tế bào
chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm hoặc diệt tế
bào ung thư ở điều kiện in vitro.
2.2.16. Phân tích thống kê dữ liệu: Số liệu được xử lý thống kê bằng
phần mềm Microsoft Excel, trong bộ Microsoft Office phiên bản 2003.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính khảng khuẩn, kháng nấm: Qua sàng
lọc, chúng tôi thu được 10/82 chủng vi nấm nội sinh trên cây họ Gừng
(Zingiberaceae) và 11/64 chủng vi nấm nội sinh trên cây họ Cam (Rutaceae)
có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm. Trong đó, các chủng
sinh chất có hoạt tính cao và ổn định, phổ kháng khuẩn rộng là: R - TN3, N GL1, Q - TL3, T2-CL1.
3.1.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa: Kết quả sàng lọc các
chủng có hoạt tính chống oxy hóa thu được 18/146 chủng có hoạt tính từ
trung bình đến mạnh ở họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae).
3.1.3. Kết quả định danh các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh
học: Qua quá trình sàng lọc và thử hoạt tính sinh học các chủng vi nấm nội
sinh, chúng tôi thu được cả xạ khuẩn và vi nấm sống nội sinh trong cây. Vì
các chủng xạ khuẩn nội sinh này có khả năng sản sinh các hoạt chất sinh học
nên chúng tôi tiến hành thu nhận và định danh. Kết quả định danh được
16/32 chủng có khả năng sinh hoạt chất từ trung bình đến mạnh và thu được
kết quả sau:
3.1.4. Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao: Tiến hành
khảo sát khả năng phát triển và sinh hoạt chất sinh học của các chủng A.
terreus.
3.1.4.1. Khảo sát khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn của các chủng
A. terreus: Tiến hành nuôi các chủng A. terreus trên môi trường PDA, thử
hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm trên 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm là S.
aureus, S. feacalis, Pseudomonas, E. coli, MRSA và 1 chủng vi nấm C.
albicans vào ngày thứ 7 nuôi cấy.
Bảng 3.7. Tác động kháng khuẩn của các chủng A. terreus
STT

Chủng

1

T2– CL1

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
10,33 ± 1,33d
12,0 ± 1,54c

5


2
3
4

Q – TL3
R – TN3
N – GL1

14,66 ± 1,33c
21,33 ± 1,85a
20,33 ± 1,33a

17,33 ± 1,54b
20,67 ± 1,31a
20,33 ± 1,54a

a,b,c,d: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05.
Kết quả cho thấy chủng T2 – CL1 tác động kháng yếu nhất, chủng R –
TN3, N – GL1 kháng mạnh, chủng Q – TL3 khả năng kháng yếu hơn N –
GL1 nhưng vẫn kháng khuẩn ở mức cao (Bảng 3.6).
3.1.4.2. Khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa của các chủng A.
terreus: Sau khi cấy hoạt hóa trên CDA, tiến hành pha dịch treo nuôi trên
PDB trong 7 ngày; sau đó định tính khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa
của các chủng A. terreus.
Bảng 3.8. Kết quả định tính khả năng chống OXH của các chủng A. terreus
STT
1
2
3
4

Chủng
T2 – CL1
Q – TL3
R – TN3
N – GL1

Kết quả chống OXH
++
++
+++
++

Chú thích: (+): có hoạt tính chống oxy hóa yếu; (++): có hoạt tính chống
oxy hóa trung bình; (+++): có hoạt tính chống oxy hóa mạnh.
Dựa vào kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy trong 4 chủng A. terreus nghiên
cứu, chủng R – TN3 sinh hoạt chất chống oxy hóa mạnh nhất, ba chủng còn
lại gồm T2 – CL1, Q – TL3, N – GL1 sinh hoạt chất chống oxy hóa ở mức
trung bình (Phụ lục 3).
3.1.4.3. Khảo sát đặc tính cao chiết
 Khảo sát hệ dung môi tối ưu: Chạy sắc ký với 8 hệ dung môi khảo
sát thu được kết quả hệ dung môi CHCl3:CH3COOH với tỷ lệ 9:1 phân tách
nhiều hoạt chất nhất ở cả 4 chủng A. terreus.
 Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy: Các cao chiết thô sau khi
được hòa tan bằng dung môi với nồng độ thích hợp được tẩm lên đĩa giấy đặt
lên môi trường đã trải dịch khuẩn thử nghiệm.
Bảng 3.10. Tác động kháng khuẩn của cao chiết thô các chủng A. terreus.
Vi khuẩn
S. aureus
MRSA

T2 – CL1
16,67±1,72b
16,0±1,54a

Đường kính vòng ức chế (mm)
Q - TL3
R – TN3
N - GL1
9,67±1,72c
18,67±1,72a
17,67±1,72ab
17,0±1,54a
17,33±1,54a
13,67±1,54b

a,b,c,ab: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05.

6


Cao chiết thô của chủng R-TN3 cho kết quả kháng tối đa đối với 2 chủng
MRSA và S.aureus. Các cao chiết thô của các chủng T2-CL1, Q-TL3, NGL1 cho kết quả kháng trung bình.
 Phương pháp tự sinh đồ: Các bản mỏng sắc ký đã phân tách thành
các hoạt chất được đặt trên đĩa môi trường trải khuẩn thử nghiệm nhằm tìm
ra phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn (Bảng 3.10).
Bảng 3.11. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn thu được từ các
chủng A. terreus

PĐ 6
PĐ 12
T2-CL1 PĐ 13
PĐ 15
PĐ 6
PĐ 9
Q-TL3 PĐ 10
PĐ 12
PĐ 15
Chủng

MRSA
9,33±1,44b
11,67±1,44a
11,33±1,44a
12,67±1,44a
0,0c
9,33±0,81b
13,67±0,81a
0,0c
9,33±0,81b

S.aureus
0,00c
11,67±1,22b
0,00c
13,33±1,22a
14,33±1,24b
9,33±1,24d
0,0e
12,33±1,24c
16,67±1,24a


