Tải bản đầy đủ

thực hành sinh học phân tử

MỤC LỤC

1


BÀI 1
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN ĐẬU NÀNH
I. Mục đích thí nghiệm
1.1 Mục đích
Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao bọc
của tế bào. Điều quan trọng là thu nhận được các phân tử DNA ở trạng thái nguyên
nguyện không bị phân hủy.
Ly trích DNA tổng số từ lá cây đậu nành có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn.
Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu bằng phương pháp RAPD từ đó
ứng dụng trong việc lựa chọn các cây bố mẹ trong lai tạo giống mới.
1.2 Đối tượng: Lá đậu nành.

II. Quy trình
Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào thực vật là như nhau. Tùy từng loại mẫu , tùy từng
mục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các kỹ thuật tách
chiết với các loại hóa chất và dung môi khác nhau.

1. Các phương pháp tách chiết DNA thường dùng gồm:
+Phương pháp CTAB.
+Phương pháp PVP.
+Phương pháp phenol/chloroform
2


+ Phương pháp Silica.
+Phương pháp Guannidine-chloroform
Trong phạm vi bài thực hành ta thực hiện cách tách chiết DNA tổng số từ lá cây
đậu nành theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl ammonium bromide). Nguyên tắc
của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các hóa chất để phá
vỡ màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng trong các ống Ependorp. Đồng thời kết hợp ly
tâm để tách, các hóa chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận
DNA.
2. Quy trình ly trích DNA tổng số
Mục đích: Phân lập được DNA tổng số có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, ít bị đứt
gãy để phục vụ cho các nghiên cứu về di truyền bộ gen của sinh vật.
Quy trình ly trích DNA cụ thể gồm các bước sau:
Bước 1: Mẫu lá đậu nành được lau bằng cồn 70%, gói giấy bạc.

Bước 2: Ngâm mẫu lá cả chối và chày trong nitơ lỏng 10’ để tế bào giòn, dễ vỡ.
Tạo nhiệt độ lạnh làm hạn chế enzyme nuclease hoạt động, đồng thời bảo vệ DNA phóng
thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào. Tế bào thực vật có vách
cellulose khó vỡ hơn tế bào động vật và vi sinh vật.

3


Bước 3: Nghiền lá nhanh tránh mẫu bị hút ẩm trở lại. Trong quá trình nghiền ta
thêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzyme gây biến tính DNA của lá, mẫu
được nghiền cho đến khi thành bột mịn.

Bước 4: Chuyển khoảng 100mg bột mịn vào tube 1.5ml.

Bước 5: Thêm 1ml EB buffer . Trong thành phần của EB có EDTA pH=8 làm
ezyme nuclease hoạt động ít nhất. Enzyme nuclease hoạt động phải có Mg 2+ mà EDTA
có tác dụng gắn ion Mg2+ làm enzyme này hạn chế hoạt động, DNA được bảo vệ. Cho
vào thêm 50 SDS 10% ( trong SDS có bổ sung có tác dụng ngăn cản enzyme polyphenol
oxidase bảo vệ được DNA.

Polyphenol

enzyme polyphenol Oxidase

Quinon (liên kết DNA làm mất DNA).
4


Bước 6: Đem ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút ( để tế bào hoàn toàn bị phá vỡ), khoảng 5
phút đảo nhẹ để trộn đều mẫu.
Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để tủa protein và mảnh vỡ tế bào ta thu
dịch trong.
Bước 8: Chuyển 700 phần trong vào tube mới và thêm 700 isopropanol (isopropanol giúp
tủa DNA).
Bước 9: Tiếp tục đem ủ ở -20oC khoảng 30 phút (có thể ủ đến 2h) bằng khay nước đá để
tủa DNA (Isopropanol tủa lạnh sẽ nhanh hơn).

Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút thu kết tủa .

