Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phân lập các dẫn xuất phenyl glycosit từ cây trứng cua melochia umbellata

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
*********

ĐỖ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC DẪN XUẤT
PHENYL GLYCOSIT TỪ CÂY TRỨNG CUA MELOCHIA UMBELLATA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

HÀ NỘI - 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
*********

ĐỖ THÚY HẰNG


NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC DẪN XUẤT
PHENYL GLYCOSIT TỪ CÂY TRỨNG CUA MELOCHIA UMBELLATA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN XUÂN CƯỜNG

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Dược liệu biển Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của
thầy TS. Nguyễn Xuân Cường đã nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn em trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dược
liệu biển - Viện Hoá sinh biển, đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận tốt nghiệp.
Em xin được bầy tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS.
Nguyễn Văn Bằng cùng toàn thể các thầy cô trong khoa Hóa Học, các thầy
cô giáo trong Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến
thức quý báu cho em trong quá trình học tập tại trường.
Trong quá trình thực hiện làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết
sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy
em kính mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô và bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Đỗ Thúy Hằng


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong
khóa luận: “Nghiên cứu phân lập các dẫn xuất phenyl glycosit từ cây
Trứng cua - Melochia umbellata” dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Xuân
Cường là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác.


Sinh viên

Đỗ Thúy Hằng


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu về cây Trứng cua ............................................................. 3
1.1.2. Phân bố.............................................................................................. 4
1.1.3. Thành phần hóa học .......................................................................... 4
1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật ................................................................ 8
1.2.1. Chọn dung môi chiết ......................................................................... 8
1.2.2. Quá trình chiết ................................................................................ 10
1.3. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ .......................11
1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí ....................................... 12
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí ........................................................ 12
1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kí ................................................... 13
1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ ...17
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) ................................. 17
1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS) ..................................... 18
1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy NMR).................................................................................. 19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 22
2.1. Mẫu thực vật ......................................................................................................22
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................22
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................. 22
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ............................................................... 22
2.2.3. Sắc ký cột (CC) ............................................................................... 22
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất ............................23
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ..................................................................... 23


2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) ............................................................... 23
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) .................................................... 23
2.4. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................23
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ......................................................... 23
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc ............................................. 24
2.5. Hoá chất .............................................................................................................24
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 25
3.1. Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu .......................................................................25
3.2. Phân lập các hợp chất........................................................................................25
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 28
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MU4: Phenethyl alcohol β-Dglucopyranoside ........................................................................................................28
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MU6: Methyl salicylate β-Dglucopyranoside ........................................................................................................32
4.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MU12: Benzyl O-β-D-glucoside .35
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 42


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY

2D-NMR

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
Hình 1.1. Cây Trứng cua ................................................................................... 3
Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu cây Trứng cua............................... 24
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Trứng cua ............................... 25
Hình 4.1.a. Cấu trúc hóa học của hợp chất MU4............................................ 27
Hình 4.1.b. Phổ 1H-NMR của hợp chất MU4 ................................................. 27
Hình 4.1.c. Phổ 13C-NMR của hợp chất MU4 ............................................... 28
Hình 4.1.d. Phổ HSQC của hợp chất MU4 ..................................................... 29
Hình 4.1.e. Phổ HMBC của hợp chất MU4 .................................................... 31
Hình 4.1.f. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MU4 .......................... 31
Hình 4.2.a. Cấu trúc hóa học của hợp chất MU6............................................ 31
Hình 4.2.b. Phổ 1H-NMR của hợp chất MU6 ................................................. 32
Hình 4.2.c. Phổ 13C-NMR của hợp chất MU6 ................................................ 34
Hình 4.3.a. Phổ 1H-NMR của hợp chất MU12 .............................................. 35
Hình 4.3.b. Cấu trúc hóa học của hợp chất MU12 ......................................... 36
Hình 4.3.c. Phổ 13C-NMR của hợp chất MU12 .............................................. 36
Hình 4.3.d. Phổ HSQC của hợp chất MU12 ................................................... 38
Hình 4.3.e. Phổ HMBC của hợp chất MU12 .................................................. 38
Hình 4.3.f. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MU12 ........................ 39
Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của hợp chất MU4 và chất so sánh ................... 30
Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất MU6 và chất so sánh ................... 33
Bảng 4.3. Số liệu Phổ NMR của hợp chất MU12 và chất so sánh ................. 37


MỞ ĐẦU
Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng
dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến môi
sinh. Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại thuốc
chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có
nguồn gốc tự nhiên.
Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao,
người ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các
chất đã tách được từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất
có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho việc phát
triển ngành y, dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người.
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm cao
(khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong phú với
khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo
dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người.
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được nhiều thành công rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ động vật
đã được ứng dụng hiệu quả lưu truyền cho đến ngày nay. Đó là cơ sở rất quan
trọng cho việc phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Tuy nhiên, đối với một đất nước còn hạn chế về nguồn vốn và cơ sở vật
chất như Việt Nam thì vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và sử dụng
nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất cho xã hội.
Cây Trứng cua - Melochia umbellata thuộc họ Trôm Sterculiaceae là
loại cây phổ biến ở khu vực Bảo Lộc, Lâm Đồng. Tuy nhiên, hiện chưa có
nhiều tài liệu công bố về thành phần hóa học cũng như ứng dụng dược lý của
loài này.