MRSA
S.aureus
PĐ 6 12,67±1,15b 12,0±1,49b
PĐ 12 6,67±1,15c 7,33±1,49c
R-TN3 PĐ 13 16,67±1,15a 16,67±1,49a

Chủng

PĐ 11
PĐ 12
N-GL1 PĐ 13

0,0c
9,33±1,33b
13,0±1,33a

9,33±0,94b
12,67±0,94a
0,0c

a,b,c,d,e: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05.
Từ kết quả Bảng 3.10 cho thấy chủng R-TN3 có 3 phân đoạn kháng trong
đó phân đoạn 13 cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với MRSA và S.
aureus.
3.1.5. Khảo sát điều kiện nuôi cấy của chủng A. terreus R-TN3
3.1.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy với chủng A.
terreus R-TN3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy lên sự sinh
hoạt chất kháng khuẩn của chủng A. terreus R-TN3.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau đối với sự sinh hoạt
chất kháng khuẩn của A. terreus R-TN3
pH môi trường
4
5
6
7
8

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
11,67 ± 1,41d
9,67 ± 1,24d
14,0 ± 1,41c
15,0 ± 1,24b
a
20,67 ± 1,31
21,33 ± 1,85a
b
15,67 ± 1,41
15,67 ± 1,24b
c
14,0 ± 1,41
13,67 ± 1,24c

a,b,c,d: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05. Kết quả ở Bảng 3.12 cho thấy môi trường nuôi cấy có pH 6 thích
hợp nhất cho sự sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A. terreus R-TN3..
3.1.5.2. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đối với chủng A. terreus R-TN3

7


Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn của
chủng A. terreus R-TN3. Nhiệt độ được khảo sát trong thí nghiệm là nhiệt độ
phòng và nhiệt độ 37 oC. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.13.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh hoạt chất kháng khuẩn
của A. terreus R-TN3
Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ phòng
Nhiệt độ 37oC

Đường kính vòng ức chế (mm)
MRSA
S. aureus
21,33 ± 1,85a
20,67 ± 1,31a
15,0 ± 1,85b
15,67 ± 1,31b

a,b: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở mức
0,05. Ở nhiệt độ phòng (25-30 oC), chủng A. terreus R-TN3 sinh hoạt chất
kháng khuẩn mạnh hơn. Vậy chọn nhiệt độ phòng là nhiệt độ thích hợp để
tiến hành nuôi cấy chủng A. terreus R-TN3.
3.1.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen, độ thông khí
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và độ thông khí lên sự
sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A. terreus R-TN3. Lượng bào tử đầu
vào là 104 CFU/ml, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Thành phần môi
trường và điều kiện nuôi cấy được xác định dựa vào đường kính vòng ức chế
của MRSA và S. aureus vào các thời điểm 5, 7, 9, 12 ngày.
Bảng 3.15. Các mức khảo sát của biến độc lập
Mức khảo sát
1
2
3
4

x1
Glucose 2 %
Saccharose 1 %
Tinh bột gạo 2 %
Rỉ đường 2,7 %

x2
Khoai tây 20 %
Cao thịt 1 %
Cao nấm men 1 %
Dịch đậu nành 10 %

x3
Lắc
Tĩnh

Từ 23 môi trường có thành phần và điều kiện thông khí khác nhau, ở môi
trường có hàm lượng khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % hoặc saccharose 1 %,
trong điều kiện tĩnh, A. terreus R-TN3 cho tác động kháng MRSA, S. aureus
tốt và ổn định; thời gian thích hợp để thu nhận hoạt chất kháng khuẩn từ dịch
nuôi cấy là ngày thứ 7 nuôi cấy.
3.1.5.4. Ảnh hưởng của dầu: Để khảo sát ảnh hưởng của dầu lên sự sinh
hoạt chất kháng khuẩn của A. terreus R-TN3, các dầu thực vật như dầu mè,
dầu hướng dương, dầu nành, dầu bắp, dầu olive (nồng độ 1 %) được bổ sung
vào môi trường khoai tây-rỉ đường với thành phần gồm khoai tây 20 %, rỉ
đường 2,7 %, nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Thực hiện song song với chứng
là môi trường khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % không bổ sung dầu.
Kết quả cho thấy ở môi trường khoai tây-rỉ đường không bổ sung dầu thì
chủng A. terreus R-TN3 có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn cao nhất.
Điều này cho thấy dầu ảnh hưởng không tốt hoặc có khả năng kiềm hãm sự
sinh hoạt chất kháng khuẩn của A. terreus R-TN3 (Bảng 3.16).
8


Bảng 3.17. Ảnh hưởng của các loại dầu thực vật đối với sự sinh hoạt chất
kháng khuẩn của A. terreus R-TN3
Môi trường nuôi cấy
KT-RĐ
KT-RĐ + dầu mè
KT-RĐ + dầu hướng dương
KT-RĐ + dầu đậu nành
KT-RĐ + dầu bắp
KT-RĐ + dầu olive

Đường kính vòng ức chế (mm)
MRSA
S. aureus
19,33 ± 1,03a
20,33 ± 1,03a
14,67 ± 1,03c
15,33 ± 1,03d
c
14,67 ± 1,03
16,33 ± 1,03c
b
16,67 ± 1,03
18,0 ± 1,03b
b
17,33 ± 1,03
17,33 ± 1,03bc
b
16,33 ± 1,03
15,33 ± 1,03d

a,b,c,d,bc: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau
ở mức 0,05.
3.1.6. Thiết kế và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
3.1.6.1. Thiết kế mô hình thực nghiệm
Mô hình thực nghiệm được thiết kế bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6
gồm 26 môi trường. Dữ liệu môi trường, đường kính vòng ức chế và sinh
khối được trình bày trong Bảng 3.17.
Bảng 3.18. Môi trường nuôi cấy A. terreus R-TN3 được thiết kế bằng
phần mềm Design Expert 6.0.6
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

x1
20
10
10
30
30
10
30
10
20
30
20
10
20
20
10
30
10
20
30
30
20

x2 (%)
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
0,5
0,5
0,5
0.5
0.5
1
1
1

x3
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Rỉ đường
Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose

x4
0,05
0,05
0,1
0,2
0,05
0,2
0,05
0,1
0,2
0,1
0,05
0,2
0,1
0,2
0,05
0,1
0,2
0,1
0,1
0,2
0,05

y1
22
22
22
23
21
24
24
21
20
22
18
16
20
0
14
13
10
15
20
19
11

y2
0,0744
0,0535
0,0486
0,106
0,167
0,1567
0,16
0,0563
0,0414
0,1745
0,103
0,0881
0,088
0,0826
0,0795
0,0929
0,0561
0,0543
0,1124
0,1397
0,1409