5


Bước 11:Hòa tan kết tủa trong 400 TE buffer ( làm tan tủa giúp DNA không bị biến tính,
bất hoạt enzyme nuclease . Trong thành phần của TE có Tris và EDTA pH=8 tạo môi
trường kiềm bảo vệ DNA).

Bước 12: Thêm 1enzyme RNAase 10mg/ml ủ ở 37 oC trong 10 phút ( để loại RNA nếu
cần thiết có thể bỏ qua bước này).
Bước 13: Thêm 400 CTAB buffer và ủ ở 65 oC trong 15 phút, đảo ngược tube 5 phút để
trộn mẫu ( thu DNA và loại polysaccharide).
CTAB: Chất tẩy rửa dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào.
Màng tế bào là lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa
tan.
CTAB: có khả năng liên kết thuận nghịch với DNA và polysaccharide
Ở nồng độ muối > 1,4 M phức hợp CTAB-DNA ở trạng thái hòa tan. Phức
hợp CTAB-polysaccharide kết tủa, phức này sẽ được loại đi ở bước ly tâm đầu tiên.
Ở nồng độ muối < 0,7M phức CTAB-DNA kết tủa, sẽ cho phép thu hồi lại
DNA ở bước tủa cồn.
Ở nồng độ muối rất thấp phức CTAB-DNA sẽ tách nhau ra. Phức này sẽ
tách ra gần như hoàn toàn trong bước rửa cồn bằng 70o.

6


Bước 14: Thêm 800 Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1) và lắc trộn đều.
Chloroform không tan trong nước, loại bỏ các tạp chất không mong muốn
trong dung dịch như protein, làm biến tính protein, không hòa tan nucleic acid.
Isoamylalcohol là một ancohol với sự có mặt của cation hóa trị 1 (Na +, K+,
NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA, tạo thành lớp màng ngăn pha.

Bước 15: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Sau khi ly tâm dung dịch chia ra thành 3 lớp: Lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng
có chứa DNA, lớp thứ 2 là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và tất cả
những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…).

7


Bước 16: Chuyển cẩn thận từ từ 500 dung dịch phía trên qua tube 1,5ml mới, thêm 1ml
Ethanol 96% dùng để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme (bước
này không dùng isopropanol được vì isopropanol sẽ tủa luôn muối).

Bước 17: Sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ủ để sự tủa DNA được thực hiện
một cách tốt nhất.

8


Bước 18: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, đổ bỏ phần trong và rửa phần cặn với
400 ethanol 70%, rửa lặp lại 2 lần để loại muối ra khỏi DNA, CTAB và DNA tách ra
hoàn toàn.

Bước 19: Ly tâm lần nữa để loại bỏ ethanol. Phơi khô DNA ở 37 oC trong 15 phút tránh
trường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng tới kết quả.

Bước 20: DNA sau khi phơi khô được hòa tan trong 100 TE buffer,để hòa tan tủa và bảo
vệ được DNA.
Hút ra 30 cho vào một tube mới để trữ lại. Còn 70 còn lại đo OD.
* Giải thích hóa chất
Tris-HCl: nhằm ổn định pH.
EDTA: Có ái lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ
DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca 2+, Mg2+ cạnh
tranh với emzyme làm enzyme không hoạt động.
9


