Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu định lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
: 1- acid glycoprotein
: Chất phân tích (Analyte) ATN
: Atenolol
AN
: Cyclodextrin
CD
CM--CD : Carboxymethyl-β-cyclodextrin
: Nồng độ cực đại
: Dược động học
Cmax
DĐH
: Diethylamin
: Điện di đồ
DEA
ĐDĐ
: Đồng phân đối quang
: Ethanol
ĐPĐQ
EtOH
: Acid acetic

: Huyết tương
HAc
HT
: Methanol
: Acetonitril
MeOH
MeCN
: Người tình nguyện
: Khối phổ (Mass spectrometry)
NTN
MS
: Sinh khả dụng
: Sắc ký đồ
SKD
SKĐ
: Triethylamin
: Acid trifloroacetic
TEA
TFA
t1/2
: Thời gian bán thải
Tmax
: Thời gian đạt nồng độ cực đại
: Tương đương sinh học TRIS
: Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TĐSH
: Tài liệu tham khảo
: Tử ngoại (Ultraviolet)
TLTK
UV
AUC
: Diện tích dưới đường cong (Area under the curve)
: Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin)
BSA
: Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)
CE
: Đầu dò mảng diod (Diode array detector)
DAD
: Cơ quan quản lý thuốc Châu âu (European Medicines Agency)
EMA

: Dòng điện thẩm (Electro-osmotic flow)
EOF
: Ion hóa phun sương điện tử (Electrospray ionization)
ESI
: Sắc ký khí (Gas chromatography)
GC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)
HPLC
: Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High quality control)
HQC
: Albumin huyết thanh người (Human serum albumin)
HSA
: Chất nội chuẩn (Internal standard)
IS
: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – Mass spectrometry)
LC-MS
LC-MS/MS : Sắc ký lỏng – khối phổ/khối phổ
(Liquid chromatography – tandem mass spectrometry)
: Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantitation)
LLOQ
: Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Low quality control)
LQC
: Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Medium quality control)
MQC
: Chiết pha rắn (Solid phase extraction)
SPE
: Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ
US-FDA
(United States – Food and Drug Administration)
: Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)
WHO
2-PrOH

: 2-Propanol

AGP

iii


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................... 3
1.1.1. Tổng quan về thuốc chứa dược chất đối quang ...............................................................3
1.1.1.1. Khái niệm đồng phân đối quang ....................................................................................3
1.1.1.2. Một số dược chất có các đồng phân đối quang tác dụng không giống nhau ..............4
1.1.1.3. Tầm quan trọng của việc phân tích các đồng phân đối quang .....................................5
1.1.1.4. Tình hình nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang ở Việt Nam.............................7
1.1.2. Phương pháp phân tích đồng phân đối quang .................................................................9
1.1.2.1. Nguyên tắc chung............................................................................................................9
1.1.2.2. Phân loại tác nhân chọn lọc hoạt quang.......................................................................11
1.1.2.3. Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang thường gặp ............................17
1.2. PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC ........................................................28
1.2.1. Các kỹ thuật xử lý, chiết tách dược chất trong mẫu sinh học .......................................28
1.2.1.1. Kỹ thuật tủa protein.......................................................................................................29
1.2.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ............................................................................................30
1.2.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn ...................................................................................................31
1.2.2. Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký – khối phổ.................32
1.2.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ .................................................33
1.2.2.2. Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ .........................................................34
1.2.2.3. Định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng LC-MS/MS với nguồn ESI..................35
1.2.3. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS phân tích thuốc trong dịch sinh học .................37
1.2.3.1. Mục đích của thẩm định phương pháp phân tích ........................................................37
1.2.3.2. Các chỉ tiêu, tiêu chí trong thẩm định phương pháp phân tích...................................37
1.3. ATENOLOL, ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......39
1.3.1. Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của atenolol ......................................................39
1.3.1.1. Công thức cấu tạo..........................................................................................................39
1.3.1.2. Tính chất hóa lý .............................................................................................................40
1.3.2. Các đặc tính dược lý, dược động học của atenolol........................................................40
1.3.2.1. Tác dụng và cơ chế .......................................................................................................40
1.3.2.2. Chỉ định – chống chỉ định.............................................................................................40
1.3.2.3. Dạng thuốc và hàm lượng ............................................................................................41
iv


1.3.2.4. Dược động học ..............................................................................................................41
1.3.2.5. Nghiên cứu dược lý, dược động học các đồng phân đối quang atenolol .................42
1.3.3. Các phương pháp phân tích atenolol và đồng phân đối quang ....................................42
1.3.3.1. Phân tích atenolol và đồng phân đối quang trong nguyên liệu, chế phẩm thuốc ......42
1.3.3.2. Phân tích atenolol và đồng phân đối quang trong dịch sinh học................................46
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................. 49
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ ..............................................................................49
2.1.1. Dung môi, hóa chất và chất chuẩn .................................................................................49
2.1.1.1. Chất chuẩn, chất đối chiếu............................................................................................49
2.1.1.2. Dung môi, hóa chất .......................................................................................................49
2.1.1.3. Huyết tương ...................................................................................................................49
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ..............................................................................................50
2.1.2.1. Thiết bị phân tích...........................................................................................................50
2.1.2.2. Dụng cụ phân tích .........................................................................................................50
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................................50
2.2.1. Mẫu thuốc nghiên cứu .....................................................................................................50
2.2.1.1. Mẫu thuốc atenolol racemic .........................................................................................50
2.2.1.2. Mẫu thuốc S-Atenolol ...................................................................................................51
2.2.2. Mẫu huyết tương người chứa atenolol ...........................................................................51
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................52
2.3.1. Nghiên cứu định lượng atenolol và đồng phân đối quang trong chế phẩm.................52
2.3.1.1. Khảo sát xây dựng phương pháp ................................................................................52
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng atenolol và đồng phân trong chế phẩm .........55
2.3.1.3. Phân tích atenolol và đồng phân đối quang trong một số mẫu thuốc .......................56
2.3.2. Nghiên cứu định lượng ATN và ĐPĐQ trong huyết tương bằng LC-MS/MS .............57
2.3.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp LC-MS/MS ...........................................................57
2.3.2.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS ........................................................................58
2.3.2.2. Phân tích atenolol và đồng phân trong huyết tương người bằng LC-MS/MS .........60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 62
3.1. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG CHẾ PHẨM.................. 62
3.1.1. Nghiên cứu phương pháp CE phân tích đồng phân đối quang atenolol ......................62
3.1.1.1. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện điện di .....................................................................62
3.1.1.2. Thẩm định phương pháp CE phân tích atenolol và đồng phân trong chế phẩm.......65
3.1.2. Nghiên cứu định lượng các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm bằng HPLC ................70
3.1.2.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC.................................................................70
v