1


Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập các dẫn
xuất phenyl glycosit từ cây Trứng cua – Melochia umbellata”.
Khóa luận này tập trung nghiên cứu các thành phần phenyl glicosit của
cây Trứng cua tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm
kiếm thuốc mới, các giải pháp điều trị bệnh.
Nội dung của khóa luận bao gồm:
1. Phân lập các hợp chất phenyl glycosit từ lá cây Trứng cua bằng các
phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng các
phương pháp phổ.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Trứng cua
1.1.1. Giới thiệu về cây Trứng cua

.

Tên khoa học: Melochia umbellata (Wight.) Stapf. thuộc họ Trôm

Sterculiaceae.

. Tên Việt Nam : Trứng cua

Hình 1.1. Cây Trứng cua

. Mô tả cây:
Cây gỗ nhỏ; cành non có lông dày trắng. Lá xoan to, dài đến 20 cm, có
lông mịn như nhung ở hai mặt, gân ở đáy 5; cuống dài bằng phiến, lá bẹ to,
cao 1 cm, hình thận, rụng sớm. Lá ở phát hoa hình bánh bò, trăng trắng. Hoa

3


hường; đài dính thành ống cao 2,5 mm, có lông mịn; cánh hoa cao 8 mm; tiểu
nhụy 5, chỉnh dính thành ống ngắn; noãn sào có lông dày. Nang cao 1 cm, có
5 khía, có lông.
1.1.2. Phân bố
Cây phân bố ở rừng triền núi ở các khu vực: Buôn mê thuột, Cà Ná,
Bảo Lộc...
1.1.3. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về các loài thuộc chi
Melochia cho thấy sự có mặt của các lớp chất alkaloid [1-7], tritecpen [8] và
flavonoid [9].

Scutianine B (I), melonovines A (II) and B (III)

Melochicorine

Melofoline

Melosatin D

Cấu trúc hóa học một số hợp chất alkaloid phân lập được từ các loài Melochia

4


Cấu trúc hóa học các hợp chất Tritecpen phân lập được từ các loài Melochia

Apigenin

Kaempferol

Quercetin

Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoit phân lập được từ các loài Melochia
Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều công trình khoa học công bố về thành
phần hóa học của cây Trứng cua - M. umbellata. Tính đến thời điểm hiện tại,
mới chỉ có 03 công trình khoa học được công bố về loài này. Năm 1980,
nhóm tác giả Gunasegaran và cs công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của
một hợp chất flavonoit là kaempferol-3-O-galactoside từ loài này [10].

5


Kaempferol-3-O-galactoside
Đến năm 2012, hợp chất stigmasterol glycoside là stigmast-5,22-dien3-O-β-D-glucopyranoside tiếp tục được công bố từ loài Melochia umbellata
(Houtt) Stapf var. degrabrata K [11].

Stigmast-5,22-dien-3-O-β-D-glucopyranoside

6


Waltherione C

Cleomiscosin A

7


Gần đây nhất, một hợp chất quinolinone alkaloid là waltherione C và
một hợp chất coumarinolignan là cleomiscosin A cũng được phân lập từ loài
này. Con đường sinh tổng hợp của các hợp chất waltherione A-D và các hợp
chất 4-quinolinone phân lập được từ các loài thuộc họ Malvaceae cũng được
các tác giả đề xuất [12].
1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật [13, 14]
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.2.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng
cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn
trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và
tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản
xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy
bằng nhựa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen

8


clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng
có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp
chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm
việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chlorofrom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.

9


Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình
chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách
đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành
những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp
cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình
tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn.
1.2.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.

10


Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch
chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này
trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra
và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá
trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.3. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

11


1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác
nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha:
pha động và pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…).
Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất
trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của sự khác
nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng
trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này
đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết
quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ
thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này
mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:
n = Error!
n

: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp
phụ nào đó.

12


b

: Hằng số.

C

: Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay
lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.


Theo bản chất của hai pha sử dụng

- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử
lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề
mặt một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong
truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
+ Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký
lớp mỏng, sắc ký cột.


Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá

trình phân tách chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất
lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn
và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,
được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha
tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.

13


- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa
học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các
nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao
đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration
chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên
bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt
trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị.
Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và
di chuyển sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi
trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật
sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể.
Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như
thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng phân tách được
tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên
phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy
thích hợp.


Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)

14


- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin – layer chromatography).
Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos
+ Pha động: là chất lỏng
Trong sắc ký lớp mỏng:
+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là
loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một
ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có
gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt
lên trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai
nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm
nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng.
1.3.3.1. Sắc kí cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ
là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường
và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể
bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất
hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của
chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng
lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có

15


kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng
tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất,
với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu
tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng
đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau.
Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu
cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách
tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác
nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm
chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì
đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với
lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô.
Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô,
sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt
trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng
dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.

16


Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.3.3.2. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica
gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu
chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn
silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy
sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải
hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể
phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc
trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%
1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ [15]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương
pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta
sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp
các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính
xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương
pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so
sánh…[3-5].
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi

17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×