Khi bổ sung CTAB ủ ở 65 oC trong 15 phút, CTAB hoạt động mạnh hiệu quả ở
nhiệt độ khoảng 60-70oC, mạnh hơn khi có ái lực cơ học tác động vào ( CTAB hoạt động
trong trường hợp có NaCl).
+ Chloroform/ Isoamyalcohol bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ Protein và các
thành phần khác không mong muốn.
+ Isoamyalcohol: Hỗ trợ sự phân pha ( 3 pha)
-Pha trên : DNA
-Pha giữa: Protein
-Pha cuối: chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform.
Rửa tủa bằng cồn 70% không sử dụng nước cất để rửa vì DNA bị hòa tan trong
nước không hòa tan trong cồn. Nếu tủa lẫn muối: Muối hòa tan trong cồn 70% , cồn
100% muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì vậy khi rửa tủa bằng cồn xong thì hút hết
cồn và làm bay hơi hết cồn. Nếu còn cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện được
các phản ứng sinh học tiếp theo.
Hòa tan DNA bằng TE 1X có thể hòa tan tủa DNA, rửa tủa bằng TE 1X hiệu quả
hơn có thể bảo quản được lâu, TE bảo quản tốt nhất vì có chứa EDTA ái lực với ion kim
loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme giúp bảo quản được lâu. Hạn
chế của TE là khi có sự có mặt của EDTA ức chế các enzyme các phản ứng sinh học
phân tử sau này. Cho nên sử dụng TE ở nồng độ loãng, nếu không sẽ ức chế các phản
ứng sinh học sau này.
III/ Phân tích DNA ly trích
Đo OD
Đo OD ở bước sóng 260nm và 280nm với hệ số pha loãng 10 lần.
Nhằm kiểm tra chất lượng DNA có tinh sạch chưa, định lượng được nồng độ DNA.
DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,82
OD260nm
1
0,4177
2
0,1584
3
0,0064

OD280nm
1
0,0746
2
0,1078
3
0,3622

OD260/OD280
5,60
1,47
0,018
10


4
0,5024
4
0,1166
Hàm lượng DNA trong mẫu sau khi pha loãng

4,31

[DNA]= Giá trị mật độ quang x 50 x hệ số pha loãng (ng/ml)
*OD260nm
Mẫu 1: [DNA]= 0,4177.50.10=208,85
Mẫu 2: [DNA]= 0,1584.50.10=79,2
Mẫu 3: [DNA]= 0,0064.50.10=3,2
Mẫu 4: [DNA]= 0,5024.50.10=251,2
*OD280nm
Mẫu 1: [DNA]=0,0746.50.10=37,2
Mẫu 2: [DNA]=0,1078.50.10=53,9
Mẫu 3: [DNA]=0,3622.50.10=181,1
Mẫu 4: [DNA]=0,1166.50.10=58,3
Nồng độ DNA thu được khá thấp
Nhận xét:
Mẫu 1: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm >2 nhiễm chloroform.
Mẫu 2: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm <1,8 nhiễm protein.
Mẫu 3: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm < 1,8 nhiễm protein.
Mẫu 4: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm >2 nhiễm chloroform.
Do đó: trong tất cả các mẫu không có mẫu nào chứa DNA tinh sạch.
Nguyên nhân:
11


Mẫu bị nhiễm là do ở giai đoạn mẫu sau khi ly tâm bị tách ra thành 3 lớp, một lớp
dịch trong rồi tới một lớp protein và cuối cùng là lớp có chứa chloroform; sau đó hút
phần dịch trong ở phía trên cho qua một ống tube mới, nhưng trong thao tác này chúng ta
đã để đầu côn chạm đến màng protein hay làm vỡ màng protein nên đã có một lượng
protein nhiễm vào mẫu DNA.
Hay do trong quá trình tủa DNA bằng isopropanol ở -20oC protein cũng tủa theo
làm cho mẫu DNA bị nhiễm protein.
Do quá trình loại bỏ protein, tủa protein không sạch.
Quá trình ly trích DNA không đạt: phá vỡ tế bào, màng nhân không đạt yêu cầu,
tủa DNA không hoàn toàn.
DNA có thể bị biến tính không bảo vệ tốt do thao tác.
Kết quả: Quá trình trích ly DNA không thành công.
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Chuẩn bị hóa chất
Mục đích
Khuếch đại trình từ DNA sau quá trình tách chiết, sử dụng đoạn mồi RADP để kiểm tra
sự đa hình của cây đậu nành (ngoài những băng giống nhau có xuất hiện những băng
khác), kiểm tra cấu trúc, trạng thái của đoạn DNA trong genome
Quy trình
Pha các thành phần để chạy PCR cho 7 nhóm (nhưng phải pha dư một phản ứng so với số
phản ứng cần, vì vậy sẽ pha cho 8 nhóm).
Do có hỗn hợp Mix 2X pha sẵn nên chúng ta chỉ hút Mix, mồi, DNA mẫu.
Thành phần:
Thành phần
Thể tích (8 nhóm)
Mix 1X
12.5 x8= 100
Mồi
1.6 x 8 =12.8
BiH20
8.9 x 8 =71.2
Sau khi pha trộn 3 chất trên vào một tube, trộn đều hỗn hợp trên. Mỗi nhóm hút ra 23 và
2 DNA mẫu của nhóm cho vào một PCR tube để chạy PCR.
12