3.1.2.2. Thẩm định phương pháp HPLC phân tích đồng phân đối quang atenolol................75
3.1.3. Phân tích atenolol và đồng phân đối quang trong chế phẩm .......................................84
3.1.3.1. Định lượng atenolol và các đồng phân trong một số thuốc ........................................84
3.1.3.2. Xác định tạp đồng phân đối quang trong một số chế phẩm S-Atenolol ....................88
3.1.3.3. Định lượng atenolol và đồng phân trong so sánh độ hòa tan in vitro ........................89
3.2. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG HUYẾT TƯƠNG......90
3.2.1. Định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương bằng LC-MS/MS........................90
3.2.1.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp.............................................................................90
3.2.1.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng ĐPĐQ của ATN trong HT ..... 100
3.2.2. Nghiên cứu định lượng atenolol toàn phần trong huyết tương bằng LC-MS/MS .... 112
3.2.2.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng atenolol toàn phần ..................... 112
3.2.2.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng atenolol toàn phần ................... 114
3.2.3. Phân tích atenolol và đồng phân trong huyết tương NTN, bệnh nhân ...................... 119
3.2.3.1. Định lượng atenolol toàn phần trong huyết tương ................................................... 119
3.2.3.2. Phân tích atenolol và các đồng phân trong huyết tương bệnh nhân ....................... 120
3.2.3.3. Phân tích atenolol và các đồng phân trong huyết tương người tình nguyện .......... 121
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 130
4.1. PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM ............................ 130
4.1.1. Phân tích đồng phân đối quang atenolol bằng các phương pháp HPLC, CE.......... 130
4.1.2. Kết quả phân tích atenolol và đồng phân trong chế phẩm thuốc .............................. 134
4.2. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ ĐỒNG PHÂN TRONG DỊCH SINH HỌC ............ 135
4.2.1. Phương pháp LC-MS/MS phân tích atenolol và đồng phân trong huyết tương ....... 135
4.2.2. Kết quả phân tích ĐPĐQ của ATN trong HT và sinh khả dụng các thuốc............... 140
4.3. CÁC ĐIỂM ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................................ 142
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 146
DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Một số dược chất có ĐPĐQ tác dụng dược lý không giống nhau ..............

4

Bảng 1.2

Tính chất hóa lý của một số cyclodextrin tự nhiên.......................................

14

Bảng 1.3

Một số phương pháp GC với pha tĩnh đặc hiệu phân tích ĐPĐQ..............

19

Bảng 1.4

Một số thuốc thử được sử dụng trong phân tích ĐPĐQ bằng phương

20

pháp HPLC .....................................................................................................
Bảng 1.5

Một số nghiên cứu phân tích ĐPĐQ trong các mẫu nguyên liệu và chế

22

phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC .........................................................
Bảng 1.6

Một số nghiên cứu phân tích ĐPĐQ trong dịch sinh học bằng phương

23

pháp HPLC và LC-MS ...................................................................................
Bảng 1.7

Tóm tắt một số ứng dụng phân tích ĐPĐQ bằng CE sử dụng chất chọn

27

lọc hoạt quang dẫn chất CD ..........................................................................
Bảng 1.8

Một số đặc điểm khác nhau giữa phân tích dược chất trong chế phẩm

28

bào chế và trong dịch sinh học ......................................................................
Bảng 1.9

Tóm tắt đặc điểm, phạm vi áp dụng phương pháp GC-MS và LC-MS.......

35

Bảng 1.10 Giá trị thông số dược động học của atenolol trong một số nghiên cứu .....

41

Bảng 1.11 Một số nghiên cứu định lượng ĐPĐQ atenolol trong nguyên liệu và

43

chế phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC ..................................................
Bảng 1.12 Một số nghiên cứu định lượng ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm bằng

45

phương pháp CE.............................................................................................
Bảng 1.13 Một số phương pháp HPLC định lượng atenolol trong dịch sinh học .......

47

Bảng 1.14 Một số nghiên cứu định lượng ĐPĐQ của atenolol trong dịch sinh học

48

bằng phương pháp HPLC..............................................................................
Bảng 2.1

Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn ATN trong huyết tương ...............................

59

Bảng 3.1

Kết quả xác định độ phù hợp của hệ thống điện di ......................................

65

Bảng 3.2

Mối tương quan giữa nồng độ ATN và diện tích pic trên điện di đồ ..........

67

Bảng 3.3

Độ lặp lại và tái lặp của phương pháp CE ...................................................

68

Bảng 3.4

Kết quả xác định độ đúng của phương pháp CE .........................................

69

Bảng 3.5

Hàm lượng R-ATN và S-ATN trong chất chuẩn racemic ............................

76

Bảng 3.6

Độ phù hợp của hệ thống sắc ký....................................................................

77

Bảng 3.7

Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp HPLC .................................

80

Bảng 3.8

Độ lặp lại trong ngày của phương pháp HPLC ...........................................

81

Bảng 3.9

Độ tái lặp của phương pháp HPLC ..............................................................

82

Bảng 3.10 Độ đúng của phương pháp HPLC ................................................................

83

Bảng 3.11 Kết quả định lượng atenolol và đồng phân đối quang trong mẫu thử........

85

vii


Bảng 3.12 So sánh độ chính xác của hai phương pháp HPLC, CE định lượng

85

ATN và các ĐPĐQ trong chế phẩm..............................................................
Bảng 3.13 Phân tích ANOVA kết quả định lượng ATN toàn phần trong chế phẩm

86

của các phương pháp .....................................................................................
Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng atenolol trong một số chế phẩm thuốc .........

87

Bảng 3.15 Hàm lượng tạp R-ATN trong một số chế phẩm thuốc S-ATN .....................

88

Bảng 3.16 Kết quả định lượng ATN và ĐPĐQ trong môi trường thử độ hòa tan .......

89

Bảng 3.17 Điều kiện khối phổ định lượng atenolol và nội chuẩn .................................

99

Bảng 3.18 Độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS...........................................................

100

Bảng 3.19 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của R-Atenolol ....................................

102

Bảng 3.20 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của S-Atenolol.....................................

103

Bảng 3.21 Giá trị LLOQ của phương pháp LC-MS/MS ................................................

103

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu ..............................................

104

Bảng 3.23 Độ chính xác trong ngày và khác ngày của R-Atenolol...............................

105

Bảng 3.24 Độ chính xác trong ngày và khác ngày của S-Atenolol ...............................

106

Bảng 3.25 Độ thu hồi các đồng phân đối quang atenolol của phương pháp ...............

