Tải bản đầy đủ

Khoá luận tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây trứng cua – melochia umbellata

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

PHẠM TH Ị D IỆU LINH

Bước ĐẦU NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CÂY TRỨNG CUA - MELOCHIA

UMBELLATA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: H óa Hữu

HÀ NÔI - 2016

Ctf


TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC


PHẠM TH Ị D IỆU LINH

Bước ĐẦU NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CÂY TRỨNG CUA - MELOCH1A

UMBELLATA

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: H óa Hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN HOÀI NAM

HÀ NỘI - 2016
Ì1

[f


LỜI CẢM ƠN

Khoá luận tốt nghiệp được hoàn thành tại phòng Dược liệu biển -Viện
Hoá sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết om chân thành, em xin cảm om sự giúp đỡ quý báu của
TS. Nguyễn Hoài Nam, đã trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khoá luận
này.
Em xin bày tỏ lòng biết om sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dược
liệu biển, Viện Hoá sinh biển, đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết om tới PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng các
thầy cô giáo trong khoa Hoá học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tận
tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học tại trường.
Trong quá trình thực hiện làm khóa luận này mặc dù đã hết sức cố gắng
nhung chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót . Vì vậy em kính
mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô và bạn bè.
Em xỉn chân thành cảm ơn!

Hà Nội,ngày tháng năm 2016
Sinh viên
Phạm Thị Diệu Linh



LỜ I CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong khoá luận “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây
Trứng cua - Melochm umbelỉaừi” là trung thực, không trùng với các khoá
luận khác.
Sinh viên

Phạm Thị Diệu Linh


M ỤC LỤC
MỞ Đ Ầ U :......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................3
1.1. Tổng quan về cây Trứng cua..................................................................3
1.1.1. Giới thiệu về cây Trứng cua........................................................... 3
1.1.2. Phân bổ............................................................................................3
1.1.3. Thành phần hóa học........................................................................3
1.2. Các phuơng pháp chiết mẫu thực vật.......................................................6
1.2.1. Chọn dung môi chiết........................................................................6
1.2.2. Quá trình chiết.................................................................................8
1.3. Các phuơng pháp sắc kí trong phân lập các họp chất hữu cơ.............. 10
1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc k í..................................... 10
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sẳc kỉ.......................................................11
1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kí.................................................11
1.4. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các họp chất hữu cơ.. 16
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR )............................... 16
1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)..................................... 17
1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy NMR)..................................................................................18
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U........ 21
2.1. Mầu thực vật..........................................................................................21
2.2. Phương pháp phân lập các họp chất.................................................... 21
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC).................................................................. 21
2.2.2. Sắc kỉ lớp mỏng đỉầi ch ế..............................................................22
2.2.3. Sắc kí cột (CC)...............................................................................22


2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các họp chất................. 22
2.3.1. Điểm nóng chảy (M p)................................................................... 22
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS).............................................................. 22
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân........................................................ 23
2.4. Dụng cụ và thiết b ị................................................................................23
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết.......................................................23
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cẩu trúc...........................................23
2.5. Hoáchất.................................................................................................24
CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM.................................................................... 25
3.1. Thu mẫu thực vật và xử lí mẫu.............................................................. 25
3.2.. Phân lập các họp chất............................................................................25
3.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các họp chất..................... 27
3.3.1. Hợp chất MUI: Tiliroside........................................................... 27
3.3.2. Hợp chẩtMU5: cis-3-hexenyl-glucoside...................................... 28
3.3.3. Hợp chất MU8: (6S,9R)-Roseosỉde............................................. 28

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 29
4.1. Xác định cấu trúc hợp chất MU 1 ........................................................ 29
4.2. Xác định cấu trúc hợp chất MU5:....................................................... 36
4.3. Xác định cấu trúc hợp chất MU8.......................................................40
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN............................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 46


D A NH M ỤC CÁC C H Ữ VIẾT TẮT

[oc]d

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13c -n m r

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

^-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional
NMR

cc

Sắc ký cột Column Chromatography

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Specừoscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography


D ANH M ỤC BẢ N G BIỂU H ÌN H VẼ VÀ s ơ ĐỒ

Hình 2.1: Cây Trứng cua -Melochia Umbellata (Houtt.) Stapf...................20
Hình 3.1 .a: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Trứng cua Melochỉa
Umbellata.........................................................................................................25
Hình 3.1 .b: Sơ đồ phân lập các họp chất từ phân đoạn dịch chiết nước mẫu
cây Trứng cua.................................................................................................. 26
Hình 4.1.a. cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của họp chất MUI
..................................................................................................... !....................29
Hình 4.1.b. Phổ *H NMR của họp chất M U I.................................................30
Hình 4.I.C. Phổ 13c NMR của hợp chất M U I................................................. 31
Hình 4.1.d. Phổ HSQC của hợp chất M U I.....................................................33
Hình 4.1.e. Phổ HMBC của họp chất M U I.................................................... 34
Hình 4.1.f. Các tương tác HMBC chính của hợp chất M U I...........................35
Hình 4.2.a. cấu trúc hóa học của hợp chất MU5............................................ 36
Hình 4.2.b. Phổ *H NMR của họp chất MU5................................................. 36
Hình 4.2.C. Phổ 13c NMR của hợp chất MU5................................................. 37
Hình 4.2.d. Phổ HSQC của hợp chất MU5..................................................... 38
Hình 4.2.e. Phổ HMBC của hợp chất MU5.................................................... 39
Hình 4.2.f. Các tương tác HMBC chính của họp chất MU5...........................39
Hình 4.3 .a. cấu trúc hóa học của hợp chất MU8............................................40
Hình 4.3 .b. Phổ *H NMR của họp chất MU8 ................................................. 40
Hình 4.3.C. Phổ 13c NMR của họp chất MU8.................................................41
Hình 4.3.d. Phổ HMBC của hợp chất MU8....................................................43
Hình 4.3.e. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MU8......................... 44
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của họp chất MUI và chất so sánh................... 32
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của họp chất MU5......................................... 37
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của họp chất MU8 và chất so sánh................... 42


M Ở ĐÀU
Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và
ứng dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến
môi sinh. Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại
thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng có ngồn gốc tự nhiên.
Bằng các phương pháp thử hoạt thủi sinh học hiện đại, có kết quả
cao, người ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu
các chất đã tách được từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp
chất có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho việc
phát triển ngành y dược ừong công cuộc chữa bệnh cứu người.
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm cao
(khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong phú với
khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo
dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người.
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ động vật đã
được ứng dụng hiệu quả lưu truyền cho đến ngày nay. Đó là cơ sở rất quan
trọng cho việc phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên.
Tuy nhiên đối với một đất nước còn hạn chế về nguồn vốn và cơ sở vật
chất như Việt Nam thì vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và sử dụng
nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất cho xã hội.
Vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Bước đầu nghiền cứu thành
phần hóa học cây Trứng cua - Melochỉa umbeỉỉata”.
Cây Trứng cua - Melochỉa umbellata thuộc họ Trôm Sterculiaceae là
loại cây phổ biến ở khu vực Bảo Lộc, Lâm Đồng. Tuy nhiên, hiện chưa có

1


nhiều tài liệu công bố về thành phần hoá học cũng nhu ứng dụng duợc lý của
loài này.
Khoá luận này tập trung nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của cành
và lá cây Trứng cua tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực
tìm kiếm thuốc mới, các giải pháp điều trị bệnh.

Nội dung của khoá luận gằm:
1. Phân lập một số hợp chất từ cành và lá cây Trứng cua bằng các phuơng
pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các họp chất đã phân lập được bằng các
phương pháp phổ.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VÈ CÂY TRỨNG CUA
1.1.1. Giới thiệu về cây Trứng cua
. Tên khoa học: Melochia umbellata (Wight.) Stapf. thuộc họ Trôm
Sterculiaceae.
• Tên Việt Nam : Trứng cua
• Mô tả cây:
Cây gỗ nhỏ; cành non có lông dày ừắng. Lá xoan to, dài đến 20 cm, có
lông mịn như nhung ở hai mặt, gân ở đáy 5; cuống dài bằng phiến, lá bẹ to,
cao 1 cm, hình thận, rụng sớm. Lá ở phát hoa hình bánh bò, trăng trắng. Hoa
hường; đài dính thành ống cao 2,5 mm, có lông mịn; cánh hoa cao 8 mm; tiểu
nhụy 5, chỉnh dính thành ống ngắn; noãn sào có lông dày. Nang cao 1 cm, có
5 khía, có lông.

1.1.2. Phân bố
Cây phân bố ở rừng triền núi ở các khu vực: Buôn mê thuột, Cà Ná,
Bảo Lộc...

1.1.3. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu đã được công bố ừên thế giới về các loài thuộc chi
Melochỉa cho thấy sự có mặt của các lớp chất alkaloid [1-7], tritecpen [8] và
flavonoid [9].

3


Scutianine B (I), melonovines A (II) and B (III)

melofoline

Melochicorine

Melosatin D

Cấu trúc hóa học một số họp chất alkaloid phân lập được từ các loài Melochỉa

He

Me

Cấu trúc hóa học các họp chất Tritecpen phân lập được từ các loài Melochỉa
OH

OH

Apỉgenỉn

OH

kaempferol

quercetin

Cấu trúc hóa học các họp chất flavonoit phân lập được từ các loài Melochia
4


Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều công trình khoa học công bố về thành
phàn hóa học của cây Trứng cua - M. umbellata. Tính đến thời điểm hiện tại,
mới chỉ có 03 công trình khoa học được công bố về loài này. Năm 1980,
nhóm tác giả Gunasegaran và cs công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của
một hợp chất ílavonoit là kaempferol-3-ớ-galactoside từ loài này [10].