Cho từng tube vào mỗi các giếng trên máy PCR. Thiết lập chương trình chạy 30 chu kỳ
sau.
Do nhiệt độ gắn mồi của RADP được thiết kế là ở 39,9 oC nên ta chỉnh nhiệt độ bắt mồi
xuống 40oC (chứ không phải ở nhiệt độ 32oC).
Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di
Mục đích điện di
Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng và hàm lượng
DNA. Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic là đại
phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một diện
trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
Kết quả điện di

Nhận xét:
Giếng 3: Tách chiết DNA không thành công, lượng DNA thu được quá ít, bị lẫn tạp
protein, chloroform.
* Nguyên nhân:

13


Lượng DNA quá ít, DNA bị đứt gãy, không nguyên vẹn nên vạch không nhìn thấy
quá mờ.
DNA không tinh sạch bị lẫn tạp protein, chloroform.
*Giải thích:
+ Do thiếu mồi
+Do quá trình thao tác làm mất DNA
+ Không thấy được thang chuẩn để so sánh.
+ Do thời gian kéo dài không lâu mồi bắt cặp không đầy đủ
+ Bước 19: Sau khi tủa để khô DNA màu trắng đục, thêm TE vẫn trắng đục
nhiễm polysaccharide
+ Quá trình ly trích DNA không tốt: DNA bị nhiễm Protein, Chloroform,
polysaccharide; quá trình tủa DNA không hoàn toàn.
+ Quá trình phá vỡ tế bào, phá vỡ màng nhân có thể không xảy ra hoàn toàn làm
DNA không được giải phóng.
+ DNA có thể bị biến tính do thao tác, quá trình bảo vệ không tốt trước DNAse.
+ DNA có thể bị đứt gãy trong quá trình ly trích, dẫn đến quá trình PCR tạo ra sản
phẩm ít (có thể bị đứt gãy tại vị trí gắn mồi, vị trí Taq polymerase bám vào, đứt gãy trên
đoạn DNA mục tiêu cần khuếch đại).
Thiếu bước rửa muối bằng cồn 70oC.
Biện pháp khắc phục
Cần nghiên cứu với lượng mẫu lớn hơn.

14


Cẩn thận trong thao tác: hút dịch nổi, hút hóa chất, thực hiện trong điều kiện
lạnh…
Cần loại bỏ tạp chất kỹ, tránh nhiễm protein, chloroform…
Cần có mẫu đối chứng nội.
IV/ Đánh giá đa dạng di truyền bằng RADP
Mục đích
Phân tích đa dạng di truyền để xem mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xa hay gần.
Mối quan hệ xa nhau sẽ tạo ưu thế lai cao hơn từ đó ứng dụng trong việc lựa chọn các
cây bố, mẹ trong lai tạo giống mới.
2B
Nhóm II
2A
Nhóm I