107

Bảng 3.26 Độ thu hồi nội chuẩn esomeprazol của phương pháp .................................

108

Bảng 3.27 Độ ổn định của ATN trong mẫu HT bảo quản 6 giờ ở nhiệt độ phòng ......

109

o

Bảng 3.28 Độ ổn định của ATN sau xử lý mẫu và bảo quản ở 4 C .................................

110

Bảng 3.29 Độ ổn định của ATN sau ba chu kỳ đông lạnh – rã đông............................

110

Bảng 3.30 Độ ổn định dài ngày trong huyết tương của atenolol ..................................

111

Bảng 3.31 Điều kiện khối phổ định lượng atenolol và nội chuẩn diltiazem .................

113

Bảng 3.32 Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp LC-MS/MS định lượng

115

ATN toàn phần trong huyết tương.................................................................
Bảng 3.33 Độ chính xác của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần ..

116

Bảng 3.34 LLOQ của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần ..............

117

Bảng 3.35 Ảnh hưởng nền mẫu trong phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN

118

toàn phần.........................................................................................................
Bảng 3.36 Độ thu hồi nội chuẩn diltiazem của phương pháp LC-MS/MS định

118

lượng ATN toàn phần .....................................................................................
Bảng 3.37 So sánh nồng độ R,S-ATN xác định bằng các phương pháp LC-MS/MS...

119

Bảng 3.38 Nồng độ atenolol trong một số mẫu huyết tương bệnh nhân ......................

121

Bảng 3.39 Nồng độ R-ATN và S-ATN trong huyết tương 06 NTN sau khi uống

122

thuốc Atenolol STADA 50 mg ........................................................................
Bảng 3.40 Nồng độ R-ATN và S-ATN trong huyết tương 06 NTN sau khi uống
thuốc TENORMIN 50 mg ..............................................................................
viii

123


Bảng 3.41 Nồng độ S-ATN trong huyết tương 06 NTN sau khi uống các thuốc

124

®

Atpure 25 và viên nén S-Atenolol 25 mg.....................................................
Bảng 3.42 Nồng độ S-ATN trong huyết tương 06 NTN sau khi uống các thuốc

125

®

Atpure 25 và Tenormin 50 mg .....................................................................
Bảng 3.43 Thông số DĐH trung bình của một số thuốc ATN trên NTN Việt Nam .....

ix

128


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Trang
Hình 1.1

Mô hình Easson-Stedman ................................................................................

5

Hình 1.2

Liên kết tạo phức giữa amylose tris (3,5-dimethylphenylcarbamat) với

10

(a): (1S, 2R)-(+)-norephedrin; (b): (1R, 2S)-(-)-norephedrin) .....................
Hình 1.3

Cấu trúc “phức lồng” của R-propranolol với heptakis (2,3-di-O-acetyl-

10

6-O-sulfo)-β-cyclodextrin trong (a): dung môi; (b): nước ............................
Hình 1.4

Cấu tạo, vị trí hình thành liên kết giữa HSA và các ĐPĐQ ..........................

12

Hình 1.5

Cấu tạo pha tĩnh đối quang dẫn chất polysaccharid cuả một số cột HPLC.....

12

Hình 1.6

Cấu tạo một số pha tĩnh liên kết tác nhân hoạt quang kiểu Pirkle ...............

13

Hình 1.7

Cấu tạo và kích thước hốc kỵ nước của các cyclodextrin..............................

14

Hình 1.8

Cấu trúc của một số tác nhân hoạt quang dẫn chất cyclodextrin .................

15

Hình 1.9

Một số chất chọn lọc đối quang có cấu trúc vòng ether thường dùng

16

trong phương pháp CE phân tích ĐPĐQ ......................................................
Hình 1.10 Cấu trúc phức hợp N-(2-hydroxypropyl)-L-4-hydroxyprolin và các đồng

17

phân đối quang của acid amin ........................................................................
Hình 1.11 Cấu tạo một số pha tĩnh đối quang dẫn chất CD của cột GC.......................

18

Hình 1.12 Sự hình thành dòng điện thẩm trong phương pháp CE .................................

24

Hình 1.13 Sơ đồ mô phỏng nguyên tắc phân tích ĐPĐQ bằng phương pháp CE

26

với tác nhân hoạt quang là dẫn chất CD ........................................................
Hình 1.14 Qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật SPE...........................................................

31

Hình 1.15 Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị khối phổ .........................

33

Hình 1.16 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của khối phổ tứ cực chập ba...........................

36

Hình 1.17 Công thức cấu tạo các đồng phân đối quang của atenolol ...........................

40

Hình 2.1

Các mẫu thuốc nghiên cứu ..............................................................................

51

Hình 2.2

Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Ultron ES-OVM ....

52

Hình 2.3

Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Chirex 3022 ...........

52

Hình 2.4

Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Chiracel AGP ........

53

Hình 2.5

Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Astec Cyclobond ...

53

Hình 2.6

Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Chiralpak CBH .....

54

Hình 2.7

Cơ chế hoạt động của thiết bị LC-MS trong quá trình tối ưu hóa ................

57

Hình 3.1

Ảnh hưởng của các dung dịch đệm borat (a), Tetrabutylamoni sulfat 50

62

mM (b) và TRIS 50 mM (c) tới tm của atenolol...............................................
Hình 3.2

Điện di đồ của atenolol với 3 tác nhân chọn lọc đối quang: a) β-CD 20

63

mM; b) HP-β-CD 25mM, c) CM-β-CD 8mM ................................................
Hình 3.3

Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến độ phân giải của atenolol ...............
x

64


Hình 3.4

Điện di đồ mẫu R,S-Atenolol nồng độ 100 ppb ..............................................

65

Hình 3.5

Điện di đồ các mẫu placebo (a), chuẩn R,S-Atenolol (b), chuẩn S-

66

Atenolol (c) và mẫu thử Atenolol STADA (d) .................................................
Hình 3.6

Phổ UV (a) và phổ tinh khiết (b) của các pic ATN trên ĐDĐ mẫu thử........