9


22
23
24
25
26

10
10
30
10
20

1
2
2
2
2

Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose
Saccharose

0,05
0,1
0,05
0,05
0,2

16
12
18
11
20

0,0964
0,134
0,1614
0,1149
0,1569

3.1.6.2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm BC Pharsoft bao gồm các thông số tối
ưu của điều kiện nuôi cấy và giá trị dự đoán của các tính chất sản phẩm.
Bảng 3.25. Thành phần công thức tối ưu
Thành phần công thức
xi
Giá trị tìm được
x1
30
x2
3,28
x3
Rỉ đường
x4
0,1

Tính chất sản phẩm
yi
Giá trị dự đoán
y1
22,03
y2
0,17

Thành phần môi trường tối ưu dự đoán gồm khoai tây 30 %; rỉ đường
3,28 %; lượng nấm đầu vào có OD530 = 0,1; sử dụng 1 ml dịch nấm cho 100
ml môi trường nuôi cấy.
Kiểm chứng công thức tối ưu bằng thực nghiệm,so sánh với kết quả dự
đoán: Tiến hành nuôi cấy 3 lô với các điều kiện tối ưu trong cùng một điều
kiện và xác định các thông số yi. Kết quả phân tích phương sai 2 yếu tố
không lặp những số liệu trong bảng cho thấy: Quy trình nuôi cấy có tính lặp
lại, tính chất sản phẩm giữa 3 lô khác nhau không có ý nghĩa thống kê
(p=0,87 > 0,05). Kết quả dự đoán của phần mềm khác nhau không có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05). Do đó, phần mềm BC Pharsoft đã dự đoán đúng
điều kiện nuôi cấy tối ưu cũng như tính chất của dịch nuôi cấy.
3.1.7. Khảo sát dung môi chiết tối ưu: Nuôi cấy chủng A. terreus RTN3 trên môi trường tối ưu, sau đó tiến hành chiết 2 lần (1:1) với dung môi.
Bảng 3.27. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết
Dịch chiết
Methanol
Ethyl acetat
Chloroform
n – hexan

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
16,67 ± 0,94a
12,0 ± 1,22b
17,33 ± 0,94a
17,33 ± 1,22a
b
13,33 ± 0,94
10,33 ± 1,22c
c
0,0
0,0d

a,b,c,d: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05. Dựa vào Bảng 3.26 cho thấy hoạt chất kháng khuẩn phân bố chủ
yếu trong chất chiết với ethyl acetat, tuy nhiên dịch chiết methanol và nhexan vẫn cho hoạt tính kháng khuẩn tương đối cao trên S. aureus, MRSA.
Chọn dung môi ethyl acetat làm dung môi chiết tối ưu.
10


3.1.8. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết từ môi trường
nuôi nấm và từ sinh khối
Chất chiết từ môi trường nuôi cấy A. terreus R-TN3 và từ sinh khối. Các
chất chiết được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch
tán qua đĩa giấy.
Bảng 3.28. Tác động kháng khuẩn của các chất chiết của A. terreus R-TN3.
Chất thử
Chiết từ dịch nuôi cấy
Chiết từ sinh khối

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
17,33 ± 0,93a
17,33 ± 0,93a
0,0b
0,0b

a,b: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở mức
0,05. Chất chiết từ môi trường nuôi nấm A. terreus R-TN3 có tác động
kháng khuẩn đối với S.aureus và MRSA. Chất chiết từ sinh khối nấm A.
terreus R-TN3 không có tác động kháng khuẩn đối với S.aureus và MRSA.
3.1.9. Nuôi cấy và chiết hoạt chất kháng khuẩn từ A. terreus R-TN3:
Dịch nuôi cấy sau 7 ngày có màu nâu xám được chiết với EtOAc để cho
chất chiết thô – EtOAc (chất CT – EtOAc). Chất CT – EtOAc đã hút ẩm đến
khối lượng không đổi: Màu nâu đen, có mùi thơm, thể chất dẻo. Kết quả
nuôi cấy từ 1 lít môi trường nuôi cấy tối ưu, thu được khoảng 415 mg cao
thô. Để có đủ lượng cao thô để có thể cô lập được hợp chất tinh khiết cho
việc chạy phổ xác định cấu trúc, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trên 50 lít
môi trường.
3.1.10. Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết thô
3.1.10.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thô
Cao chiết thô sau khi được hòa tan bằng dung môi với nồng độ thích hợp
được tẩm lên đĩa giấy đặt lên môi trường đã trải dịch khuẩn thử nghiệm bằng
phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy. Kết quả cho thấy cao chiết thô có tác
động kháng khuẩn khá cao đối với S. aureus và MRSA.
3.1.10.2. Định tính sơ bộ thành phần của cao chiết thô
Thực hiện các phản ứng định tính hóa học nhằm sơ bộ xác định nhóm
hợp chất tự nhiên của cao chiết thô. Kết quả trên cho thấy cao chiết thô của
chủng A.terreus R-TN3 có chứa tinh dầu, carotenoid, courmarin,
anthraglycosid.
3.1.11. Khảo sát thành phần hóa học của chất CT– EtOAc từ dịch
nuôi cấy A. terreus R-TN3
3.1.11.1. Xác định vị trí hoạt chất kháng khuẩn trên bản mỏng
Trên sắc ký đồ SKLM chất chiết thô với hệ dung môi CHCl3 –
CH3COOH (9:1), được phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm,
365 nm và phun thuốc thử VS cho tổng cộng 17 vết, đường kính vòng ức chế
được thể hiện ở Bảng 3.31.
11


