Tải bản đầy đủ

Ứng dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân tinh bột khoai mì (manihot esculenta crantz)

MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................xi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. xiii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN ...................................................................................... 2

Quá trình thủy phân tinh bột ............................................................................2
Các giai đoạn của quá trình thủy phân ........................................................ 2
Động học quá trình thủy phân tinh bột ....................................................... 7
Amylase .........................................................................................................10
Enzyme  - amylase ..................................................................................11
Enzyme glucoamylase ...............................................................................13
Các hiện tượng xảy ra khi sóng siêu âm tác động vào môi trường lỏng .......15
Ứng dụng sóng siêu âm vào quá trình thủy phân tinh bột............................. 18
Cơ sở khoa học .......................................................................................... 18
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân tinh bột dưới tác động
đồng thời của enzyme và sóng siêu âm .................................................................19

Những kết quả nghiên cứu đã thu được .................................................... 21
Xác định hướng nghiên cứu của đề tài .......................................................... 24
CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25

Nguyên liệu ...................................................................................................25
Chế phẩm enzyme ..................................................................................... 25
Tinh bột khoai mì ...................................................................................... 25
Các hóa chất phân tích ..............................................................................26
Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 26
Phương pháp nghiên cứu thực nghiê ̣m .......................................................... 27
Phương pháp cổ điể n .................................................................................27
Phương pháp quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m ....................................................... 27
Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 28

v


Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng
siêu âm đến giai đoạn hồ hóa ................................................................................28
Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase ...................................29
Phần 3: Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa
enzyme – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa......................... 32
Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả
thủy phân tinh bột khoai mì ................................................................................... 33
Phương pháp phân tích, phương pháp tính toán và thiết bị sử dụng .............35
Phương pháp phân tích ..............................................................................35
Phương pháp tính toán ..............................................................................35
Thiết bị sử dụng......................................................................................... 41
Xử lý số liệu ..................................................................................................42
CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 43

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng
siêu âm đến giai đoạn hồ hóa .................................................................................... 43
Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột khoai mì trong huyền phù ban đầu ..43
Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm ..................................................47
Ảnh hưởng của công suất siêu âm ............................................................ 49

Ảnh hưởng của thời gian siêu âm ............................................................. 51
Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase .......................................53
Phần 2.1: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm enzyme Termamyl
120L 53
Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong
chế phẩm Dextrozyme GA .................................................................................... 74
Phần 3: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa huyền phù tinh
bột khoai mì ...............................................................................................................84
Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột khoai mì trong huyền phù ban đầu ..84
Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm ..................................................87
Ảnh hưởng của công suất siêu âm ............................................................ 90
Ảnh hưởng của thời gian siêu âm ............................................................. 93
Ảnh hưởng đồng thời của nhiê ̣t đô ̣, công suấ t và thời gian siêu âm trong
giai đoa ̣n dịch hóa đế n độ thủy phân tinh bột khoai mì ........................................96

vi


Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả
thủy phân tinh bột khoai mì .....................................................................................100
CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................105

Kết luận........................................................................................................105
Về mặt khoa học......................................................................................105
Về mặt ứng dụng .....................................................................................105
Kiến nghị .....................................................................................................106
CHƯƠNG 5

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................107

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Đường cong mô tả giai đoạn hồ hóa tinh bột khoai mì của một số giống
khoai mì trồng tại Brazil ..................................................................................................3
Hình 1.2. Phân loại enzyme amylase dựa vào vị trí và cơ chế xúc tác ......................... 11
Hình 1.3. Cấu trúc của α-amylase .................................................................................12
Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thủy phân nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn
Bacillus. ......................................................................................................................... 13
Hình 1.5 Mô phỏng cấu trúc của glucoamylase từ Aspergillus niger. .......................... 14
Hình 1.6 Cơ chế thủy phân liên kế t glycoside của glucoamylase .................................14
Hình 1.7 Sự hình thành, phát triển của bong bóng trong lòng chất lỏng dưới tác dụng
của sóng siêu âm. ...........................................................................................................16
Hình 2.1 Phương pháp xác định vmax và Km dựa vào phương trình Linewearver và
Burk ............................................................................................................................... 36
Hình 2.2 Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa Ea theo phương pháp của
Arrhenius ....................................................................................................................... 37
Hình 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu đến độ nhớt ở
65oC, nồng độ tinh bột hòa tan và độ hòa tan tinh bột sau 60 phút hồ hóa ................... 43
Hình 3.2 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) hạt tinh bột khoai mì trong
giai đoạn hồ hóa .............................................................................................................44
Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu đến kích thước
hạt tinh bột sau xử lý siêu âm ........................................................................................ 45
Hình 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù đến độ hòa tan tinh bột
tại thời điểm cân bằng ...................................................................................................46
Hình 3.5 Sự thay đổi độ nhớt của huyền phù tinh bột khoai mì 20% theo nhiệt độ .....47
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ hòa tan tinh bột sau 60 phút
hồ hóa của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng ...................................................................48
Hình 3.7 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến kích thước hạt tinh bột sau quá trình
xử lý và độ hòa tan tinh bột ........................................................................................... 49
Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột ............................. 51
Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến sự gia tăng độ hòa tan tinh bột của mẫu
siêu âm so với mẫu đối chứng và kích thước trung bình của hạt tinh bột sau siêu âm .52
Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm
Termamyl 120L .............................................................................................................53
Hình 3.11 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm
Termamyl 120L .............................................................................................................55
Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm
Termamyl 120L .............................................................................................................56
Hình 3.13 Mối tương quan giữa hoạt độ α - amylase xác định bằng thực nghiệm và
theo phương trình hồi quy ............................................................................................. 58
viii