Kaempferol-3-ơ-galactosỉde

Đến năm 2012, họp chất stigmasterol glycoside là stigmast-5,22-dien3-ơ-P-D-glucopyranoside tiếp tục được công bố từ loài Melochỉa umbellata
(Houtt) Stapf var. degrabrata K [11].

Stỉgmast-5,22-dỉen-3-ơ-p-D-glucopyranosỉde

5


Cleomiscosin A

Gần đây nhất, một hợp chất quinolinone alkaloid là waltherione

c và

một hợp chất coumarinolignan là cleomiscosin A cũng được phân lập từ loài
này. Con đường sinh tổng họp của các họp chất waltherione A-D và các hợp
chất 4-quinolinone phân lập được từ các loài thuộc họ Malvaceae cũng được
các tác giả đề xuất [12].

1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật [13, 14]
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng
chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có
độ phân cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác
nhau.
1.2.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cấn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.

6


Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng
cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn
trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và
tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản
xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy
bằng nhựa.
Methanol và chloroữom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính ừong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlroữom, metylen
clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroữom như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài họp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng
có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp
chất khác. Chloroữom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm
việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroírom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phàn trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chloroữom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các họp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
7


hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình
chiết dưới điều kiện axit hoặc bazo thường được dùng với quá trình phân tách
đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành
những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích họp
cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình
tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30-40°C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hon.
1.2.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
8


- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất ừong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy
để điều chính tốc độ chảy thích họp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Đragendroff và tác nhân Maye.- Các ílavonoid thường là những họp chất
màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết
những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thi nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình
chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
9


aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích càn thiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết họp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

1.3. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các họp chất hữu cơ
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các họp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kỉ
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự
khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa
hai pha: pha động và pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn họp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan...).
Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các
chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của
sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc
do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha
tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh
này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ.
Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua
10


hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm
này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.3.2. Cơ sở cửa phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nông độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuừ:
nM.b.C
n “ l+b.c
n

: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n oo : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp

phụ nào đó.
b

: Hằng số.

c

: Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay
lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
• Theo bản chất của hai pha sử dụng
- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử
lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề
mặt một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong
trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
11


+ Pha động là chất lỏng: Thí dụ ừong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký
lớp mỏng, sắc ký cột.
• Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trinh
phân tách chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất
lỏng này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn
và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,
được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha
tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa
học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các
nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa ừao
đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration
chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên
bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

12


+ sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt
trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị.
Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và
di chuyển sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi
trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật
sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể.
Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như
thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng phân tách được
tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên
phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy
thích hợp.
• Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography).
Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos
+ Pha động: là chất lỏng
Trong sắc ký lớp mỏng:
+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là
loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một
ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đàu trên hở và đàu dưới có
gắn một khóa.
13


+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mầu cần tách được đặt
lên trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đàu cột
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai
nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm
nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lóp mỏng.
1.3.3.1. Sắc kí cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ
là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường
và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể
bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất
hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của
chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng
lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có
kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng
tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất,
với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
ừọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu
tách, tức là phụ thuộc vào hỗn họp chất cụ thể.
Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng
đường đi của dung môi gọi là R f, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau.
Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu
cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách

14


tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác
nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm
chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì
đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với
lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô.
Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô,
sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt
trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng
dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.3.3.2. sẳc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm ứa và định
hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành ừên bản mỏng ừáng sẵn silica
gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu
chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn
15


silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy
sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất càn tách rồi giải
hấp phụ bằng dung môi thích họp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể
phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc
trưng cho từng lóp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các họp chất hữu
cơ [15]
Cấu trúc hoá học các họp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp
phổ kết họp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử
dụng phương pháp phổ cụ thể. cấu trúc càng phức tạp thì yêu càu phối hợp
các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường họp, để xác định chính
xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương
pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so
sánh... [3-5].
1.4.1. Phổ hồng ngoại Ợnfrared Spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử họp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa
vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong họp
chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl
là 3300 - 3450 cm'1, của nhóm cacbonyl c = o trong khoảng 1700 - 1750 cm'1,
của nhóm c = c trong vùng 1630 - 1650 cm 1, của nhóm ete

c - o - c trong

vùng 1020 - 1100 cm'1,... Đặc biệt vùng dưới 700 cm'1được gọi là vùng vân
tay, được sử dụng để nhận dạng các họp chất hữu cơ theo phương pháp so
sánh trực tiếp.
16


Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà
lượng chất càn để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 - 3 mg chất và khó thu
hồi lại. Vì vậy, thường đối với các họp chất thiên nhiên (lượng chất thu được
ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác.
1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phưong pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của
phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các
pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân
mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các họp chất. Hiện nay có rất
nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,
phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là
phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp
hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử
và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị
phá vỡ.
- Phổ FAB-MS (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn
phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do
đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),
cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc
kí kết họp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất
dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất

17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×