Bảng 3.32. Hoạt tính kháng khuẩn của chất CT – EtOAc
Vết
6
12
13

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
11,33 ± 1,15b
11,33 ± 1,15b
7,33 ± 1,15c
7,33 ± 1,15c
a
15,33 ± 1,15
15,33 ± 1,15a

a,b,c: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05.
3.1.12. Sắc ký cột cổ điển
Tổng khối lượng cao cả 9 phân đoạn thu được qua quá trình sắc ký cột là
10,592 g. Từ phân đoạn 1 tinh sạch được hợp chất X1 màu vàng nhạt, dạng
vô định hình, có Rf là 0,692. Tiến hành định tính khả năng chống oxy hóa
của hợp chất X1 bằng DPPH, kết quả cho thấy hợp chất X1 có hoạt tính
chống oxy hóa mạnh. Từ phân 3 gam phân đoạn 1 trên (sau khi đã tách
hợp chất X1), nhồi chạy cột nhỏ với hệ dung môi n-hexan : chloroform
(9:1).
Bảng 3.35. Kết quả chạy cột của phân đoạn 1

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Dung môi giải ly
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan: chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform
n-hexan : chloroform

Tỷ lệ
9:1
9:1
8:2
7:3
7:3
7:3
7:3
7:3
7:3
6:4
6:4
6:4
6:4
5:5
5:5
5:5

Vết
4
0
0
3
2
2
3
3
0
4
2
4
3
2
1

Ghi chú
Tạp

Chất Y

Chất X2
Khóa cột, kết tinh

Kết quả chạy cột 3g phân đoạn X1 thu được chất X2 có hoạt tính chống
oxy hóa cao và hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn cao. Tiến hành tinh
sạch hợp chất X2 và Y để giải cấu trúc và thử độc tế bào ung thư để xác định
hoạt tính sinh học của hợp chất X2 và Y.

12


Y

X2

X1
2

Hình 3.13. Kết quả SKLM của hợp chất X1, X2 và Y
3.1.13. Hợp chất Y
3.1.13.1. Hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất Y
Thử hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn của hợp chất Y bằng phương
pháp tự sinh đồ và khuếch tán qua đĩa giấy thu được kết quả hợp chất Y có
hoạt tính kháng cao đối với S.aureus và cho hoạt tính kháng trung bình đối
với MRSA.
Xác định phân đoạn kháng của hợp chất Y bằng phương pháp tự sinh
đồ
Hợp chất Y chỉ chứa 2 vết trên sắc ký đồ (UV254), trong đó chủ yếu là vết
số 13 và vết số 12, hai phân đoạn này cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn
vết 6 và các vết còn lại. Kết quả cho thấy ở nồng độ chất thử Y là 3,125
µg/ml thì cho hoạt tính kháng với chủng S. aureus và MRSA ở mức trung
bình. Bằng phương pháp SKLM và tự sinh đồ, đã chiết được hợp chất Y
chứa hai hợp chất khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn và xác định được giá
trị MIC của hợp chất Y là 25 µg/ml.
3.1.13.2. Kết quả thử độc tế bào của hợp chất Y
Thử độc tế bào trên tế bào ung thư vú MCF-7: Hợp chất Y được xác
định khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7.
Bảng 3.38. Kết quả thử độc tế bào vú MCF-7 của hợp chất Y
Nồng độ
(μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
76,90
87,02
89,23 84,38 6,57
70,09
71,58
69,51 70,39 1,07
43,75
48,09
45,21 45,69 2,21
17,30
10,92
9,72
12,64 4,08
1,00
-6,08
-9,30
-4,79
5,27
54,08
52,38
54,19 53,55 1,01

Khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất Y gia tăng tuyến
tính theo nồng độ. Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 70 % tế bào MCF-7 và
khi tăng lên nồng độ 100 µg/ml thì gây chết hơn 84 % tế bào MCF-7.
13


Thử độc tế bào trên tế bào ung thư cổ tử cung Hela: Hợp chất Y được
xác định khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela.
Bảng 3.39. Kết quả thử độc tế bào Hela của hợp chất Y
Nồng độ (μg/ml)
75
50
40
30
20
10
IC50

Lần 1
64,36
52,14
50,31
29,12
20,16
9,37
39,86

Lần 2
65,59
52,83
51,42
21,05
19,03
10,32
39,53

Lần 3
61,56
60,75
53,23
24,73
16,40
8,60
38,87

TB
63,83
55,24
51,65
24,97
18,53
9,43
39,42

ĐLC
2,06
4,79
1,47
4,04
1,93
0,86
0,50

Khả năng ức chế tế bào ung thư Hela của hợp chất Y gia tăng tuyến tính
theo nồng độ. Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết hơn 55 % tế bào Hela và khi
tăng lên ở nồng độ 75 µg/ml thì gây chết hơn 63 % tế bào Hela.
Thử độc tế bào trên tế bào ung thư gan Hep G2: Hợp chất Y được xác
định khả năng ức chế tế bào ung thư gan Hep G2.
Bảng 3.40. Kết quả thử độc tế bào ung thư gan Hep G2 của hợp chất Y
Nồng độ (μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
78,25
75,00
70,07 74,44 4,12
61,63
58,86
56,58 59,02 2,53
46,83
41,34
35,36 41,18 5,73
26,89
29,13
23,85 26,62 2,65
-1,27
-3,56
-2,27
-2,37
1,15
52,38
56,45
63,80 57,54 5,79

Khả năng ức chế tế bào ung thư Hep G2 của hợp chất Y gia tăng tuyến
tính theo nồng độ. Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 59 % tế bào Hep G2 và
khi tăng lên ở nồng độ 100 µg/ml gây chết hơn 74 % tế bào Hep G2.
Thử độc tế bào trên tế bào ung thư phổi NCI-H460: Hợp chất Y được
xác định khả năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460.
Bảng 3.41. Kết quả thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 của hợp chất Y
Nồng độ
(μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
76,34
84,36
82,10 80,93 4,13
58,99
60,11
64,43 61,18 2,87
18,28
18,51
21,79 19,53 1,96
-7,07
2,01
4,12
-0,31
5,94
-15,82 -4,30
-0,59
-6,90
7,94
71,07
68,79
66,56 68,81 2,26