Hình 3.14 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác
giữa chúng đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L ...........59
Hình 3.15 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ α- amylase khi thay đổi đồng thời công suất và
thời gian siêu âm............................................................................................................60
Hình 3.16 Phổ UV – VIS của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng .61
Hình 3.17 Kết quả điện di của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng 62
Hình 3.18 Phổ 1H-NMR của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng ...63
Hình 3.19 Phổ IR của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng .............63
Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α- amylase của mẫu siêu âm và mẫu đối
chứng ............................................................................................................................. 65
Hình 3.21 Ảnh hưởng của pH đến các thông số động học của chế phẩm enzyme
Termamyl 120L .............................................................................................................66
Hình 3.22 Giản đồ Dixon và Webb để xác định hằng số phân ly pKa1, pKa2 của mẫu
siêu âm và mẫu đối chứng ............................................................................................. 67
Hình 3.23 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ α- amylase của mẫu siêu âm
và mẫu đối chứng ..........................................................................................................68
Hình 3.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến các thông số động học của chế phẩm
enzyme Termamyl 120L................................................................................................ 69
Hình 3.25. Biến đổi hoạt độ α – amylase của mẫu siêu âm (SA) và mẫu đối chứng
(ĐC) theo thời gian ........................................................................................................72
Hình 3.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm
Dextrozyme GA .............................................................................................................75
Hình 3.27 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế
phẩm Dextrozyme GA ...................................................................................................75
Hình 3.28 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm
Dextrozyme GA .............................................................................................................76
Hình 3.29 Mối tương quan giữa hoạt độ glucoamylase xác định bằng thực nghiệm và
theo phương trình hồi quy ............................................................................................. 78
Hình 3.30 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác
giữa ba thông số này đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm Dextrozyme GA .....79
Hình 3.31 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ glucoamylase khi thay đổi đồng thời nhiệt độ,
công suất và thời gian siêu âm....................................................................................... 81
Hình 3.32 Kết quả điện di của mẫu chế phẩm Dextrozyme GA siêu âm và đối chứng 82
Hình 3.33 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của mẫu siêu âm và mẫu đối
chứng ............................................................................................................................. 83
Hình 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ glucoamylase của mẫu siêu
âm và mẫu đối chứng.....................................................................................................83
Hình 3.35 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột ban đầu đến nồng độ đường khử và độ
thủy phân tinh bột sau 80 phút dịch hóa ........................................................................85

ix


Hình 3.36 Hình chụp hạt tinh bột của mẫu đối chứng và mẫu siêu âm trong giai đoạn
dịch hóa dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) ............................................................. 86
Hình 3.37 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù đến độ thủy phân tinh
bột tại thời điểm cân bằng ............................................................................................. 87
Hình 3.38 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ thủy phân tinh bột sau 80
phút dịch hóa của mẫu siêu âm so với mẫu đối chứng ..................................................88
Hình 3.39 So sánh giản đồ phân bố kích thước hạt giữa mẫu siêu âm và mẫu đối chứng
tại các nhiệt độ siêu âm khác nhau ................................................................................89
Hình 3.40 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến độ thủy phân tinh bột tại thời điểm cân
bằng của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng ......................................................................90
Hình 3.41 So sánh giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu xử lý siêu âm ở các
công suất khác nhau .......................................................................................................91
Hình 3.42 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến độ thủy phân tinh bột sau 80 phút
dịch hóa.......................................................................................................................... 92
Hình 3.43 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến độ thủy phân tinh bột sau 80 phút
dịch hóa và tại thời điểm cân bằng của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng ...................... 93
Hình 3.44 So sánh giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu xử lý siêu âm ở các
thời gian khác nhau........................................................................................................95
Hình 3.45 Mối tương quan giữa độ thủy phân tinh bột được xác định bằng thực
nghiệm và theo phương trình hồi quy ...........................................................................97
Hình 3.46 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác
giữa chúng đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm enzyme Dextrozyme GA........98
Hình 3.47 Bề mặt đáp ứng của độ thủy phân sau 80 phút dịch hóa khi thay đổi đồng
thời nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm ................................................................ 99
Hình 3.48 Sự thay đổi độ thủy phân tinh bột khoai mì theo thời gian ........................101
Hình 3.49 Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm Termamyl 120L đã qua xử lý siêu âm
đến độ thủy phân tinh bột khi kết thúc giai đoạn dịch hóa ..........................................104

x


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân tinh bột khoai mì bằng
enzyme ........................................................................................................................... 10
Bảng 1.2. Một số tính chất của các α-amylase từ chủng vi khuẩn Bacillus ..................13
Bảng 1.3. Một số tính chất của glucoamylase từ nấm mốc ...........................................15
Bảng 1.4 Ứng dụng sóng siêu âm trong giai đoạn hồ hóa tinh bột ............................... 23
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiê ̣m khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình xử lý
siêu âm đế n hàm lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hồ hóa...................................28
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiê ̣m theo phương pháp cổ điển về ảnh hưởng của các yếu tố xử
lý siêu âm đế n hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme thương mại ............................. 29
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiê ̣m khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố quá trình siêu âm đế n
độ thủy phân tinh bột trong giai đoạn dịch hóa ............................................................. 33
Bảng 3.1 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kế t quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng
đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong
chế phẩm Termamyl 120L............................................................................................. 57
Bảng 3.2 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất
và thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L
theo biến mã hóa ............................................................................................................58
Bảng 3.3 Hàm lượng protein hòa tan của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và
đối chứng ....................................................................................................................... 61
Bảng 3.4 Biến đổi cấu trúc bậc hai của chế phẩm enzyme trước và sau siêu âm .........64
Bảng 3.5 Các thông số nhiệt động của phản ứng thủy phân tinh bột với xúc tác là mẫu
enzyme siêu âm và mẫu enzyme đối chứng ..................................................................71
Bảng 3.6 Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme kin và thời gian bán hủy t1/2 của mẫu siêu âm
và mẫu đối chứng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau ....................................................... 73
Bảng 3.7 Các thông số nhiệt động của quá trình vô hoạt enzyme của mẫu siêu âm và
mẫu đối chứng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. ........................................................... 73
Bảng 3.8 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kế t quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng
đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của
chế phẩm Dextrozyme GA ............................................................................................ 77
Bảng 3.9 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất
và thời gian siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm enzyme Dextrozyme
GA theo biến mã hóa .....................................................................................................78
Bảng 3.10 Hàm lượng protein hòa tan của mẫu chế phẩm Dextrozyme GA siêu âm và
đối chứng ....................................................................................................................... 81
Bảng 3.11 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kế t quả ................................................96
Bảng 3.12 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công
suất và thời gian siêu âm đến ΔRS sau 80 phút dịch hóa theo biến mã hóa .................97

xi


Bảng 3.13. Năng lượng siêu âm cần sử dụng để tăng hoạt độ chế phẩm amylase và xử
lý huyền phù tinh bột ...................................................................................................103
Bảng 3.14. Năng lượng siêu âm cần sử dụng tính cho 100g tinh bột .........................103