66

Hình 3.7

SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Ultron ES–OVM ở bước

70

sóng =230 nm và các pha động: đệm phosphat 20mM, pH 3; 0,75
ml/phút (a) đệm phosphat 20 mM, pH 7–MeOH (99:1); 0,75 ml/phút (b)...
Hình 3.8

SKĐ phân tích R,S-ATN trên cột Chiral AGP với tốc độ dòng 0,75

71

ml/phút; đầu dò DAD ( = 230 nm) và các pha động (a): đệm NaH2PO4
10mM, pH 4,5 – 2-PrOH (99:1); (b): đệm NaH2PO4 10 mM, pH 7,0 –
MeOH (99,9:0,1) ..............................................................................................
Hình 3.9

SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Astec Cyclobond cùng các

71

pha động (a): đệm amoni acetat, pH 4 – MeCN (25:75), (b): MeCN –
MeOH – acid acetic – triethylamine (99:1:0,1:0,1) với tốc độ 1,0
ml/phút và đầu dò DAD ( = 230 nm) ............................................................
Hình 3.10 SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích bằng cột Chirex 3022, DAD ( =

72

230 nm), pha động n-hexan – CH2Cl2 – MeOH – TFA với các tỷ
lệ 50:35:7,5:0,25 (a); 50:35:10:0,25 (b); 57,5:35:7,5:0,25 (c) và
50:35:5:0,25 (d)................................................................................................
Hình 3.11 SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Chiralpak CBH, pha động

73

2- PrOH/đệm amoni acetat 10 mM, pH 7,0 với các tỷ lệ 1/99(a) và
15/85(b) .............................................................................................................
Hình 3.12 SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Chiralpak CBH với các

73

pha động có pH dung dịch đệm 5,0 (a) và 7,0 (b)..........................................
Hình 3.13 SKĐ và phổ UV mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Chirex 3022 với

74

pha động n-hexan – 1,2 CH2Cl2 – MeOH – TFA (57,5 : 35 : 7,5 : 0,2),
1 ml/phút............................................................................................................
Hình 3.14 SKĐ và phổ 3D phân tích mẫu chuẩn R,S-ATN với cột Chiralpak CBH;

75

pha động 2-PrOH/đệm amoni acetat 10 mM, pH 5,9 (10/90);
0,7 ml/phút ........................................................................................................
Hình 3.15 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp HPLC

78

phân tích các đồng phân đối quang atenolol..................................................
Hình 3.16 So sánh phổ UV của các pic trong mẫu thử và chuẩn R,S-Atenolol .............

79

Hình 3.17 Đồ thị tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ R-ATN (trái)

80

và S-ATN (phải) ................................................................................................
Hình 3.18 SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN nồng độ: (a) 0,078 µg/ml và (b) 0,156 µg/ml.....
xi

84


Hình 3.19 Sắc ký đồ xác định hàm lượng tạp R-ATN trong một số thuốc: mẫu tạp

88

®

chuẩn (a); mẫu Atpure 25 (b) và mẫu viên nén S-atenolol 25 mg (c).........
Hình 3.20 Biểu đồ so sánh độ hòa tan của các thuốc trong môi trường pH 1,2 ...........

90

Hình 3.21 Phổ khối dung dịch chuẩn atenolol .................................................................

91

Hình 3.22 Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 267 Da ...............

91

Hình 3.23 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [ATN+H]+ .................................................

92

+

Hình 3.24 Giản đồ năng lượng phân mảnh [ATN+H] tạo ion có tỷ số m/z = 190......

92

Hình 3.25 SKĐ phân tích mẫu chuẩn atenolol và IS trên cột Chiralpak CBH .............

95

Hình 3.26 Sơ đồ nghiên cứu chiết ATN trong HT bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng ...

96

Hình 3.27 Sắc ký đồ dòng ion ATN và IS khi phân tích mẫu huyết tương trắng đã

97

xử lý tủa protein bằng MeCN ..........................................................................
Hình 3.28 Sắc ký đồ dòng ion ATN và IS khi phân tích mẫu huyết tương trắng đã

98

xử lý chiết lỏng - lỏng với chloroform .............................................................
Hình 3.29 SKĐ mẫu HT chứa R,S-ATN và IS phân tích bằng LC-MS/MS, (a): SKĐ

99

tổng các ion; (b): SKĐ chọn lọc ion atenolol; (c): SKĐ chọn lọc ion
esomeprazol ......................................................................................................
Hình 3.30 SKĐ tính chọn lọc–đặc hiệu của phương pháp LC-MS/MS định lượng

101

các đồng phân đối quang atenolol trong huyết tương ...................................
Hình 3.31 Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa R,S-ATN và IS phân tích bằng LC-

113

MS/MS (a): SKĐ tổng ion, (b): SKĐ chọn lọc ion atenolol, (c): SKĐ
chọn lọc ion diltiazem.......................................................................................
Hình 3.32 Độ đặc hiệu–chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN

114

toàn phần...........................................................................................................
Hình 3.33 SKĐ mẫu HT bệnh nhân T.V.H sau khi uống ATN 2 giờ .............................. 120
Hình 3.34 SKĐ mẫu HT bệnh nhân T.V.H sau khi uống ATN 24 giờ ............................ 120
Hình 3.35 SKĐ mẫu HT trước khi uống thuốc (điểm 0 h) của NTN 01 ......................... 126
Hình 3.36 SKĐ mẫu HT điểm 0 h của NTN 18 thêm nội chuẩn ..................................... 126
Hình 3.37 SKĐ mẫu HT của NTN 02 sau khi uống thuốc atenolol racemic 2,5 h ........ 126
Hình 3.38 SKĐ mẫu HT của NTN 02 sau khi uống thuốc atenolol racemic 24 h ......... 126
Hình 3.39 SKĐ mẫu HT của NTN 08 sau khi uống viên nén S-atenolol 2 giờ .............. 127
Hình 3.40 SKĐ mẫu HT của NTN 08 sau khi uống viên nén S-atenolol 24 giờ ............ 127
Hình 3.41 Đường cong trung bình nồng độ S-Atenolol – thời gian của các chế

128

phẩm thuốc trên người tình nguyện Việt Nam................................................
Hình 3.42 Đường cong trung bình nồng độ R,S-Atenolol – thời gian ............................ 129