14


Khả năng ức chế tế bào ung thư NCI-H460 của hợp chất Y gia tăng tuyến
tính theo nồng độ. Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 61 % tế bào NCI-H460
và khi tăng lên ở nồng độ 100 µg/ml gây chết hơn 80 % tế bào NCI-H460.
3.1.15. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân tách
3.1.15.1. Hợp chất X1: Hợp chất X1 thu được từ sắc ký cột cổ điển, được
xác định cấu trúc dựa vào các kỹ thuật phổ như phổ H, C13, phổ HRMS và
phổ 2 chiều để xác định cấu trúc (Phụ lục 4). Kết quả cho thấy hợp chất X1
có công thức cấu tạo như sau:

Hình 3.18. Các tương tác HMBC chính và CTCT của X1
Chất X1 có tên gọi: Methyl 2-acetyl-5-methoxy-4-oxo-4H-chromen-7carboxylat. Đây là hợp chất mới, chưa được công bố ở công trình nào trong
nước và trên thế giới.
3.1.15.2. Hợp chất X2: Hợp chất X2 thu được từ sắc ký cột cổ điển, được
xác định cấu trúc dựa vào các kỹ thuật phổ như phổ H, C13, phổ HRMS và
phổ 2 chiều để xác định cấu trúc (Phụ lục 5). Dung môi hòa tan mẫu:
DMSO. Kết quả cho thấy hợp chất X2 có công thức cấu tạo như sau:

Hình 3.19. Các tương tác HMBC và CTCT của X2
Chất X2 có tên gọi: Methyl 2-((4-amino-2-bromo-3-methyl-5thioxocyclopenta-1,3-dien-1-yl) oxy)-4-hydroxy-6-methoxybenzoat. Đây là
hợp chất mới và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào trên thế giới.
3.1.16. Kết quả thử hoạt tính sinh học của hợp chất X1
3.1.16.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm
DPPH của hợp chất X1: Kết quả cho thấy chất X1 có hoạt tính chống oxy
hóa cao, khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH gia tăng tuyến tính theo nồng
15


độ. Ở nồng độ 100 ppm chất X1 có khả năng đánh bắt hơn 80 % gốc tự do
DPPH.
3.1.16.2. Kết quả thử độc tế bào của hợp chất X1
Hợp chất X1 được xác định khả năng ức chế tế bào ung thư như MCF-7,
Hela, Hep G2 và NCI-H460. Kết quả được trình bày như sau:
Thử độc tế bào MCF-7: Các hợp chất phân lập được xác định khả năng
ức chế tế bào ung thư vú MCF-7.
Bảng 3.48. Kết quả thử độc tế bào MCF-7 của chất X1
Nồng độ (µg/ml)
100
50
40
20
10
5
IC50 (µg/ml)

Lần 1
80,82
75,06
68,92
33,12
10,54
-0,86
28,88

Lần 2
81,27
73,61
65,20
31,40
11,29
4,12
30,04

Lần 3
79,87
78,34
71,28
34,50
8,05
-3,09
27,90

TB
80,65
75,67
68,47
33,01
9,96
0,06
28,94

ĐLC
0,71
2,43
3,07
1,55
1,69
3,69
1,07

Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 75 % tế bào MCF-7 và tăng lên gây
chết hơn 80 % tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào Hela: Các hợp chất phân lập được xác định khả năng ức
chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela.
Bảng 3.49. Kết quả thử độc tế bào Hela của chất X1
Nồng độ (µg/ml)
100
75
50
25
10
IC50 (µg/ml)

Lần 1
90,78
65,48
58,58
21,13
-3,77
46,26

Lần 2
84,20
64,11
59,27
25,00
2,82
45,39

Lần 3
81,10
66,51
60,14
23,92
0,91
45,59

TB
85,36
65,37
59,33
23,35
-0,01
45,75

ĐLC
4,94
1,20
0,78
2,00
3,39
0,46

Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 65 % tế bào Hela và tăng lên gây chết
hơn 85 % tế bào Hela ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào Hep G2: Các hợp chất phân lập được xác định khả năng
ức chế tế bào ung thư gan Hep G2.
Bảng 3.50. Kết quả thử độc tế bào Hep G2 của chất X1
Nồng độ (µg/ml)
100
75
50
25
10
IC50 (µg/ml)

Lần 1
81,83
75,75
65,50
32,81
12,18
36,53

Lần 2
79,79
75,90
67,29
36,30
15,06
34,21

Lần 3
77,23
74,58
64,26
32,26
14,58
37,35

TB
79,62
75,41
65,68
33,79
13,94
36,03

ĐLC
2,31
0,72
1,52
2,19
1,54
1,63

16


Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 75 % tế bào NCI-H460 và tăng lên gây
chết gần 80 % tế bào ung thư gan Hep G2 ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào NCI-H460: Các hợp chất phân lập được xác định khả
năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460.
Bảng 3.51. Kết quả thử độc tế bào NCI-H460 của chất X1
Nồng độ (µg/ml)
100
50
35
25
10
IC50 (µg/ml)