xii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DE Chỉ số đương lượng dextrose (Dextrose equivalent).
DH Độ thủy phân (degree of hydrolysis)
DNS 3,5- dinitrosalisylic acid
DP Mức độ polymer hóa của phân tử tinh bột (Degree of Polymerization)
DSC thiết bị đo nhiệt lượng (differential scanning calorimetry)
DSOL Độ hòa tan tinh bột (degree of solubilization)
ĐC Đối chứng
E
Enzyme
E – S Phức “cơ chất – enzyme”
E – P Phức “sản phẩm – enzyme”
HĐα Hoạt độ α - amylase
HĐG Hoạt độ glucoamylase
HSAX Độ chênh lệch tính chất X của mẫu siêu âm so với mẫu đối chứng
P
Sản phẩm
QT Quá trình
RVA thiết bị đo nhanh độ nhớt (rapid visco analyzer)
S
Cơ chất
SA Siêu âm
SEM Kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscopy)
SP
Độ trương nở của hạt (swelling power)
Tpaste Nhiệt độ bắt đầu hồ hóa
Tpeak Nhiệt độ khi độ nhớt của hỗn hợp bột – nước trong giai đoạn hồ hóa đạt cực đại
ηpeak Độ nhớt cực đại của hỗn hợp bột – nước trong giai đoạn hồ hóa

xiii


MỞ ĐẦU
Quá trình thủy phân tinh bột được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm
và công nghiệp lên men. Hiệu suất thủy phân tinh bột phụ thuộc chủ yếu vào giai đoạn
phá vỡ hạt tinh bột để giải phóng các phân tử amylose và amylopectin, nhờ đó enzyme
tiếp xúc được với cơ chất để chuyển hóa tinh bột thành đường. Hiện nay, các nhà sản
xuất ở trong và ngoài nước đều sử dụng nhiệt kết hợp với chế phẩm α – amylase để phá
vỡ hạt tinh bột. Phương pháp này có nhược điểm là cần sử dụng chế phẩm enzyme với
hàm lượng cao và thời gian xử lý dài [1].
Trong mười năm gần đây, nhiều giải pháp công nghệ mới đã được nghiên cứu
nhằm giảm lượng chế phẩm enzyme cần dùng và rút ngắn thời gian thủy phân, từ đó
làm tăng hiệu quả kinh tế của quy trình sản xuất. Trong số đó, sử dụng sóng siêu âm để
hỗ trợ quá trình thủy phân tinh bột bước đầu mang lại một số kết quả tích cực [1], [2].
Những nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu tại Trung Quốc và Thái Lan. Đến nay,
chưa có công bố khoa học về sử dụng sóng siêu âm trong quá trình thủy phân tinh bột
tại Việt Nam.
Hiện nay ở nước ta, tinh bột khoai mì (tinh bột sắn - Manihot esculenta crantz.) có
giá thành rẻ, phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong quá trình thủy phân để sản xuất
dextrin, maltodextrin, maltose và glucose [3]. Quá trình thủy phân tinh bột có thể dài
đến hàng chục giờ, lượng enzyme sử dụng nhiều và hiệu suất thủy phân chưa cao [4].
Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên, chúng tôi thực hiê ̣n đề tài “Ứng dụng
sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân tinh bột khoai mì (Manihot
esculenta crantz.)”
Mu ̣c đích nghiên cứu là nâng cao hiệu quả của quá trình thủy phân tinh bột khoai
mì bằng giải pháp sử dụng sóng siêu âm để rút ngắ n thời gian thủy phân hoặc tiết kiệm
lượng enzyme sử dụng.

-1-


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

Quá trình thủy phân tinh bột
Về bản chất, quá trình thủy phân tinh bột là quá trình phân cắt mạch phân tử tinh
bột có sự tham gia của nước. Xúc tác được sử dụng phổ biến hiện nay là các enzyme
amylase. Quá trình thủy phân tinh bột thường được chia thành ba giai đoạn: hồ hóa, dịch
hóa và đường hóa [5].
Các giai đoạn của quá trình thủy phân
1.1.1.1 Giai đoạn hồ hóa
Khi gia nhiệt huyền phù tinh bột trong nước, các phân tử nước sẽ khuếch tán vào
bên trong hạt tinh bột khiến cho hạt trương nở. Sự hình thành liên kết hydro giữa các
phân tử tinh bột ở bên trong hạt với phân tử nước sẽ làm yếu đi liên kết giữa các phân
tử tinh bột với nhau. Vùng cấu trúc tinh thể của hạt tinh bột chuyển dần thành vô định
hình. Sự biến đổi cấu trúc này là bất thuận nghịch. Tiếp theo, các phân tử amylose và
amylopectin mạch ngắn sẽ khuếch tán ra bên ngoài hạt tinh bột. Một số hạt tinh bột bị
vỡ ra và không còn hình dạng nhất định. Các phân tử nước sẽ bao quanh phân tử amylose
và amylopectin được giải phóng ra từ hạt tinh bột để tạo thành micell “nước – tinh bột”.
Các phân tử tinh bột này được gọi là tinh bột hòa tan (soluble starch). Giai đoạn này
được gọi là hồ hóa (gelatinization) [6]. Hồ hóa làm chín tinh bột, tăng khả năng tiêu hóa
[7]. Trong quá trình thủy phân tinh bột với xúc tác enzyme, giai đoạn hồ hóa sẽ giải
phóng một số phân tử tinh bột ra khỏi hạt tinh bột ban đầu và làm tăng khả năng tiếp
xúc giữa enzyme và cơ chất [8].
Trong khoa học, có nhiều phương pháp để nghiên cứu giai đoạn hồ hóa như xác
định mức độ hút nước - trương nở của hạt tinh bột bằng cách tính chênh lệch khối lượng
của hạt tinh bột trước và sau giai đoạn hồ hóa [9], [10], [11]; xác định mức độ gia tăng
lượng tinh bột hòa tan bằng các phương pháp so màu phức iod - tinh bột [11], [12]; xác
định sự biến đổi độ nhớt của hỗn hợp theo thời gian hồ hóa bằng thiết bị đo nhanh độ
nhớt (rapid visco analyzer – RVA) [6]; quan sát biến đổi cấu trúc hạt bằng kính hiển vi
phân cực (polarization microscope) [13], [14] hay bằng kính hiển vi điện tử quét
(scanning electron microscopy - SEM) [15]; xác định lượng nhiệt huyền phù tinh bột
-2-