xii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh và vật
qua gương, chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống nhau chỉ khác về cách bố trí
không gian của các nhóm thế quanh trung tâm bất đối xứng của phân tử. Sự khác nhau
về cấu trúc không gian làm cho mỗi dạng đồng phân có tương tác khác nhau với một
thụ thể sinh học xác định (tương tự như phản ứng đặc hiệu “chất mang-thụ thể” của
các enzym). Kết quả là các đồng phân đối quang (ĐPĐQ) của một thuốc có thể có các
đặc tính dược lý, lâm sàng khác nhau [50], [54]. Trong khi các protein, enzym, acid
amin, hydratcarbon tự nhiên chỉ tồn tại ở một dạng ĐPĐQ duy nhất, ví dụ như các acid
amin là đồng phân l (tả tuyền); các loại đường tự nhiên là đồng phân d (hữu tuyền) thì
phần lớn các chất tổng hợp hóa học và bán tổng hợp hóa học đều có ĐPĐQ. Theo
thống kê, gần 50% số hoạt chất đang lưu hành trên thị trường dược phẩm thế giới hiện
nay là các hợp chất có ĐPĐQ và gần ⅓ trong số này, các ĐPĐQ của dược chất có đặc
tính dược lý, dược lực học, dược động học, độc tính… không giống nhau [23], [85],
[88], [108], [198]. Atenolol (ATN) dẫn chất của benzenacetamid, có tác dụng ức chế
chọn lọc β–adrenergic, được dùng trong điều trị tăng huyết áp là một trong số những
dược chất có đặc điểm nêu trên. Chế phẩm ATN được cấp phép lưu hành lần đầu trên
thị trường dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang R-ATN và S-ATN.
Trong hai đồng phân, S-ATN có tác dụng ức chế β–adrenergic cao hơn khoảng 50 lần
và ít tác dụng phụ hơn so với R-ATN [146], [153], [177]. Hiện đã có một số chế phẩm
thuốc chỉ có dược chất S-ATN với hàm lượng bằng 1/2 thuốc ATN racemic đã được
cấp phép lưu hành tại Việt Nam và một số nước.
Xu hướng nghiên cứu phát triển dược phẩm mới chứa ĐPĐQ tinh khiết hoặc
chuyển từ thuốc hỗn hợp racemic chứa các ĐPĐQ có tác dụng dược lý không giống
nhau trong quá khứ thành thuốc chỉ chứa một ĐPĐQ có tác dụng dược lý với mục đích
giảm lượng dược chất đưa vào cơ thể, giảm tác dụng không mong muốn, tránh độc
tính của thành phần đối quang còn lại đang là một hướng phát triển mới của ngành
công nghiệp dược thế giới trong những năm gần đây [23], [85], [88]. Theo số liệu
thống kê đăng tải trên tạp chí Pharmaceutical Technology năm 2006, trong số 10 biệt
-1-


dược có doanh số bán lớn nhất toàn cầu có tới 9 dược chất đối quang, và 4/5 biệt dược
có doanh số lớn nhất đều là các dược chất đối quang tinh khiết [160]. Trên thế giới,
tầm quan trọng của việc kiểm soát chất lượng các thuốc đối quang đã được chú trọng
từ nhiều năm nay. Cơ quan quản lý Y tế của Mỹ, Canada, Australia, Châu Âu quy định
các thuốc chứa dược chất đối quang chỉ được cấp phép đăng ký, sản xuất và lưu hành
khi có đầy đủ số liệu nghiên cứu đặc điểm dược lý, dược động học… của từng đồng
phân; cũng như phải có các phương pháp phân tích phù hợp để kiểm soát chất lượng
thuốc [34], [65], [66], [89].
ĐPĐQ có cấu tạo hóa học tương tự nhau nên có nhiều tính chất vật lý, hóa học cơ
bản giống nhau, do vậy việc phát triển các phương pháp hóa lý phân tích, định lượng
đồng phân đối quang gặp nhiều khó khăn [23], [54], [77], [78]. Tại Việt Nam cũng
như nhiều nước đang phát triển trên thế giới, cho tới nay số lượng các nghiên cứu phân
tích, định lượng các ĐPĐQ của ATN nói riêng và các đồng phân có tác dụng dược lý
không giống nhau khác nói chung trong các chế phẩm thuốc và đặc biệt trong dịch
sinh học còn tương đối ít và chưa có hệ thống. Do vậy, luận án “Nghiên cứu định
lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong
dịch sinh học” được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu các phương pháp phân tích
ATN và ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc và trong huyết tương nhằm kiểm tra chất lượng
và so sánh sinh khả dụng (SKD), đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) các thuốc
ATN bao gồm dạng thuốc racemic và dạng thuốc đơn ĐPĐQ (S-ATN) đang lưu hành
trên thị trường. Để đạt được mục tiêu này, luận án thực hiện các nội dung chính sau:
1. Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp phân tích các ĐPĐQ của ATN
trong chế phẩm thuốc và ứng dụng trong kiểm tra chất lượng các thuốc ATN
2. Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp phân tích ATN và các ĐPĐQ trong
huyết tương và ứng dụng trong nghiên cứu SKD, đánh giá TĐSH một số chế phẩm
thuốc ATN đang lưu hành trên thị trường.

-2-


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.1.1. Tổng quan về thuốc chứa dược chất đối quang
1.1.1.1. Khái niệm đồng phân đối quang
Đồng phân đối quang (ĐPĐQ) có liên quan đến sự khác nhau về góc quay mặt phẳng
của ánh sáng phân cực. Chất có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực
một góc  nào đó được gọi là chất hoạt quang. Điều kiện cho tính hoạt quang chính là
cấu trúc hình học của phân tử phải có tính chất bất đối xứng. Sự bất đối xứng thường
xảy ra khi trong phân tử có một nguyên tử C liên kết với 4 nhóm thế khác nhau, gọi là
nguyên tử carbon bất đối. Ngoài nguyên tử C bất đối, thì trung tâm bất đối của phân tử
còn có thể là các nguyên tử S, P hoặc N. Tính chất bất đối xứng của phân tử không
những chỉ liên quan đến trung tâm bất đối mà còn có thể hình thành từ trục bất đối
xứng vật - ảnh hoặc mặt phẳng bất đối xứng của phân tử. Hai dạng phân tử đối xứng
của cùng một chất nhưng không thể chồng khít giống vật với ảnh của chính nó qua
gương hay giống như tay phải và tay trái của một người được gọi là các ĐPĐQ
(enantiomer hoặc optical isomer) của chất đó [2], [128], [198].
Các ĐPĐQ có công thức hóa học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác về cách bố trí
không gian của các nhóm thế quanh carbon bất đối. Ngoài sự khác biệt trong cấu trúc
phân tử theo kiểu như sự phân biệt của bàn tay phải và bàn tay trái, khả năng quay mặt
phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau, còn lại
tất cả các tính chất lý hóa thông thường của các ĐPĐQ là giống nhau [2], [128], [198].
Các ĐPĐQ được phân chia thành đồng phân tả tuyền (l-isomer) và đồng phân hữu
tuyền (d-isomer) dựa trên khả năng làm quay ánh sáng phân cực sang bên trái hay bên
phải tương ứng (phân loại cấu hình theo quy tắc Fischer). Hỗn hợp có tỷ lệ bằng nhau
của đồng phân tả tuyền và hữu tuyền được gọi là hỗn hợp racemic. Do có tỷ lệ các
ĐPĐQ bằng nhau, nên hỗn hợp racemic không làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân
cực. Ngoài hệ thống phân loại theo quy tắc Fischer, còn có hệ thống phân loại ĐPĐQ
dựa trên trục quay từ nguyên tử liên kết với C có phân tử lượng lớn nhất đến nguyên tử
có phân tử lượng bé hơn (hệ thống phân loại Cahn – Ingold Prelog). Nếu chiều quay
thuận chiều kim đồng hồ thì gọi là đồng phân hữu tuyền (Rictus - R: phải) và ngược lại
là đồng phân tả tuyền (Sinister - S: trái) – [75], [85].
-3-