Lần 1
76,34
68,46
62,67
31,91
16,59
32,12

Lần 2
80,46
72,86
60,74
29,04
22,96
30,83

Lần 3
78,21
73,92
65,20
31,09
20,08
29,74

TB
78,34
71,75
62,87
30,68
19,88
30,90

ĐLC
2,06
2,90
2,24
1,48
3,19
1,19

Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết hơn 70 % tế bào NCI-H460 và tăng lên gần
80 % tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml. Kết quả cho thấy hợp chất X1
có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, thông qua khả
năng ức chế 4 dòng tế bào thử nghiệm: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử
cung Hela, ung thư gan Hep G2 và ung thư phổi NCI-H460.
3.1.17. Kết quả thử hoạt tính sinh học của hợp chất X2
3.1.17.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm
DPPH của hợp chất X2: Hợp chất X2 được xác định khả năng chống oxy
hóa bằng thử nghiệm DPPH. Kết quả cho thấy chất X2 có hoạt tính chống
oxy hóa khá cao, khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH gia tăng tuyến tính theo
nồng độ. Ở nồng độ 400 ppm chất X2 có khả năng đánh bắt hơn 75 % gốc tự
do DPPH.
3.1.17.2. Kết quả thử độc tế bào của hợp chất X2
Hợp chất X2 được xác định hoạt tính ức chế tế bào trên các dòng tế bào
MCF-7, Hela, Hep G2 và NCI-H460. Kết quả được trình bày như sau:
Thử độc tế bào ung thư vú MCF-7: Hợp chất X2 được xác định khả
năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7.
Bảng 3.53. Kết quả thử độc tế bào ung thư vú MCF-7 của chất X2
Nồng độ
(μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
78,65
77,02
78,96 78,21 1,04
74,91
74,84
74,69 74,82 0,11
65,97
67,39
67,32 66,89 0,80
19,34
27,95
27,62 24,97 4,88
-9,67
-7,38
-8,32
-8,45
1,15
44,45
41,20
41,14 42,26 1,89

17


Khả năng ức chế tế bào của hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ.
Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 74 % tế bào ung thư vú MCF-7 và tăng lên
gây chết gần 80 % tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào ung thư cổ tử cung Hela: Hợp chất X2 được xác định
khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela.
Bảng 3.54. Kết quả thử độc tế bào Hela của chất X2
Nồng độ (μg/ml)
75
50
40
30
20
10
IC50

Lần 1
66,59
60,82
51,82
23,23
7,54
0,00
39.36

Lần 2
62,27
57,73
53,26
27,27
8,09
-8,07
38,75

Lần 3
68,56
56,05
51,32
24,27
5,80
-4,49
39,51

TB
65,81
58,20
52,13
24,93
7,14
-4,19
39,21

ĐLC
3,22
2,42
1,01
2,10
1,19
4,04
0,41

Khả năng ức chế tế bào của hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ.
Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết hơn 58 % tế bào ung thư Hela và tăng lên gây
chết hơn 65 % tế bào Hela ở nồng độ 75 µg/ml.
Thử độc tế bào Hep G2: Hợp chất X2 được xác định khả năng ức chế tế
bào ung thư gan Hep G2.
Bảng 3.55. Kết quả thử độc tế bào ung thư gan Hep G2 của chất X2
Nồng độ
(μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
82,72
86,85
90,89 86,82 4,09
71,96
75,99
78,23 75,39 3,18
53,44
59,92
56,96 56,77 3,24
3,88
14,61
9,37
9,29
5,37
0,18
4,59
-2,53
0,75
3,60
52,00
45,44
47,47 48,30 3,36

Khả năng ức chế tế bào của hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ.
Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 75 % tế bào ung thư gan Hep G2 và tăng
lên gây chết hơn 86 % tế bào Hep G2 ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460: Hợp chất X2 được xác định
khả năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460.
Khả năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 của hợp chất X2 gia tăng
tuyến tính theo nồng độ. Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết gần 50 % tế bào ung
thư phổi NCI-H460 và tăng lên gây chết hơn 70 % tế bào NCI-H460 ở nồng
độ 75 µg/ml. Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào hợp chất X1 và X2 cho thấy
chất X1 có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư in vitro tốt hơn X2. Do
đó, chúng tôi bước đầu tìm hiểu cơ chế tác động của X1 thông qua khả năng
cảm ứng apoptosis (Bảng 3.55).
18


Bảng 3.56. Kết quả thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 của chất X2
Nồng độ
(μg/ml)
75
50
40
30
20
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
72,77
74,02
67,47 71,42 3,47
46,88
47,10
44,44 46,14 1,47
44,06
45,36
45,32 44,91 0,74
17,33
22,97
19,65 19,98 2,83
9,41
1,05
-1,50
2,98
5,71
49,92
48,78
52,08 50,26 1,68

3.1.18. Kết quả apoptosis của hợp chất X1: Tiến hành tìm hiểu cơ chế
tác động của X1 thông qua khả năng cảm ứng apoptosis bằng các thử nghiệm
DNA phân mảnh, kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB,
và caspase-3 trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460.
3.1.18.1. Kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh
Hiện tượng DNA phân mảnh được coi là “dấu ấn” của quá trình
apoptosis. Chúng tôi tiến hành xử lý tế bào NCI-H460 với X1 ở nồng độ 100
µg/ml trong 48 và 69 giờ (Hình 3.20).
Kết quả cho thấy hiện tượng DNA phân mảnh xuất hiện rõ ràng ở quần
thể tế bào NCI-H460 được xử lý với X1 ở nồng độ 100 µg/ml trong 48 và 69
giờ (giếng 1 và 3), trong khi đó không quan sát thấy hiện tượng này ở mẫu tế
bào NCI-H460 đối chứng (không xử lý, giếng 2). Điều này chứng tỏ X1 đã
cảm ứng quá trình apoptosis trên tế bào ung thư phổi NCI-H460 ở các điều
kiện khảo sát.
Hình 3.20. Kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh; M:
thang chuẩn 100 bp
1. Tế bào NCI-H460 được xử lý với X1 ở nồng độ 100
µg/ml trong 48 giờ
2. Tế bào NCI-H460 đối chứng (không xử lý)
3. Tế bào NCI-H460 được xử lý với X1 ở nồng độ 100
µg/ml trong 69 giờ

3.1.18.2. Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép
AO/EB
Chúng tôi tiến hành nhuộm các tế bào NCI-H460 đối chứng (tế bào
không được xử lý) và tế bào ủ với X1 ở nồng độ 100 µg/ml, trong 36, 48 và
60 giờ với dung dịch nhuộm AO:EB.
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy sự thay đổi
trong hình thái của tế bào được ủ với X1 so với tế bào đối chứng. Mẫu tế bào
NCI-H460 được xử lý với chất chuẩn Camptothecin (CPT) ở nồng độ 0,01
µg/ml trong 36 giờ là chứng dương của quy trình (Hình 3.21).
19