hấp thu trong giai đoạn hồ hóa bằng thiết bị đo nhiệt lượng (differential scanning
calorimetry – DSC [16]); xác định sự biến đổi vùng cấu trúc tinh thể thành vô định hình
bằng cách phân tích hình ảnh nhiễu xạ khi chụp X quang, tán xạ ánh sáng, phổ cộng
hưởng từ hạt nhân NMR [16], [17]. Trong sản xuất công nghiệp, các biến đổi của giai
đoạn hồ hóa thường được quan tâm là mức độ hút nước - trương nở của hạt, mức độ gia
tăng hàm lượng tinh bột hòa tan, biến đổi về độ nhớt và năng lượng cần tiêu thụ [6],
[16], [18], [19].
Dựa vào biến đổi độ nhớt, giai đoạn hồ hóa được xem là bắt đầu khi độ nhớt của
huyền phù tăng vọt. Nhiệt độ tại thời điểm đó được gọi là nhiệt độ bắt đầu hồ hóa
(Pasting Temperature - Tpaste hay To). Nhiệt độ tại thời điểm độ nhớt đạt cực đại (ηpeak)
gọi là nhiệt độ đạt đỉnh nhớt (Peak temperature - Tpeak). Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ vượt
quá giá trị nhiệt độ đạt đỉnh nhớt, độ nhớt của hỗn hợp sẽ giảm. Khoảng nhiệt độ từ Tpaste
đến Tpeak được gọi là khoảng nhiệt độ hồ hóa (Hình 1.1a) [6]. Khoảng nhiệt độ hồ hóa
của các loại tinh bột có nguồn gốc khác nhau sẽ khác nhau. Đó là do sự khác nhau về
cấu trúc hạt của loại tinh bột. Dựa vào sự biến đổi độ nhớt, khoảng nhiệt độ hồ hóa của
tinh bột khoai mì thường là 57 – 770C [20], [21], [22].

Hình 1.1. Đường cong mô tả giai đoạn hồ hóa tinh bột khoai mì của một số giống
khoai mì trồng tại Brazil
(a) Giản đồ thay đổi độ nhớt theo thời gian
(b) Đường cong hấp thu năng lượng nhiệt [23]

Dựa vào đường cong mô tả năng lượng nhiệt hấp thu, có ba điểm uốn ứng với ba
giá trị nhiệt độ được quan tâm nhiều nhất là Tonset, Tpeak và Tend. Nhiệt độ tương ứng với
thời điểm độ hấp thu nhiệt của hỗn hợp bắt đầu tăng mạnh là nhiệt độ bắt đầu hồ hóa
Tonset. Giá trị nhiệt độ tại đó hỗn hợp hấp thu năng lượng nhiệt nhiều nhất thì được gọi

-3-


là Tpeak. Giá trị nhiệt độ tương ứng với thời điểm đường hấp thu năng lượng nhiệt bắt
đầu ổn định được gọi là Tend. Khi đó, giai đoạn hồ hóa được xem là kết thúc. Khoảng
nhiệt độ từ Tonset đến Tend gọi là khoảng nhiệt độ hồ hóa (Hình 1.1b) [16], [24]. Tonset của
tinh bột khoai mì dao động trong khoảng 50,0 – 66,70C, Tpeak dao động trong khoảng
60 – 70,50C và Tend dao động trong khoảng 69,0 – 82,70C [21], [22], [25], [26], [27].
Để biểu diễn mức độ hồ hóa, hai thông số thường được sử dụng là độ trương nở
(swelling power – SP) và độ hòa tan tinh bột (degree of solubilization – DSOL) của hạt
tinh bột. Hai thông số này được xác định bằng cách lấy một lượng thể tích mẫu huyền
phù tinh bột trong giai đoạn hồ hóa để phối trộn với nước, sau đó ly tâm thu phần cặn.
Thông số SP được tính theo công thức (1.1). Thông số này càng cao chứng tỏ hạt càng
hút được nhiều nước và trương nở càng lớn. Thông số DSOL được xác định theo công
thức (1.2). Thông số này càng lớn thì mức độ phân rã hạt tinh bột để giải phóng các phân
tử tinh bột ra ngoài hạt sẽ càng cao [9], [10], [11]. Đối với tinh bột khoai mì, trong
khoảng nhiệt độ hồ hóa 65 – 85oC, giá trị SP là 40 – 60 g/g [28] và DSOL là 0,13 –
0,24g/g [29].
𝑆𝑃 =

𝑚2
𝑚1

𝐷𝑆𝑂𝐿 =
Với

(1.1)

𝑚3
𝑚1

(1.2)

m1 là lượng chất khô của tinh bột trong mẫu huyền phù ban đầu [g]
m2 là lượng tinh bột ướt thu được sau khi ly tâm (phần cặn) của VmL mẫu trong
giai đoạn hồ hóa [g]
m3 là lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hồ hóa huyền phù [g]

1.1.1.2 Giai đoạn dịch hóa
Sau giai đoạn hồ hóa, nếu bổ sung α – amylase vào huyền phù tinh bột, độ nhớt
của hỗn hợp giảm nhanh, giai đoạn này được gọi là dịch hóa (liquefaction). Khi đó, các
phân tử tinh bột hòa tan bị thủy phân, cắt ngắn mạch dưới tác dụng của α-amylase.
Enzyme α – amylase là endo-enzyme có khả năng thủy phân liên kết α- 1,4 glycoside
tại vị trí giữa mạch phân tử amylose và amylopectin [30]. Nếu bổ sung α – amylase chịu
nhiệt vào huyền phù từ đầu quá trình thủy phân, giai đoạn hồ hóa và dịch hóa xảy ra

-4-


đồng thời và được gọi chung là dịch hóa. Khi đó, quá trình thủy phân dưới xúc tác của
hệ enzyme amylase chỉ được chia thành hai giai đoạn dịch hóa và đường hóa [8].
Trong công nghiệp, dịch hóa tinh bột được sử dụng để sản xuất dextrin,
maltodextrin và là giai đoạn đầu của đường hóa để sản xuất maltose, glucose [8].
Để nghiên cứu giai đoạn dịch hóa tinh bột, các nhà khoa học có thể dựa vào mức
độ giảm hàm lượng tinh bột hòa tan, mức độ giảm chiều dài mạch phân tử tinh bột hay
mức độ tăng hàm lượng “đường khử” trong dung dịch phản ứng. Hàm lượng tinh bột
hòa tan được xác định bằng các phương pháp so màu phức iod - tinh bột [31], [32].
Chiều dài mạch phân tử tinh bột – chỉ số DP (Degree of Polymerization) được xác định
bằng các phương pháp sắc ký, phổ biến nhất là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [33], [34].
Hàm lượng “đường khử” trong hỗn hợp thủy phân tinh bột được xác định dựa vào phản
ứng giữa nhóm khử-CHO của “đường khử” với các chất oxy hóa như Cu2+ [35], hay
3,5- dinitrosalisylic (DNS) [36].
Để biểu diễn mức độ dịch hóa, các nhà khoa học sử dụng một trong ba thông số:
̅̅̅̅̅
độ dài trung bình của mạch dextrin 𝐷𝑃
𝑛 (Number-average Degree of Polymerization)
[37], đương lượng dextrose DE (Dextrose Equivalent) [33] hay độ thủy phân tinh bột
DH (Degree of Hydrolysis) [38], [39]. Hai chỉ số DE và DH có ý nghĩa khoa học và
công thức tính tương tự nhau nhưng khác nhau về đơn vị đo. Chỉ số DH có đơn vị là %,
chỉ số DE không có thứ nguyên.
Độ dài trung bình của mạch maltodextrin là đại lượng cho biết chiều dài trung bình
của các maltodextrin trong hỗn hợp thủy phân. Khi mức độ thủy phân càng nhiều thì giá
̅̅̅̅̅
̅̅̅̅̅
trị 𝐷𝑃
𝑛 càng nhỏ. 𝐷𝑃𝑛 được tính theo phương trình (1.3), trong đó ci và Mi được xác
định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp [40]
̅̅̅̅̅
𝐷𝑃
𝑛 =
Với