1.1.1.2. Một số dược chất có các đồng phân đối quang tác dụng không giống nhau
Hiện tượng đồng phân quang học được phát hiện bởi Louis Pasteur năm 1848, khi ông
phân tách được ĐPĐQ l-natri amoni tartrat [75]. Tuy vậy, phải mất gần thế kỷ sau
nhân loại mới thấy được hiện tượng này không chỉ đóng vai trò quan trọng trong đời
sống của thực vật, động vật mà còn trong nền công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và
hóa chất [50], [54]. Trong khi các hợp chất tự nhiên như protein, enzym, acid amin,
hydratcarbon, nucleosid, một số alkaloid và hormon… đều là các hợp chất đối quang
và thường chỉ tồn tại ở một dạng đồng phân thì hầu hết các thuốc tổng hợp hóa học
được phát triển trong quá khứ đều có cấu trúc phân tử bất đối xứng nhưng không hoạt
quang do tồn tại ở dạng hỗn hợp racemic [58], [88], [108].
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy, mặc dù có chung công thức hóa học
song các ĐPĐQ trong hỗn hợp racemic lại có tác dụng dược lý, dược lực học, độc
tính… không giống nhau. Bảng 1.1 liệt kê danh sách một số dược chất có cấu trúc phân
tử bất đối xứng và hoạt tính sinh học của từng ĐPĐQ trong hỗn hợp không giống nhau.
Bảng 1.1. Một số dược chất có ĐPĐQ tác dụng dược lý không giống nhau
Thuốc/ dược chất
Atenolol
Ethambutol

Tác dụng dược lý

TLTK

Đồng phân S-ATN có tác dụng chẹn kênh β-adrenergic [177],
gấp khoảng 46-100 lần so với đồng phân R-ATN

[178]

Đồng phân S có tác dụng diệt vi khuẩn lao. Đồng phân

[25]

R có thể gây viêm dây thần kinh thị giác
Levodopa

l-dopa là dạng dùng làm thuốc điều trị Parkinson. Đồng

[49]

phân d-dopa gây giảm bạch cầu hạt
Penicillamin

Đồng phân S-penicillamin có tác dụng chống viêm

[33]

khớp. Đồng phân R-penicillamin độc với tế bào
Propranolol

Tác dụng ức chế β-adrenergic của đồng phân S gấp

[178]

khoảng 100 lần so với đồng phân R
Thalidomid

Đồng phân hữu tuyền có tác dụng an thần, đồng phân tả

[132]

tuyền gây độc tế bào
Ngoài sự khác nhau về tác dụng dược lý và độc tính, các ĐPĐQ còn có thể khác
nhau về mức độ tác dụng dược lý hoặc khác nhau về dược động học (DĐH)... Một
trong các ví dụ điển hình về mức độ tác dụng dược lý khác nhau giữa các ĐPĐQ có
thể kể đến là các thuốc điều trị tim mạch, huyết áp nhóm chẹn β-adrenergic, chẹn kênh
-4-


calci hoặc ức chế men chuyển như ATN, propranolol, diltiazem, amlodipin và
verapamil [153], [167], [178], [189]. Dạng đồng phân tả tuyền của ATN có tác dụng
dược lý gấp khoảng 40–100 lần so với dạng ATN hữu tuyền, S-amlodipin có tác dụng
gấp khoảng 2 lần R-amlodipin và có ít tác dụng phụ hơn [153].
Sự khác nhau về tác dụng dược lý, dược lực học, DĐH, độc tính… của các ĐPĐQ
trên cơ thể sống có thể được giải thích bởi mô hình tương tác ba điểm của EassonStedman – Hình 1.1 [85].

Hình 1.1. Mô hình Easson-Stedman
Trong mô hình, ĐPĐQ có hoạt tính (bên trái) sẽ gắn với thụ thể (receptor) ở cả ba
vị trí tương ứng tạo thành các cặp liên kết Aa, Bb, Cc trong khi đó ĐPĐQ còn lại do vị
trí trong không gian của các nhóm chức không phù hợp với cấu trúc không gian của
thụ thể nên không thể tạo thành đủ cả ba cặp liên kết cần thiết với thụ thể, vì vậy
không gây ra các hoạt tính sinh học trên cơ thể sống [54], [85], [88]. Môi trường cơ thể
sống tồn tại nhiều yếu tố, tác nhân bất đối xứng như là các enzym, protein, receptor...
nên cơ thể sống có tính chọn lọc đối quang cao, cơ thể sống tương tác với mỗi ĐPĐQ
của một thuốc racemic theo cách khác nhau. Do vậy, các ĐPĐQ có tác dụng sinh học
trên cơ thể sống khác nhau.
1.1.1.3. Tầm quan trọng của việc phân tích các đồng phân đối quang
Trước những năm 1990, việc phân tích ĐPĐQ là một vấn đề khá khó khăn, các
phương pháp tổng hợp và phân tách chưa phát triển nhiều do vậy việc nghiên cứu về
các ĐPĐQ còn hạn chế. Một thảm họa y học liên quan đến ĐPĐQ xảy ra vào những
-5-