Sơ đồ cây phát sinh loài cho thấy, các giống đậu khảo sát chia thành 2 nhóm với mức
tương đồng gen biến thiên từ 0,69 đến 0,98. Điều này cho thấy các giống đậu có sự đa
dạng cao về mặt di truyền.
Nhóm I gồm giống L18, nhóm II gồm các giống còn lại. Trong đó mức tương đồng gen
giữa nhóm I và nhóm II là 0,69. Điều này cho thấy giữa giống L18 và các giống còn lại
có sự khác biệt tương đối xa.
Nhóm II phân thành 2 nhóm nhỏ. Nhóm 2A gồm 2 giống L14 và MĐ7. Nhóm 2B là 2
giống còn lại

15


Mức độ tương đồng gen giữa nhóm 2A và 2B này khoảng 0,85 đều này chứng tỏ 2 nhánh
này có cùng nguồn gốc, nhưng do sự biến đổi gen cũng như yếu tố môi trường sống
khiến chúng có sự khác biệt.
Trong nhánh 2A có 2 giống L14 và MD97 có mức tương đồng 0,99 chứng tỏ 2 giống
này là cùng một loài. Nhánh 2B gồm giống DBG và LVT có mức tương đồng 0,91, với
mức tương đồng cao chúng có cùng nguồn gốc và có thể chung loài.
Kết luận giống L18 có thể lai với giống DBG và LVT để cho kết quả ưu thế lai cao nhất.
BÀI 2
CHUẨN ĐOÁN BỆNH TRUYỀN NHIỄM TRÊN THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT
I/Chuẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR
1.Giới thiệu
Cây có múi (cam, quýt, chanh, bưởi,...) là nhóm cây ăn quả quan trọng trong sản
xuất nông nghiệp ở nước ta. Tuy nhiên với sự biến đổi khí hậu ở các vùng trồng trọt tạo
điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh phát sinh gây hại trên cây có múi và đặc biệt là bệnh
vàng lá gân xanh. Bệnh lan truyền với tốc độ rất nhanh, gây hại nghiêm trong cho nhiều
vùng trồng cam, quýt làm sản lượng quả bị giảm đi.
Phân tích bằng Blast trên NCBI đã làm rõ nguyên nhân gây bệnh vàng lá Greening
do vi khuẩn Liberobacter asiaticum sống trong mạch dẫn libe của cây, do rầy chổng cánh
(Diaphorina citri) làm vetor lan truyền bệnh, ngoài ra còn lây qua mắt ghép ( trong quá
trình cắt ghép cây). Vi khuẩn gây xáo trộn sinh lý, làm tắt nghẽn quá trình vận chuyển
dinh dưỡng. Do đó làm thiệt hại đến sinh trưởng của cây, đế năng suất, phẩm chất trái.
Vì vậy dựa trên tính cấp thiết đó bệnh vàng lá gân xanh được phát hiện nhanh
bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được tiến hành trên các loại cây có múi.
2.Mục đích
Chuẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh trên cây bưởi.
16


Trích DNA tổng số ( DNA lá bưởi và vi khuẩn gây bệnh). Đo OD kiểm tra độ tinh
sạch và tính được nồng độ DNA. Sử dụng kỹ thuật PCR để khuyếch đại đoạn DNA của
vi khuẩn gây bệnh. Điện di kiểm tra chất lượng, hàm lượng DNA.
II/ Quy trình ly trích DNA tổng số
1. Mục đích
Phân lập DNA tổng số có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, ít bị đứt gãy và
chuẩn đoán được bệnh vàng lá gân xanh trên cây bưởi.
Ly trích DNA tổng số từ thực vật và vi sinh vật gây bệnh (vì vi khuẩn nằm trong lá
nên phải ly trích DNA tổng số).
2. Quy trình ly trích
Bước 1: Mẫu lá đậu nành được lau bằng cồn 70%, gói giấy bạc.

Bước 2: Ngâm mẫu lá cả chối và chày trong nitơ lỏng 10’ để tế bào giòn, dễ vỡ.
Tạo nhiệt độ lạnh làm hạn chế enzyme nuclease hoạt động, đồng thời bảo vệ DNA phóng

17


thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào. Tế bào thực vật có vách
cellulose khó vỡ hơn tế bào động vật và vi sinh vật.