∑ 𝑐𝑖
𝑀𝑛
1
=
162 162 ∑(𝑐𝑖 /𝑀𝑖 )

(1.3)

̅̅̅̅
𝐷𝑃𝑛 là độ dài trung bình của mạch dextrin
Mn là phân tử lượng trung bình của dextrin [đvc]
𝑚
𝑐𝑖 = ∑𝑛 𝑖 × 100% là tỷ lệ khối lượng của phân tử dextrin được tạo thành từ i
1 𝑚𝑖

phân tử glucose [%]

-5-


mi là hàm lượng phân tử dextrin được tạo thành từ i phân tử glucose [g]
Mi là phân tử lượng của phân tử dextrin được tạo thành từ i phân tử glucose [đvc]
Đương lượng dextrose hay còn gọi là chỉ số DE là đại lượng chỉ khả năng khử của
các sản phẩm thủy phân trong hỗn hợp so với mẫu chuẩn là đường glucose (dextrose).
Giá trị DE thay đổi từ 0 (tương ứng với mẫu chứa tinh bột không hòa tan) đến 100 (tương
ứng với dung dịch glucose nguyên chất). Chỉ số DE được tính bằng số gram sản phẩm
thủy phân có gốc khử được quy đổi thành D-glucose trong 100g chất khô của sản phẩm
(phương trình 1.4) [41].
𝐷𝐸 =
Với

𝑚4
× 100
𝑚1

(1.4)

m4 là lượng nhóm khử quy đổi thành đường glucose [g]
m1 là lượng tinh bột tính theo chất khô trong huyền phù ban đầu [g]
Độ thủy phân tinh bột DH được định nghĩa là lượng đường khử tạo thành (quy đổi

ra đường glucose) so với lượng nguyên liệu khô ban đầu (Phương trình 1.5). DH thay
đổi từ 0% đến 100%. Quá trình thủy phân càng nhiều thì giá trị DH càng cao, [42].
%𝐷𝐻 =

𝑚4 162
×
× 100%
𝑚1 180

(1.5)

Với 162/180 là hệ số chuyển đổi từ khối lượng đường khử thành khối lượng tinh bột
hòa tan
Khi dịch hóa được sử dụng trong sản xuất maltodextrin hay dextrin, sản phẩm có
chỉ số DE dao động trong khoảng 12 – 40. Nếu dịch hóa là giai đoạn đầu của đường hóa
để sản xuất glucose hoặc maltose thì chỉ số DE khi kết thúc dịch hóa sẽ dao động trong
khoảng 8 – 12 [43].
1.1.1.3 Giai đoạn đường hóa
Giai đoạn đường hóa là giai đoạn cuối của quá trình thủy phân tinh bột. Ngoài αamylase, giai đoạn đường hóa còn sử dụng các exo-enzyme và các enzyme cắt nhánh
như β-amylase (thủy phân liên kết α, 1 – 4 glycoside từ đầu không khử và tạo sản phẩm
là đường maltose), -amylase (thủy phân liên kết α, 1 – 4 và α, 1 – 6 glycoside từ đầu
không khử và tạo sản phẩm là đường glucose), pullulanase (thủy phân liên kết α, 1 – 6
glycoside làm giảm độ phân nhánh của amylopectin). Sản phẩm của giai đoạn này là

-6-


hỗn hợp các loại đường tan, chủ yếu là maltose và glucose. Các sản phẩm thông dụng
trên thị trường gồm: maltose có DE = 40-45, “high maltose” có DE = 50-55, “high
conversion syrup” có DE = 55-70 và “high content of glucose” có DE = 95-97, [43].
Động học quá trình thủy phân tinh bột
1.1.2.1 Động học giai đoạn hồ hóa tinh bột
Phương trình động học mô tả tốc độ hồ hóa theo thời gian có thể dựa vào sự gia
tăng độ nhớt của hỗn hợp (Phương trình 1.6), [44], [45], sự gia tăng nồng độ tinh bột
hòa tan (phương trình 1.7) [44], [46], [47], [48], sự gia tăng enthalpy (Phương trình
1.8) [27], [49] hay sự biến đổi của các tính chất lưu biến của hỗn hợp hồ tinh bột như độ
chắc (Phương trình 1.9) [26], modul đàn hồi (Phương trình 1.10), [50].

Với

x=

μt −μ0
μ∞ −μ0

dx
= k hh (1 − x)
dt
là tỷ số độ nhớt [không thứ nguyên]

(1.6)

μt , μ0 , μ∞ là độ nhớt tại thời điểm đang khảo sát, thời điểm bắt đầu hồ hóa và thời
điểm quá trình hồ hóa đạt cân bằng [cP]
t là thời gian từ lúc bắt đầu hồ hóa đến thời điểm đang khảo sát [phút]
khh là hằng số tốc độ hồ hóa tinh bột [1/phút]
a = 1 − e−khht
Với

a=

m5
m1

(1.7)

là phần khối lượng tinh bột đã được hồ hóa tại thời điểm đang khảo sát

[không thứ nguyên]
m5 là khối lượng tinh bột hòa tan tại tại thời điểm đang khảo sát [g]
m1 là khối lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu [g]

= k hh (1 − α)n
dt
Với

α=

∆Ht
∆H∞

(1.8)

là độ hồ hóa tinh bột tại thời điểm đang khảo sát [không thứ nguyên]

Ht và H là enthalpy hỗn hợp đã hấp thu cho đến thời điểm đang khảo sát và
tại thời điểm hồ hóa hoàn toàn [J]
n là bậc phản ứng giai đoạn hồ hóa [không thứ nguyên]
Ft
ln ( ) = −k hh t
F0

(1.9)