Hình 3.21. Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép
AO/EB
3.1.18.3. Thử nghiệm Caspase-3
Chúng tôi tiến hành xử lý tế bào NCI-H460 với X1 ở nồng độ 100 µg/ml
trong 36, 48 và 60 giờ để khảo sát khả năng hoạt hóa caspase-3 của X1 trong
quá trình apoptosis (Biểu đồ 3.15).
Kết quả cho thấy hoạt tính caspase-3 tăng có ý nghĩa thống kê sau 36 giờ
xử lý với X1 ở nồng độ 100 µg/ml, tiếp tục tăng và đạt mức tối ưu ở 48 giờ,
và sau đó giảm mạnh khi thời gian xử lý kéo dài 60 giờ (hình dưới). Mẫu tế
bào NCI-H460 được xử lý với chất chuẩn Camptothecin (CPT) ở nồng độ
0,01 µg/ml trong 36 giờ là chứng dương của quy trình.

Biểu đồ 3.15. Thử nghiệm Caspase-3 của hợp chất X1
Từ các kết quả trên cho thấy X1 có hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào
ung thư thông qua khả năng cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư
phổi NCI-H460 ở điều kiện khảo sát.
3.2. BÀN LUẬN
3.2.1. Sự tương tác giữa cây chủ và vi nấm nội sinh
Giữa vi nấm nội sinh và cây chủ có một mối quan hệ phức tạp, tương tác
cây chủ-vi nấm nội sinh có thể từ mối quan hệ hỗ sinh thông qua hội sinh để
20


ký sinh, tùy thuộc vào khuynh hướng di truyền, giai đoạn phát triển, tình
trạng dinh dưỡng và yếu tố môi trường. Vi nấm nội sinh gián tiếp được
hưởng lợi từ quá trình phát triển của cây chủ bằng cách sinh các chất chuyển
hóa thứ cấp giúp cho cây chủ thích nghi với các tác nhân phi sinh học như
ánh sáng, hạn hán và stress, chẳng hạn như động vật ăn cỏ, côn trùng và giun
tròn tấn công hay các tác nhân gây bệnh. Qua quá trình sàng lọc và phân lập
các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae), chúng tôi
nhận thấy vi nấm nội sinh hiện diện ở hầu hết các bộ phận của cây. Tuy
nhiên các chủng sinh hoạt chất sinh học cao chủ yếu tập trung ở thân và lá.
Các bộ phận dùng được sử dụng được chiết các hoạt chất kháng khuẩn và
kháng nấm của cây như thân rễ, vỏ quả thì ít có sự tồn tại của các chủng vi
nấm nội sinh có hoạt tính cao. Điều này cho thấy ở các bộ phận cây có chứa
tinh dầu có khả năng ức chế sự phát triển cũng như sự sinh hoạt chất sinh
học của vi nấm nội sinh. Nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu
của Schulz và Boyle năm 2005, nhóm tác giả đã đề xuất rằng hiện tượng nội
sinh của vi nấm là một sự đối kháng cân bằng giữa cây chủ và vi nấm nội
sinh.
3.2.2. Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học
Đa số các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)
được phân lập đều có sự hiện diện của vi nấm nội sinh tuy nhiên không phải
toàn bộ vi nấm nội sinh đều có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng
nấm và chống oxy hóa. Trong nghiên cứu này chỉ có 21/146 chủng được
phân lập cho hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và 18/146 chủng có hoạt
tính chống oxy hóa. Định danh được 16/32 chủng vi nấm nội sinh trong đó
có 4 chủng A. terreus có khả năng sinh hoạt chất sinh học cao.
3.2.3. Định danh chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao
Về mặt hình thái học, các chủng A. terreus thể hiện đầy đủ các đặc điểm
của chủng khi nuôi cấy đó là nấm phát triển tương đối nhanh, khuẩn lạc tròn,
dạng bột, mịn như nhung, có màu vàng nâu đến màu nâu sậm ở giữa, vòng
ngoài có màu trắng dần chuyển sang nâu, mặt trái có màu vàng sẫm; cho sắc
tố màu nâu đến nâu đen lan ra môi trường; có xuất hiện giọt tiết ở ngày thứ
10 nuôi cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm không có vách ngăn
không màu, tồn tại bào tử đính bên - một loại bào tử đính hay hạt đính; phần
đỉnh to ra thành bọng hình chùy, bọng mang các thể bình, bào tử đính ngắn,
trơn.; các thể bình song song hoặc hợp thành cụm ở đỉnh bọng, thể bình có
hai tầng; đầu dạng hình tia tỏa tròn phù hợp với khóa phân loại của Raper
KB năm 1965 [61], các tài liệu liên quan [61], [78] và đúng với chủng Bộ
môn đã mô tả. Định danh các chủng A. terreus bằng phương pháp giải trình
tự gen vùng ITS và tra cứu trên BLAST SEARCH cho kết quả tương tự như
21