năm 50 – 60 của thế kỷ 20 đã được ghi nhận trong lịch sử y văn thế giới. Hàng nghìn
thai phụ sử dụng thuốc thalidomid dạng racemic để điều trị những triệu chứng như
chóng mặt, mất ngủ, buồn nôn trong giai đoạn đầu của thai kỳ đã sinh ra những đứa trẻ
bị dị tật bẩm sinh ở các chi (hội chứng phocomelia). Các nghiên cứu chuyên sâu thực
hiện sau thảm họa cho thấy, đồng phân S-thalidomid trong thuốc racemic ức chế miễn
dịch, gây độc đối với tế bào và là nguyên nhân gây ra hội chứng phocomelia [132].
Mặc dù vậy, số lượng các thuốc chứa dược chất đối quang (thuốc đối quang) vẫn
không ngừng gia tăng qua các năm. Sự chuyển dịch các thuốc đối quang từ dạng
racemic sang các thuốc chỉ chứa một ĐPĐQ cũng như sự phát triển các thuốc mới
chứa dược chất có cấu trúc bất đối với một dạng ĐPĐQ duy nhất vẫn là xu hướng phát
triển mạnh mẽ của ngành dược trong những năm gần đây [88], [160], [168], [192].
Hiện nay, để theo kịp sự phát triển của các thuốc đối quang, nhiều nước và tổ chức
quốc tế đã ban hành các quy chế, hướng dẫn nghiên cứu phát triển và quản lý chất
lượng thuốc chứa dược chất có tính đối quang [34], [65], [89], [91], [182]. Theo quy
định, có thể nghiên cứu phát triển và đăng ký lưu hành thuốc đối quang ở dạng
racemic trong trường hợp không có hoặc chỉ có sự khác biệt nhỏ về tác dụng dược lý,
độc tính giữa các đồng phân. Nếu tác dụng dược lý chính, chỉ do một đồng phân đem
lại nên xem xét phát nghiên cứu triển thuốc chỉ chứa một ĐPĐQ thay cho thuốc
racemic để đạt được hiệu quả điều trị tốt hơn. Trường hợp, độc tính do một đồng phân
gây ra, cần thiết phải phát triển thuốc chỉ với một ĐPĐQ duy nhất để đảm bảo an toàn
cho các chỉ định trên lâm sàng [65], [89], [182]. Các phương pháp phân tích phân biệt
ĐPĐQ thích hợp phải được sử dụng trong nghiên cứu phát triển cũng như quản lý chất
lượng các thuốc đối quang. Chỉ những trường hợp, khi chứng minh được việc chuyển
đổi giữa các ĐPĐQ không xảy ra thì mới có thể không cần thiết phải sử dụng phương
pháp phân tích phân biệt ĐPĐQ [67], [94]. Đối với các thuốc chứa một ĐPĐQ, tiêu
chuẩn chất lượng sản phẩm phải quy định mức giới hạn tạp ĐPĐQ hoặc chỉ tiêu tinh
khiết đối quang (enantiomeric purity) cùng với phương pháp phân tích phân biệt
ĐPĐQ phù hợp. Phương pháp phân tích xác định giới hạn tạp chất đối quang hoặc tinh
khiết đối quang phải có khả năng đánh giá tính toàn vẹn về lập thể của hoạt chất và sản
phẩm thuốc đồng thời phải có độ nhạy phù hợp với giới hạn phát hiện tạp chất đối
quang. Tùy theo từng hoạt chất mà giới hạn tạp đối quang có thể chấp nhận từ 0,1%
đến không quá 2,0% [92], [93], [130], [186]. Kể từ năm 2004, khi lần đầu tiên Dược
-6-


điển Anh và Dược điển châu Âu ban hành chuyên luận Levodropropizin (PhEur
monograph 1535) quy định mức giới hạn tạp chất đối quang Impurity A,
levodropropizin không quá 2,0% đến năm 2015, đã có gần 50 chuyên luận riêng quy
định giới hạn tạp chất ĐPĐQ [130]. Ngoài Dược điển Anh và Dược điển châu Âu,
Dược điển Mỹ 38 cũng có tới hơn 50 chuyên luận thuốc đối quang quy định mức giới
hạn tạp chất đối quang hoặc mức độ tinh khiết đối quang [186].
Như vậy, phương pháp phân tích ĐPĐQ không những có vai trò quan trọng trong
quá trình nghiên cứu phát triển thuốc chứa dược chất đối quang mà còn giữ vai trò
quan trọng trong việc kiểm tra, kiểm nghiệm, giám sát chất lượng thuốc đối quang đã
được cấp phép [47], [88], [160], [198].
1.1.1.4. Tình hình nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang ở Việt Nam
Việc nghiên cứu phân tích và quản lý chất lượng các thuốc đối quang tại Việt Nam còn
nhiều hạn chế và mới được quan tâm trong những năm gần đây. Dược điển Việt Nam IV
xuất bản năm 2009, mới chỉ có 03 chuyên luận quy định mức giới hạn tạp chất đối
quang cho các dược chất dexchlorpheninramin maleat (giới hạn ĐPĐQ ≤ 1,0%);
lamivudin (giới hạn ĐPĐQ ≤ 0,3%, phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng cột sắc
ký pha tĩnh gắn β-CD) và timolol (giới hạn đồng phân hữu tuyền ≤ 2,0%, phân tích bằng
phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký pha tĩnh gắn amylose) [4].
Trong những năm gần đây, mới chỉ có một số ít các nghiên cứu kiểm tra chất
lượng nguyên liệu, chế phẩm thuốc đối quang được thực hiện và công bố như:
- Định lượng R-omeprazol bằng HPLC với cột sắc ký Chiralcel OD-H (250 x 4,6
mm; 5 µm) cùng hệ pha động n-hexan : ethanol của các tác giả Lê Trung Hậu, Nguyễn
Đức Tuấn năm 2014. Phương pháp phù hợp để định lượng tạp R-omeprazol trong
nguyên liệu và chế phẩm viên nén esomeprazol với mức giới hạn tạp chất  0,2% [14].
- Phân tích tạp ĐPĐQ của nguyên liệu omeprazol bằng phương pháp HPLC sử
dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh hoạt quang AGP (Chiral AGP 150 x 4,6 mm, 5 µm) với
pha động chứa MeCN : dung dịch đệm NaH2PO4 10 mM pH 5, tỷ lệ 10 : 90 của các
tác giả Lê Đình Chi, Thái Nguyễn Hùng Thu năm 2013. Phương pháp có độ đúng,
chính xác đáp ứng yêu cầu và phù hợp để xác định giới hạn tạp chất R-omeprazol
trong các mẫu nguyên liệu esomeprazol [8].
- Phân tích ĐPĐQ của amlodipin bằng phương pháp CE sử dụng dung dịch điện ly
nền chứa tác nhân hoạt quang CM-β-CD của tác giả Lê Đình Chi và Thái Nguyễn
-7-