-7-


Với

Với

Ft và F0 là độ chắc của hồ tinh bột tại thời điểm đang khảo sát và tại thời điểm
ban đầu [N]
E∞ − Et
n
= e−khht
(1.10)
E∞ − E0
Et , E0 , E∞ là modul đàn hồi tại thời điểm đang khảo sát, thời điểm bắt đầu hồ hóa
và thời điểm quá trình hồ hóa đạt cân bằng [g.cm]
Giá trị hằng số tốc độ hồ hóa tinh bột (khh) phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng theo

phương trình động học Arrhenius (1.11)
Với

k hh = k o e(−Ea/RT)
T là nhiệt độ phản ứng [oK]
Ea là năng lượng hoạt hóa của giai đoạn hồ hóa [kJ/mol]
R là hằng số khí lý tưởng, R = 8,314J/mol.K
ko là hệ số phản ứng (reaction frequency factor)

(1.11)

Trong thực tế, một số loại tinh bột khi hồ hóa sẽ tăng độ nhớt rất cao, tạo ra hỗn
hợp đặc quánh nên kết quả đo độ nhớt sẽ không chính xác. Để xác định nhiệt năng tiêu
thụ và các tính chất lưu biến của hỗn hợp hồ tinh bột thì cần phải có thiết bị đo chuyên
dụng. Vì vậy, động học của quá trình hồ hóa thường được mô tả theo độ tăng của hàm
lượng tinh bột hòa tan (phương trình 1.7) [46].
1.1.2.2 Động học giai đoạn dịch hóa và đường hóa tinh bột
Có hai cách để mô tả động học quá trình thủy phân tinh bột khi có mặt enzyme xúc
tác: mô tả biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất ban đầu và mô tả biến đổi
nồng độ cơ chất hay sản phẩm theo thời gian phản ứng.
Michaelis và Menten (1913) đã đề nghị mô hình động học mô tả sự tương quan
giữa vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác với nồng độ cơ chất ban đầu. Giai đoạn dịch
hóa và đường hóa tinh bột đều có xúc tác của enzyme nên có thể được mô tả theo phương
trình Michaelis-Menten (1.12) [51].
𝑣𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
(1.12)
𝐾𝑚 + [𝑆]
Với: v và vmax là vận tốc phản ứng và vận tốc phản ứng cực đại [mol/phút]
[S] là nồng độ cơ chất [mol/L]
Km là hằng số phân ly biểu kiến của phức enzyme – cơ chất hay còn gọi là hằng
số Michaelis – Menten [mol/L]
𝑣=

-8-


Khi nồng độ cơ chất ban đầu quá cao thì enzyme bị ức chế. Ví dụ như khi nghiên
cứu quá trình thủy phân tinh bột, Yankov và cộng sự (1986) nhận thấy phương trình
Michaelis - Menten chỉ đúng trong khi hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu nhỏ
hơn hay bằng 250g/L. Khi hàm lượng cơ chất cao hơn 250g/L, vận tốc phản ứng không
còn tuân theo mô hình phương trình Michaelis – Menten, vì vậy cần có các mô hình
khác để mô tả động học phản ứng [52].
Theo Ofoli (1990), sự thay đổi lượng sản phẩm thủy phân theo thời gian được biểu
diễn dưới dạng phương trình (1.13).

P

at
1  bt

(1.13)

Với: P là nồng độ sản phẩm tính theo tinh bột hòa tan hay đường khử tại thời điểm
khảo sát [g/L]
t là thời gian từ lúc bắt đầu bổ sung enzyme đến thời điểm đang khảo sát [phút]
a là hằng số biểu thị vận tốc ban đầu của quá trình thủy phân tinh bột [g/L.phút]
b là hằng số thực nghiệm [1/phút]
Khi thời gian tiến tới vô cùng hay tại thời điểm phản ứng đạt cân bằng thì nồng độ
sản phẩm tiến tới giá trị a/b. Đây là lượng sản phẩm tối đa có thể thu được sau phản ứng
[53].
Theo Marangoni (2002), sự thay đổi lượng của cơ chất và sản phẩm thủy phân theo
thời gian có thể được biểu diễn theo phương trình (1.14) và phương trình (1.15).

Với

(1.14)
∆𝑆𝑡 = ∆𝑆∞ (1 − 𝑒 −𝑘𝑑ℎ𝑡 )
−𝑘
𝑡
𝑑ℎ
)
(1.15)
∆𝑃𝑡 = ∆𝑃∞ (1 − 𝑒
∆St và ∆S là lượng cơ chất giảm đi so với ban đầu tại thời điểm khảo sát và tại
thời điểm vô cùng (Lượng cơ chất tại thời điểm vô cùng được hiểu là lượng cơ
chất còn lại khi phản ứng đạt cân bằng) [g/L]
∆Pt và ∆P là lượng sản phẩm tăng thêm tại thời điểm khảo sát và tại thời điểm
vô cùng (Lượng sản phẩm tại thời điểm vô cùng được hiểu là lượng sản phẩm tạo
ra khi phản ứng đạt cân bằng) [g/L]
kdh là hằng số tốc độ thủy phân (giai đoạn dịch hóa hay giai đoạn đường hóa) tinh
bột [1/phút]
Giá trị hằng số tốc độ dịch hóa hay đường hóa tinh bột (kdh) cũng phụ thuộc vào

nhiệt độ phản ứng theo phương trình động học Arrhenius (1.16)
-9-


𝑘𝑑ℎ = 𝑘𝑜 𝑒 (−𝐸𝑎/𝑅𝑇)
Với

(1.16)

T là nhiệt độ phản ứng [oK]
Ea là năng lượng hoạt hóa của giai đoạn dịch hóa hay đường hóa [kJ/mol]
ko là hệ số phản ứng (reaction frequency factor)
Khi thời gian tiến tới vô cùng hay tại thời điểm phản ứng đạt cân bằng thì St

tiến tới S và Pt tiến tới P, từ đó suy ra được lượng sản phẩm tối đa có thể thu được
sau phản ứng [54].
Khi nghiên cứu về giai đoạn dịch hóa và đường hóa tinh bột, do sản phẩm là
đường khử nên có thể thay P bằng lượng đường khử tăng thêm RS [1], [55], [56],
[57], [58], [59], [60], [61], ΔDH hay ΔDE [62], [63].
Bảng 1.1 giới thiệu kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân tinh bột
khoai mì có sử dụng xúc tác enzyme đã được công bố trong thời gian gần đây
Bảng 1.1 Kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân tinh bột khoai mì bằng
enzyme
STT

Enzyme

1

Giai đoạn hồ hóa,
không sử dụng
enzyme

2

3

Điều kiện thí nghiệm
Hàm lượng tinh bột
60g/kg huyền phù,
không chỉnh pH,
nhiệt thay đổi từ 50oC
lên 95oC