Bước 3: Nghiền lá nhanh tránh mẫu bị hút ẩm trở lại. Trong quá trình nghiền ta
thêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzyme gây biến tính DNA của lá, mẫu
được nghiền cho đến khi thành bột mịn.

Bước 4: Chuyển khoảng 100mg bột mịn vào tube 1,5 ml.

Bước 5: Thêm 1ml EB buffer . Trong thành phần của EB có EDTA pH=8 làm
ezyme nuclease hoạt động ít nhất. Enzyme nuclease hoạt động phải có Mg 2+ mà EDTA
18


có tác dụng gắn ion Mg2+ làm enzyme này hạn chế hoạt động, DNA được bảo vệ. Cho
vào thêm 50 SDS 10% ( trong SDS có bổ sung có tác dụng ngăn cản enzyme polyphenol
oxidase bảo vệ được DNA
Polyphenol

enzyme polyphenol Oxidase

Quinon (liên kết DNA làm mất

DNA).
Bước 6: Đem ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút ( để tế bào hoàn toàn bị phá vỡ),
khoảng 5 phút đảo nhẹ để trộn đều mẫu.

Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để tủa protein và mảnh vỡ tế bào
ta thu dịch trong.
Bước 8: Chuyển 700 phần trong vào tube mới và thêm 700 isopropanol
(isopropanol giúp tủa DNA).
Bước 9: Tiếp tục đem ủ ở -20 oC khoảng 30 phút (có thể ủ đến 2h) bằng khay nước
đá để tủa DNA (Isopropanol tủa lạnh sẽ nhanh hơn).

19


Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút thu kết tủa .
Bước 11:Hòa tan kết tủa trong 400 TE buffer ( làm tan tủa giúp DNA không bị
biến tính, bất hoạt enzyme nuclease . Trong thành phần của TE có Tris và EDTA pH=8
tạo môi trường kiềm bảo vệ DNA).

Bước 12: Thêm 1enzyme RNAase 10mg/ml ủ ở 37 oC trong 10 phút ( để loại RNA
nếu cần thiết có thể bỏ qua bước này).
Bước 13: Thêm 400 CTAB buffer và ủ ở 65 oC trong 15 phút, đảo ngược tube 5
phút để trộn mẫu ( thu DNA và loại polysaccharide).
CTAB: có khả năng liên kết thuận nghịch với DNA và polysaccharide
Ở nồng độ muối > 1,4 M phức hợp CTAB-DNA ở trạng thái hòa tan. Phức
hợp CTAB-polysaccharide kết tủa, phức này sẽ được loại đi ở bước ly tâm đầu tiên.
Ở nồng độ muối < 0,7M phức CTAB-DNA kết tủa, sẽ cho phép thu hồi lại
DNA ở bước tủa cồn.
Ở nồng độ muối rất thấp phức CTAB-DNA sẽ tách nhau ra. Phức này sẽ
tách ra gần như hoàn toàn trong bước rửa cồn bằng 70o.

20


Bước 14: Thêm 800 Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1) và lắc trộn đều.
Chloroform không tan trong nước, loại bỏ các tạp chất không mong muốn
trong dung dịch như protein, làm biến tính protein, không hòa tan nucleic acid.
Isoamylalcohol là một ancohol với sự có mặt của cation hóa trị 1 (Na +, K+,
NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA, tạo thành lớp màng ngăn pha.

Bước 15: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Sau khi ly tâm dung dịch chia ra thành 3 lớp: Lớp thứ nhất là phần dịch trong ở
trên cùng có chứa DNA, lớp thứ 2 là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và
tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…).

21


Bước 16: Chuyển cẩn thận từ từ 500 dung dịch phía trên qua tube 1,5ml mới, thêm
1ml Ethanol 96% dùng để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme
(bước này không dùng isopropanol được vì isopropanol sẽ tủa luôn muối).

