Tải bản đầy đủ

ứng dụng KTPT trong chọn tạo giống lúa chịu mặn


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG
KHOA KTNN & CNTP
Lớp ĐH CNSHK13

KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

 :TS. Đoàn Thị Ngọc Thanh
 SVTH: Nguyễn Duy Phương
Nguyễn Duy Phương

013142050

Đặng Thị Mỹ Duyên

013142089

Trần Minh Phúc

013142023


Lê Quang Tuân

013142018

Lê Thị Hồng Hiệp 013142035

 
013142049


ĐỀ TÀI

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo
giống lúa Bắc Thơm chịu mặn
Bấm để sửa kiểu văn bản Bản cái
Mức hai

Mức ba

Mức bốn

Mức năm


I.
II.

NỘI DUNG
TỔNG QUAN

1.
2.

Chỉ thị SSR
Giải pháp

QUY TRÌNH CHUNG

1.
2.

3.
4.
5.
6.

Cơ chế hình thành
Cách xác định
Nguyên lý
Hóa chất
Phương pháp
Điều kiện

III. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
IV. QUY TRÌNH BÀI BÁO
1.
2.

Lý do chọn đề tài
Quy trình

V. ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM
VI. KẾT LUẬN


I. TỔNG QUAN
1. Chỉ thị SSR.

a. Lịch sử:
Kể từ khi chỉ thị DNA đầu tiên được phát triển và ứng dụng cho đến cuối những năm 90 của thế kỷ XX, hàng loạt chỉ thị DNA hay còn gọi là chỉ thị phân tử
được ra đời đó là chỉ thị các chuỗi trình tự lặp lại đơn giản.

-

Chỉ thị phân tử SSR được ứng dụng thành công từ 1990 đến nay.
1995: Trong cây lúa, có 185 marker đã được xác định trên 12 NST
1996: dùng để phát hiện gen có ích trong thực vật, sự liên hệ về huyết thống.
1997: Những marker phân tử đã được dùng để xác định và đánh dấu các gen mong muốn.



I. TỔNG QUAN
1. Chỉ thị SSR.
b. Khái niệm:
Microsatellite (hay chỉ thị vi vệ tinh= Simple Sequence
Repeates SSR) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản, thường xảy
ra một cách ngẫu nhiên trong hầu hết genomic trên thực vật, gồm những
đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotid, các kiểu lặp lại ngắn chỉ vài chục lần. Do
đó SSR có thể khuyếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR.
Kỹ thuật chỉ thị phân tử SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên
người và đến nay nó được tìm thấy trong hầu hết các Eukaryota khác.


I. TỔNG QUAN
1. Chỉ thị SSR.
c. Các loại SSR:
SSRs căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide repeat) chúng ta có trinucleotide hay dinucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ
yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA.
Chúng ta có thể phân ra làm 3 loại:



Hoàn hảo không có sự ngắt quãng trong trình tự phối hợp:



Ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại.



Ngắt quãng bị chèn bởi 1 hay nhiều base

CACACACACACA
CACACACAGAGAGA
CACATTCACACATTCATT


I. TỔNG QUAN
2. Giải pháp:

- Chỉ thị phân tử có bản chất: đa hình DNA.
- Phát hiện đoạn SSR liên kết với gen chịu mặn  biết được sự có hay không có gen chịu mặn  nhà chọn giống chủ động trong việc chọn lựa các tổ hợp
lai hiệu quả  chọn tạo giống chống chịu mặn nhanh


II. QUY TRÌNH CHUNG

1. Cơ chế hình thành SSR.
Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên có hai giả thuyết được nhiều người chấp nhận là
do:
a/ Sự bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân.

b/ Sự trượt lỗi trong quá trình sao mã.


II. QUY TRÌNH CHUNG

1. Cơ chế hình thành SSR.

a. Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân:
Cơ chế này giải thích cho những thay đổi lớn hơn trong số lần lặp lại.

Nhiễm sắc thể B có nhiều sự lặp lại, và nhiễm sắc thể A thì có ít sự lặp lại do sự trao đổi chéo.


II. QUY TRÌNH CHUNG

1. Cơ chế hình thành SSR.

b. Sự trượt lỗi trong quá trình sao
mã.
Sự trượt lỗi của enzyme DNA polymerase
trong quá trình sao chép làm tăng hoặc giảm
chiều dài đoạn lặp lại.


II. QUY TRÌNH CHUNG

2. Cách xác định SSR.
1.Cắt nhỏ ADN genome bằng các enzym giới hạn.
2.Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gel agarose 1%, phân tách các đoạn từ 300- 500bp.
3. Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot.
4. Dùng các mẫu dò là các đoạn ADN (tương ứng với trình tự Microsatellite) đã được đánh dấu cho lai ghép với màng lai,
5. So sánh và khôi phục các vạch AND tương ứng với Microsatellite mà chúng ta quan tâm.
6. Chuyển vào một vector giải trình tự
7. Giải trình tự và xác định SSR cũng như trình tự ADN nằm ngoài trình tự SSR, đây là vùng để thiết kế mồi.
8. Tổng hợp mồi và kiểm tra sự đa hình của Microsatellite. Kích thước của các alen chỉ khác nhau từ hai nucleotide trở lên mặt khác trong quá trình tổng hợp PCR,
polymeraza có thể tạo thêm hoặc có thể bỏ sót một đơn vị lặp lại một nucleotide.