Chế phẩm
STARGEN
TM 001

Hàm lượng tinh bột
250g/L
pH 7,0; T = 100oC

Amylase từ nấm A.
fumigatus KIBGEIB33

Hàm lượng tinh bột
81g/L; pH 6,0;
T = 65oC,

Mô hình động học

Tài liệu tham khảo

𝑑𝛼
= 𝑘ℎℎ (1 − 𝛼)𝑛
𝑑𝑡
Với ln(khh) = 73,8 ± 5,43 và
n = 0,985 ± 0,002

Zhang và cộng sự
(2013) [27]

∆𝑃𝑡 = ∆𝑃∞ (1 − 𝑒 −𝑘𝑑ℎ 𝑡 )
Nitayavardhana và
Với ∆𝑃∞ = 12,2 (g/100g mẫu)
cộng sự (2008) [1]
khh = 0,296 (1/giờ)
Mô hình Michaelis-Menten
với Km = 0,046mg/mL và
vmax = 769U/mg

Pervez và cộng sự
(2014) [64]

Amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này
thuộc nhóm thủy phân, xúc tác phân giải liên kết O – glucoside của các polysaccharide
với sự tham gia của nước (Phương trình 1.17).
(1.17)

- 10 -


Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin
mạch ngắn. Các enzyme amylase có trong nước bọt của một số động vật, trong dịch tiêu
hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn.
Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công
nghiệp, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. Hai nhóm amylase được sử
dụng nhiều nhất là glucoamylase (GA) chiếm 26% và  - amylase chịu nhiệt chiếm 24%
[65].
Việc phân loại các enzyme khác nhau trong hệ amylase có thể dựa vào nguồn gốc,
khả năng chịu nhiệt, vị trí tác động của enzyme trên cơ chất hay cơ chế tác dụng lên tinh
bột. Thông thường các nhà khoa học dựa vào cả cơ chế và vị trí xúc tác để phân loại các
enzyme amylase theo như Hình 1.2 [66], [67].

Hình 1.2. Phân loại enzyme amylase dựa vào vị trí và cơ chế xúc tác
Enzyme  - amylase
Enzyme  - amylase là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α – 1,4 – glucoside
một cách ngẫu nhiên nhưng vị trí liên kết bị thủy phân chủ yếu tập trung ở giữa mạch
amylose và amylopectin nên được gọi là endo – enzyme. Nếu α-amylase thủy phân tinh
bột tạo thành sản phẩm là các đường tự do thì enzyme được xếp vào nhóm “đường hóa”.
Nếu α – amylase thủy phân tinh bột chỉ tạo thành các dextrin thì enzyme được xếp vào
nhóm “dịch hóa”. Sản phẩm thủy phân chung của các α – amylase bao gồm dextrin,
maltose và glucose [68]. Chế phẩm enzyme α – amylase công nghiệp chủ yếu được thu
nhận từ canh trường nấm mốc Aspergillus hay vi khuẩn Bacillus.

- 11 -


Enzyme α-amylase là protein có cấu trúc bậc ba, phân tử lượng thấp, thường nằm
trong khoảng 50.000 đến 60.000 Da. Cấu tạo cơ bản của α - amylase gồm ba domain:
domain A là domain lõi có cấu trúc đặc trưng kết vòng gồm 8 đoạn xoắn α và gấp nếp
β xen kẽ liên tiếp nhau (Helix (α/)8-barrel), được nối với domain C có cấu trúc 8 đoạn
β – sheet song song. Domain B gồm 2 đoạn β – sheet được lồng vào giữa đoạn  - sheet
thứ 3 và α - Helix thứ 3 của domain A. Domain B quyết định hoạt tính enzyme và liên
kết enzyme – cơ chất [69], [70]. Có một ion Ca2+ nối giữa domain A và domain B. Mô
hình chung của α-amylase được trình bày trong Hình 1.3a. Cấu trúc cụ thể của α-amylase
từ Bacillus licheniformis được trình bày trong Hình 1.3b.

Hình 1.3. Cấu trúc của α-amylase
(a) Mô hình cấu trúc α-amylase vi khuẩn (Vị trí của 4 vùng trong cấu trúc không gian được biểu diễn
bằng nét gạch đứt) [71]
(b) Mô hình cấu trúc của α – amylase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis Domain A có màu xanh lá cây,
domain B có màu hồng tím và domain C có màu xanh dương. Ion Calcium và Kali tương ứng được biểu
diễn bởi quả cầu đỏ và cam. Trung tâm hoạt động với Asp231, Glu261 và Asp328 có màu đỏ. Vùng nối
từ L7 đến K7 có màu vàng [71], [72].

Cơ chế xúc tác của α-amylase từ vi khuẩn Bacillus do Nielsen (1999, 2000, 2003)
đưa ra [73], [74], [75], [76] và được trình bày trong Hình 1.4 [73].

- 12 -


Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thủy phân nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn
Bacillus.
(I) Proton hóa nguyên tử O của nhóm glycoside và tấn công vào C1 của gốc glucose bởi D231
(II) Hoạt động của phân tử nước, phân cắt liên kết cộng hóa trị C1-D231
(III) Tái hình thành phân tử cho proton ban đầu

Một số tính chất của α– amylase từ vi khuẩn Bacillus đã được Gupta và công sự
báo cáo tổng hợp vào năm 2003. Các kết quả này được trình bày trong Bảng 1.2 [77].
Bảng 1.2. Một số tính chất của các α-amylase từ chủng vi khuẩn Bacillus
Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp amylase

pH tối ưu

Nhiệt độ tối ưu (°C)

B. brevis HPD 31

6.0

45–55

B. licheniformis CUMC 305

9.0

90

B. licheniformis NCIB 6346

7.0

70–90

B. licheniformis M27

6.5–7.0

85–90

B. stearothermophilus

4.6–5.1

55–70

B. stearothermophilus ATCC 12980

5.0–6.0

70–80

B. stearothermophilus MFF4

5.5–6.0

70–75

B. subtilis 65

6.0

60

Bacillus sp. IMD 434

6.0

65

Bacillus sp. US 100

5.6

82

Bacillus sp. WN 11

5.5

75–80

Bacillus sp. XAL 601

9.0

70

Enzyme glucoamylase
Glucoamylase là enzyme thủy phân carbohydrate và dẫn xuất thành các đơn vi ̣βD-glucose từ đầ u không khử của phân tử cơ chất. Mặc dù cơ chất tự nhiên của
glucoamylase là những hợp chất có liên kết α-1,4 glucoside, glucoamylase cũng có thể
thủy phân các liên kế t α-1,6; α, β- 1,1; α- 1,3 nhưng với tốc độ tương ứng giảm dần [78].
Theo lý thuyết, glucoamylase có thể thủy phân hoàn toàn tinh bô ̣t thành glucose. Ứng
du ̣ng chủ yế u của enzyme này là trong sản xuấ t glucose syrup có hàm lươ ̣ng glucose cao
96-98% [79].