Bước 17: Sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ủ để sự tủa DNA được
thực hiện một cách tốt nhất.

22


Bước 18: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, đổ bỏ phần trong và rửa phần
cặn với 400 ethanol 70%, rửa lặp lại 2 lần để loại muối ra khỏi DNA, CTAB và DNA
tách ra hoàn toàn.

Bước 19: Ly tâm lần nữa để loại bỏ ethanol. Phơi khô DNA ở 37 oC trong 15 phút
tránh trường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng tới kết quả.
Bước 20: DNA sau khi phơi khô được hòa tan trong 100 TE buffer,để hòa tan tủa
và bảo vệ được DNA.
III/ Phân tích DNA ly trích
Đo OD
Đo OD ở bước sóng 260nm và 280nm với hệ số pha loãng 10 lần.
Nhằm kiểm tra chất lượng DNA có tinh sạch chưa, định lượng được nồng độ DNA.
DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,82
OD260nm

OD280nm

OD260/OD280

1
0,1531
1
0,1513
2
0,0645
2
0,0789
Hàm lượng DNA trong mẫu sau khi pha loãng
[DNA]= Giá trị mật độ quang x 50 x hệ số pha loãng (ng/ml)
*OD260nm
23

1,01
0,81


Mẫu 1: [DNA]= 0,1531.50.10=76,55(ng/ml)
Mẫu 2: [DNA]= 0,0645.50.10=32,25(ng/ml)
*OD280nm
Mẫu 1: [DNA]=0,1513.50.10=75,65(ng/ml)
Mẫu 2: [DNA]=0,0789.50.10=39,45(ng/ml)
Nồng độ DNA thu được khá thấp
*Nhận xét:
Mẫu 1: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm >1,8 nhiễm protein.
Mẫu 2: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm <1,8 nhiễm protein.
Do đó: trong tất cả các mẫu không có mẫu nào chứa DNA tinh sạch.
*Nguyên nhân:
Mẫu bị nhiễm là do ở giai đoạn mẫu sau khi ly tâm bị tách ra thành 3 lớp, một lớp
dịch trong rồi tới một lớp protein và cuối cùng là lớp có chứa chloroform; sau đó hút
phần dịch trong ở phía trên cho qua một ống tube mới, nhưng trong thao tác này chúng ta
đã để đầu côn chạm đến màng protein hay làm vỡ màng protein nên đã có một lượng
protein nhiễm vào mẫu DNA.
Hay do trong quá trình tủa DNA bằng isopropanol ở -20oC protein cũng tủa theo
làm cho mẫu DNA bị nhiễm protein.
Do quá trình loại bỏ protein, tủa protein không sạch.
Quá trình ly trích DNA không đạt: phá vỡ tế bào, màng nhân không đạt yêu cầu,
tủa DNA không hoàn toàn.
DNA có thể bị biến tính không bảo vệ tốt do thao tác.
Kết quả: Quá trình trích ly DNA không thành công.

24


3.Phản ứng PCR
a) Mục đích của phản ứng PCR
PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích gen vì nó có khả năng tạo ra một
lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kì cơ thể nào.
Mục đích phản ứng PCR của thí nghiệm nhằm phát hiện nhanh vi sinh vật gây
bệnh trên cây bưởi. Khuếch đại vùng OI của vi khuẩn để chuẩn đoán bệnh vàng lá gân
xanh trên cây bưởi.
b) Chuẩn bị hóa chất
Thành phần của phản ứng PCR
Hóa chất
BiH2O
Buffer 4
MgCl2
DNTPs
IF
IR
Taq
DNA
Tổng

Nồng độ gốc
10X
50Mm
200
100
100
5U
50ng

Thể tích (
34.6
5
4
0.5
0.2
0.2
0.5
5
50

Trình tự mồi:
IF: 5’ CAT CTC AGT TCG GAT TGC ACT CT 3’
IR: 5’ CAC ACC GTC TTC AGG CAAAA 3’

25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×