II. QUY TRÌNH CHUNG

2. Cách xác định SSR.

Phương pháp nhuộm huỳnh quang và
giải trình tự tự động


II. QUY TRÌNH CHUNG

3. Nguyên lý của SSR MARKER
Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự
rất đặc biệt và giống nhau ở tất cả cá thể trong cùng một loài,

Nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại của đơn vị lặp lại là khác nhau.
Do đó, kích thước sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau giữa các cá thể trong cùng loài.


II. QUY TRÌNH CHUNG

3. Nguyên lý của SSR MARKER


II. QUY TRÌNH CHUNG

4. Hóa chất sử dụng
Tách chiết DNA tổng số:
Đệm chiết EB (Extraction buffer)
+ Tris HCl 1M, pH = 8
+ NaCl 5M
+ Mercaptoethanol
+ EDTA 0,5M, pH = 8
+ Nước cất
Đệm CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide)
+ Tris HCl 1M, pH = 7,5
+ NaCl 5M
+ EDTA 0,5M, pH = 8
+ CTAB 2%

Đệm TE ( Tris EDTA)
+ Tris HCl 1M, pH = 8
+ NaCl 5M
+ EDTA 0,5M, pH = 8
+ Nước cất
Dung dịch SDS
Ethanol 96%
Ethanol 70%
Isopropanol alcohol
Chloroform: isomyl alcohol (24:1)
Rnase


II. QUY TRÌNH CHUNG

4. Hóa chất sử dụng



Phản ứng SSR-PCR

Điện di trên gel polyacrylamide

Thành phần SSR – PCR

Dung dịch acrylamide 4,5%

+ Nước cất

Ethanol 95%

+ Buffer 10X

Dung dịch Sigmacote

+ dNTP

APS 20%

+MgCl

Bind Silane

+ Primer

TEMED (tetramethylethylenediamine)

+Taq- polymerase
+ DNA





Các chỉ thị SSR

Glacial acetic acid 5%
TBE 1X


II. QUY TRÌNH CHUNG

5. Phương pháp:







PCR
Ly trích DNA
Lai phân tử
Điện di
Lai tạo giống mới để quy tụ locus gen chịu mặn

6. Các điều kiện cần có :




Mẫu lấy từ giống lúa thuần mang locus gen Saltol chịu mặn.
Thiết bị chuyên dụng cho phòng sinh học phân tử: máy PCR system 9700, máy đo pH, máy ly tâm, máy điện di,….


III. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Dựa vào sự đa hình của SSR giữa các cá thể trong cùng một loài. Ta áp dụng sự đa hình này để chọn giống lúa chịu mặn trên nền di truyền Bắc Thơm 7


III. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn


Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Tóm tắt quy trình
Quy trình gồm 3 giai đoạn cơ bản:



Giai đoạn 1: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay gen đích để chọn lọc trực tiếp locus hay gen quy định tính trạng mong muốn từ các cá
thể trong quần thể



Giai đoạn 2 (chọn lọc tái tổ hợp): Sử dụng chỉ thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu các locus gen
không mong muốn quang vùng gen đích.



Giai đoạn 3: Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, không liên kết với gen đích trên 12 nhiễm sắc thể để chọn lọc cá thể có nền di truyền lớn nhất của giống
nhận gen. Bằng phương pháp này có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể 3 thậm chí là 4 thế hệ lai lại so với chọn lọc lai lại truyền thống


Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Các bước thực hiện
Bước 1: Lai tạo cây F1. Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và cho locus gen Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR. Xác định các cặp
mồi đa hình phục vụ phân tích di truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly.

Bước 2: Tạo cây BC1 F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể.
Bước 3: Lai tạo và đánh giá kiểu gene các cây BC2 F1. Quy trình chọn giống kết thúc ở đây. Nếu ta chưa chọn được cây BC2 F1 mang gần 100% nền gen
di truyền của cây nhận gen, ta phải tiếp tục bước 4
Bước 4: Lai tạo và đánh giá kiểu gen các cây BC3 F1.
Bước 5: Tự thụ các cá thể BC3F1. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết gene xác định cá thể mang locus gen đích đồng hợp.


Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Các bước thực hiện
Quy trình thực hiện bước 1:
- Xác định SSR.
- Xác định được giống cho gen (Saltol) là giống Fl478 và giống lúa Bắc Thơm 7 ( giống lúa trồng phổ biến ở ĐBSH làm nguồn gen nhận. Thời kỳ cây lúa ra hoa,
tiến hành chọn cây sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh để tiến hành lai.
- Tách chiết DNA tổng số.
- Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết bằng phương pháp điện di trên gel agarose
- Khuyếch đại DNA bằng kỹ thuật SSR-PCR. Thiết kế mồi SSR nằm ở 2 đầu gần kề với đoạn lặp lại.
- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide.
- Xác định được chỉ thị phân tử liên kết Saltol và đa hình giữa các giống lúa.


Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Các bước thực hiện
 BƯỚC 1
Sau khi chạy điện di ta thấy sự đa hình của SSR. Ta dựa vào kết quả chạy điện di có thể xác định được cá thể lai mang gen di hợp, đồng hợp.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×