- 13 -


Glucoamylase chủ yếu được thu nhận từ canh trường nấm mốc Aspergillus,
Trichoderma như A. niger [80], A. awamori [81], Trichoderma reesei [82] . Enzyme
glucoamylase là protein có cấu trúc bậc ba, phân tử lương nằm trong khoảng từ 25 – 112
kDa. Các loa ̣i nấ m mố c sinh ra hai loa ̣i glucosamylase là GAI và GAII. GAI chứa 616
amino acid và có ba domain: domain xúc tác (từ acid amin 1 - 470), domain nối (từ 471
– 514), và domain liên kế t với tinh bô ̣t (từ acid amin 515 – 616). GAII chỉ có 514 acid
amin, và chỉ có GAI có khả năng thủy phân ha ̣t tinh bô ̣t thô (Hình 1.5) [83]. Phân tử
lượng của glucoamylase trong khoảng 25 – 112kDa [84].

Hình 1.5 Mô phỏng cấu trúc của glucoamylase từ Aspergillus niger.
Mô hình đươ ̣c sử du ̣ng rô ̣ng raĩ để giải thích cho hoa ̣t đô ̣ng của glucoamylase là
sự hin
̀ h thành ion oxocarbenium, gồ m sự vâ ̣n chuyể n proton đế n O trong liên kế t Oglycosylate từ mô ̣t chấ t xúc tác acid, và mô ̣t sự tấ n công ái nhân của nước bởi mô ̣t xúc
tác kiề m (Hình 1.6) [82].

Hình 1.6 Cơ chế thủy phân liên kế t glycoside của glucoamylase
- 14 -


Một số tính chất của glucoamylase từ vi sinh vật đã được Gupta và công sự báo
cáo tổng hợp vào năm 2003. Các kết quả tổng hợp này được trình bày trong Bảng 1.3
[82], [84].

Bảng 1.3. Một số tính chất của glucoamylase từ nấm mốc
Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp glucoamylase
A. awamori
A. fumigatus
A. niger C
A. oryzae
Aspergillus sp. K-27
A. saitoi
Trichoderma reesei

pH tối ưu
4,5
4,5–5,5
4,5
4,0–4,5
4,0–7,1
4,5
5,5

Nhiệt độ tối ưu (oC)
60
65
40
56
45
50
70

Các hiện tượng xảy ra khi sóng siêu âm tác động vào môi trường lỏng
Sóng siêu âm là tên gọi của sóng có tần số cao hơn tần số sóng âm mà con người
nghe được (Tần số lớn hơn 20 kHz). Giới hạn trên của tần số sóng siêu âm không được
phân định rõ ràng nhưng thường được quy ước là 5MHz trong môi trường không khí và
500MHz trong môi trường chất lỏng [85], [86].
Sóng siêu âm khi truyền qua chất lỏng sẽ làm xuất hiện hiện tượng “xâm thực”
(cavitation), các “vi dòng” (micro-streaming), “vi tia” (microjet), làm gia tăng nhiệt độ
và tạo ra các vùng có áp lực cao [86].
Dưới tác động của sóng siêu âm, các phân tử trong chất lỏng sẽ nhận năng lượng
và truyền chuyển động theo những chu kỳ nén và giãn (Hình 1.7a). Tại thời điểm các
phân tử bị nén, áp lực do sóng siêu âm tạo ra sẽ tăng cao; trong khi đó ở thời điểm giãn,
giá trị áp lực sẽ thấp hơn so với khi không có tác động của sóng siêu âm. Áp lực tại một
điểm trong lòng chất lỏng sẽ biến đổi theo chu kỳ và được miêu tả bằng phương trình
(1.18) và Hình 1.7b [87].
Pt = Ph + Pa = Ph + PA sin 2π ft

(1.18)

Với: Pt là áp suất tổng tại điểm đang xét [Pa]
Ph là áp suất thủy tĩnh tại điểm đang xét [Pa]
Pa là áp suất do sóng siêu âm tạo ra tại thời điểm t [Pa]
PA là biên độ áp suất do sóng siêu âm tạo ra tại điểm đang xét [Pa]
f là tần số của sóng siêu âm [Hz]
t là khoảng thời gian kể từ khi sóng siêu âm tác động vào môi trường đến thời điểm
đang xét [phút]

- 15 -


Trong hỗn hợp chất lỏng, tồn tại trạng thái cân bằng giữa chuyển động nhiệt hỗn
loạn và các lực tĩnh điện của các phân tử dung môi lỏng và chất phân tán (bao gồm cả
chất khí, chất lỏng và chất rắn hòa tan). Tại một vị trí x xác định, trong nửa chu kỳ nén,
giá trị áp lực tăng và khoảng cách trung bình giữa các phân tử bị giảm. Ngươ ̣c la ̣i, trong
nửa chu kỳ giãn, giá trị áp lực giảm và khoảng cách trung bình giữa các phân tử sẽ tăng
lên. Lực liên kết giữa các phân tử sẽ giảm đi khi khoảng cách giữa chúng càng xa. Các
phân tử khí và lỏng chuyển động nhiệt hỗn loạn hơn làm hình thành các bong bóng rất
nhỏ được gọi là các vi bong bóng trong lòng chất lỏng [29], [88].

Hình 1.7 Sự hình thành, phát triển của bong bóng trong lòng chất lỏng dưới tác dụng
của sóng siêu âm.
(a) Đồ thị mô tả dao động của hàm vị trí
(b) Đồ thị mô tả “dao động” của hàm áp suất do sóng siêu âm tạo thành trong lòng chất lỏng
(c) Sự hình thành, phát triển và triệt tiêu của bong bóng
(d) Sự hình thành, phát triển và nổ tung của bong bóng

Vi bong bóng thường không bền. Áp suất tăng sẽ đẩy các phần tử lại gần nhau để
tái tạo các liên kết phân tử, các phân tử khí hay hơi bị đẩy trở về pha lỏng; hệ quả là vi
bong bóng có thể bị triệt tiêu (Hình 1.7c). Tuy nhiên nếu trong chu kỳ nén, áp suất tổng
Pt không đủ lớn để triệt tiêu vi bong bóng thì tại các nửa chu kỳ giãn tiếp theo, vi bong
bóng sẽ dần dần to lên. Một số bong bóng lớn cũng có thể được hình thành do sự kết

- 16 -


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×