phương pháp hình thái, góp phần khẳng định các chủng có khả năng sinh
chất có hoạt tính sinh học cao mà đề tài phân lập được chính là A. terreus.
3.2.4. Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao
Qua quá trình sàng lọc và phân lập đã chọn được 4 chủng A. terreus có
khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn và chống oxy hóa khá cao. Tiến hành
khảo sát khả năng phát triển của các chủng trên các môi trường cơ bản như
PDA, SDA, CDA để theo dõi độ ổn định của chủng. Kết quả cho thấy chủng
R – TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn và chống oxy hóa cao. Chọn chủng R –
TN3 để nghiên cứu chuyên sâu vì khả năng sinh hoạt chất sinh học cao và ổn
định.
3.2.5. Điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng A. terreus R-TN3
Kết quả cho thấy khi nuôi cấy trên ba môi trường PDA, SDA và CDA, A.
terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng S. aureus và MRSA tối ưu ở môi trường
PDA. Tương tự ở nguồn khoai tây cũng được xác định là nguồn nitrogen
thích hợp cho việc sinh hoạt chất kháng khuẩn.
Theo Thongwai và Kunopakarn năm 2007, phần lớn vi sinh vật có khả
năng sinh hoạt chất kháng khuẩn ở pH môi trường từ 5,5-8,5. Sự sinh hoạt
chất sinh học tối đa ở pH 6 trên môi trường PDB đã được chỉ ra bởi Jain và
Pudir năm 2011. Cả hai kết luận trên đều phù hợp với nghiên cứu của chúng
tôi: A. terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng S. aureus và MRSA khi được
nuôi trên môi trường PDB ở khoảng pH từ 5-8, mạnh nhất ở pH 6. Kết quả
này cũng tương tự với công bố trước đây của Nishihara và cộng sự năm
2001 với quá trình sinh FR198248, một chất mới kháng virus cúm do A.
terreus sản sinh, thích hợp nhất ở pH từ 6,3-6,4. Trong 23 môi trường thử
nghiệm với các nguồn nitrogen và carbon khác nhau, A. terreus R-TN3 sinh
hoạt chất kháng khuẩn tối ưu khi phát triển ở môi trường có nguồn nitrogen
là khoai tây và nguồn carbon là rỉ đường hoặc saccharose.
Khi phát triển ở các môi trường có nguồn nitrogen khác như dịch đậu
nành, cao thịt, cao nấm men, A. terreus không sinh hoạt chất kháng khuẩn.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Jain P.1 và
Pundir năm 2011 trên một chủng A. terreus phân lập từ đất; tuy nhiên ngược
hoàn toàn với nghiên cứu của Mathan S và cộng sự năm 2013. Ở nghiên cứu
của Mathan S và cộng sự, chủng A. terreus KC 582297 cho sinh khối và chất
kháng khuẩn tối ưu khi phát triển ở môi trường có nguồn nitrogen là cao
nấm men. Ở nghiên cứu của chúng tôi, chủng A. terreus R-TN3 không sinh
hoạt chất kháng khuẩn khi môi trường có nguồn nitrogen là cao nấm men.
Sự khác biệt này có thể liên quan đến yếu tố chủng.
Trên các môi trường có nguồn carbon khác như glucose, saccharose, rỉ
đường và tinh bột tan, A. terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu ở
các môi trường có nguồn carbon là rỉ đường hoặc saccharose. Tinh bột tan
22


và glucose không thích hợp cho quá trình sinh hoạt chất kháng khuẩn của A.
terreus R-TN3. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Mathan S và cộng
sự năm 2013 trên chủng A. terreus KC 582297 (nguồn carbon tối ưu là
saccharose, kém nhất là tinh bột).
Với nguồn nitrogen là khoai tây, nguồn carbon là saccharose hoặc rỉ
đường, mật độ tế bào nấm đầu vào là 104 tế bào/ml, được xác định bằng
quang phổ kế với OD530 nm = 0,1 (1 ml dịch nấm cho 100 ml môi trường). Sử
dụng phần mềm BC Pharsoft đã dự đoán thành phần môi trường tối ưu để A.
terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu là: khoai tây 30 %; Rỉ
đường 3,28 %; Lượng nấm đầu vào: 104 tế bào/ml; Ủ ở điều kiện tĩnh trong
7 ngày. Xác định hiệu quả kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán cho
thấy kết quả thực nghiệm phù hợp với dự đoán của phần mềm.
3.2.6. Chủng A. terreus R-TN3 và các chất có hoạt tính sinh học
Quần thể vi nấm nội sinh thuộc chi Aspergillus đã được phân lập từ nhiều
thực vật và được chứng minh là có khả năng sinh chất có nhiều hoạt tính
sinh học bao gồm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng tế bào ung
thư,... Trong nghiên cứu này A. terreus R-TN3 được phân lập từ thân non
của cây Riềng (Alpinia chinensis Rosc.) và từ các cây khác cho chất có hoạt
tính kháng khuẩn và chống oxy hóa cao. Đặc điểm kháng MRSA và S.
aureus cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu đã công bố, một số chủng
A.terreus phân lập từ đất hoặc từ thực vật cũng cho phổ kháng trên một số vi
khuẩn khác như E. coli, P. aeruginosa, S. faecalis. Nhiều nghiên cứu cũng
đã xác định được nhiều hoạt chất kháng khuẩn, kháng virus như terrein, acid
terreic, terreinol, terremide A, terremid B, +(-) – butyrolacton I, … Điều này
cho thấy tiềm năng nghiên cứu về các hợp chất kháng khuẩn của các chủng
A.terreus là rất đa dạng và cần thiết.
3.2.7. Chiết hoạt chất kháng khuẩn từ A. terreus R-TN3
Hoạt chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy A. terreus phân bố tốt trong
EtOAc. Điều này cho thấy hoạt chất kháng khuẩn từ A. terreus R-TN3 tương
đối phân cực. Ở nghiên cứu của Fernando và cộng sự năm 2004, ba hoạt chất
kháng khuẩn được phân lập từ dịch nuôi cấy của A. terreus là terrein, acid
terreic và terreinol đều tan tốt trong EtOAc. Các hoạt chất kháng khuẩn từ A.
terreus R-TN3 được sinh ngoại bào, vì vậy chiết từ sinh khối nấm với cùng
dung môi không cho tác động kháng khuẩn.
Quá trình tinh sạch dịch chiết thô từ môi trường nuôi cấy A. terreus RTN3 tùy thuộc nhiều vào tính chất lý – hóa của chất có hoạt tính. Cũng theo
Fernando và cộng sự, sự sinh hoạt chất kháng khuẩn ở A. terreus thay đổi
tùy thuộc vào thời gian và thành phần môi trường nuôi cấy. Trong thí
nghiệm của chúng tôi, A. terreus R-TN3 có khả năng sinh hoạt chất kháng
khuẩn tối ưu khi được trên môi trường PDB với đường saccharose 1 %,
23


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×