Hùng Thu năm 2013. Phương pháp có LOD đối với R-amlodipin là 3,1 µg/ml [9].
- Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ: phân tích các ĐPĐQ của chlorpheniramin,
dexchlorpheniramin bằng HPLC với cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang β-CD; phân
tách các ĐPĐQ của amlodipin bằng HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang
AGP và phân tích ĐPĐQ của lamivudin bằng phương pháp CE với dung dịch điện ly
nền chứa tác nhân đối quang CM-β-CD của Lê Đình Chi và cộng sự năm 2012 [7].
- Ứng dụng tác nhân đối quang hydroxybutyl-β-CD trong phân tích ĐPĐQ của
promethazin bằng phương pháp CE của Lê Thị Thu Cúc, Từ Thị Minh Tâm và cộng
sự năm 2011. Phương pháp có thời gian phân tích khá dài (khoảng 40 phút) và thích
hợp để xác định tạp chất đối quang promethazin trong chế phẩm thuốc [11].
- Phân tích các ĐPĐQ của ketoconazol bằng phương pháp CE với dung dịch điện
ly nền chứa tác nhân đối quang hydroxybutyl-β-CD của Lê Thị Thu Cúc và cộng sự
năm 2011. Phương pháp có độ phân giải giữa hai đồng phân khoảng 2,6 và độ đúng,
chính xác đáp ứng yêu cầu [12].
- Xác định độ tinh khiết quang học của dẫn chất cis-N-alkyl-phthalazinon bằng
phương pháp HPLC dùng pha tĩnh bất đối là dẫn xuất tris (3,5-dimethylphenyl
carbamat) cellulose của tác giả Chương Ngọc Nãi và cộng sự năm 2011 [18].
Ngoài các nghiên cứu định lượng ĐPĐQ trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm
thuốc như đã nêu trên, cho đến nay tại nước ta mới chỉ một nghiên cứu phân tích, định
lượng thuốc đối quang trong mẫu dịch sinh học được công bố. Năm 2002, Bùi Tùng
Hiệp, Lê Quang Nghiệm và cộng sự đã tiến hành chiết tách chlorpheninramin trong
các mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với diethylether sau khi đã
kiềm hóa mẫu bằng dung dịch KOH 5%. Dung dịch mẫu sau khi chiết được sắc ký qua
cột cyanopropyl để loại tạp chất và ảnh hưởng của nền mẫu trước khi tiến hành phân
tách các ĐPĐQ của chlorpheninramin trên cột sắc ký gắn pha tĩnh đối quang dẫn xuất
của amylose. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp có khoảng tuyến tính từ 2 –
20 ng/ml; độ lặp lại liên ngày với giá trị RSD khoảng 20% [13].
Như vậy, mới chỉ có một số ít các nghiên cứu phân tách thuốc có ĐPĐQ được
triển khai. Vấn đề nghiên cứu phân tách các ĐPĐQ trong kiểm tra chất lượng thuốc và
đặc biệt là trong nghiên cứu sinh khả dụng (SKD), tương đương sinh học (TĐSH) các
thuốc racemic chứa ĐPĐQ có tác dụng dược lý khác nhau gần như chưa được triển
khai và thực hiện tại Việt Nam.
-8-


1.1.2. Phương pháp phân tích đồng phân đối quang
1.1.2.1. Nguyên tắc chung
Phân tích ĐPĐQ là một trong những chủ đề khó trong hóa phân tích do bản chất lý hóa
giống nhau của các đồng phân. Trên thực tế, ĐPĐQ trong hỗn hợp racemic có đáp ứng
giống nhau và không thể phân tách với các điều kiện phân tích thông thường. Đặc
điểm thường được sử dụng để phân tách hai ĐPĐQ của một hỗn hợp racemic bằng các
phương pháp phân tích hóa lý là khả năng tương tác khác nhau của các ĐPĐQ đối với
một chất chọn lọc hoạt quang (chiral selector) xác định.
Trong dung dịch, sự tương tác giữa tác nhân chọn lọc hoạt quang (Re-S) và các
đồng phân hữu tuyền R-A hoặc tả tuyền S-A tạo thành các phức hợp không có tính
hoạt quang (diastereomers) có thể được mô tả bằng các phương trình phản ứng:
R  
R  - A  Re S K

 R  A  (Re S)
S
S - A  Re S K


S   A  (Re S)

Hỗn hợp các phức hợp phi đối quang tạo thành hoặc có các đặc tính hóa lý khác
nhau hoặc có năng lượng liên kết và độ bền khác nhau, được phân tách bằng các
phương pháp phân tích hóa lý phù hợp như GC, HPLC hoặc CE [24], [78], [109].
Sự khác biệt về hằng số tạo phức, các đặc điểm hóa lý cũng như sự khác biệt về độ
bền của các phức hợp phi đối quang tạo thành thường được giải thích bằng mô hình
tương tác ba điểm của Easson–Stedman. Theo các tác giả, giữa chiral selector và đồng
phân đối quang có ba điểm tương tác trong đó có ít nhất 1 trong 3 điểm tương tác này
đặc hiệu với một ĐPĐQ nhất định. ĐPĐQ có cấu trúc phù hợp sẽ liên kết với chiral
selector bằng ba cặp liên kết bao gồm cả cặp liên kết đặc hiệu để tạo phức hợp, trong
khi đó ĐPĐQ còn lại do cấu trúc không phù hợp nên không thể hình thành cặp liên kết
đặc hiệu với chiral selector mà chỉ tạo phức thông qua các liên kết không đặc hiệu. Do
vậy, hằng số tạo phức và độ bền của các phức hợp diastereomer tạo thành sẽ có giá trị
khác nhau [85]. Tuy vậy, mô hình Easson–Stedman mới chỉ giải thích sự tương tác
giữa ĐPĐQ với chất chọn lọc hoạt quang từ một phía, chưa phản ánh bản chất của sự
tương tác (lực hút hoặc đẩy giữa các tiểu phân) trong các phức hợp [50], [85]. Để giải
thích sự hình thành phức hợp diastereomer, bên cạnh mô hình tương tác ba điểm còn
có các mô hình khác như mô hình tương tác Van der Waal hình thành các liên kết
hydro hay liên kết π-π, tương tác lưỡng cực… giữa các phân tử và nhóm chức của
-9-


chúng (Hình 1.2) hay sự liên kết theo kiểu “phức lồng” giữa phân tử ĐPĐQ và “hốc”
chọn lọc đối quang (chiral cavity) trong cấu trúc tác nhân chọn hoạt quang (Hình 1.3).

Hình 1.2. Liên kết tạo phức giữa amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat) với
(a): (1S, 2R)-(+)-norephedrin; (b): (1R, 2S)-(-)-norephedrin [106].

Hình 1.3. Cấu trúc“phức lồng” của R-propranolol với heptakis(2,3-di-O-acetyl-6-Osulfo)-β-cyclodextrin trong (a): dung môi; (b): nước [123].
Sự khác biệt giữa các hằng số tạo phức KR, KS và sự khác biệt về độ bền của các
phức hợp tạo thành giữa chất chọn lọc hoạt quang với các đồng phân tả tuyền hoặc
hữu tuyền là cơ sở hóa lý của việc phân tích ĐPĐQ bằng phương pháp sắc ký hoặc
điện di [24], [30], [32], [78], [109]. Để phân tách các ĐPĐQ, tác nhân chọn lọc hoạt
quang thường được thêm vào hệ thống phân tích theo cách trực tiếp hoặc gián tiếp.
 Theo cách gián tiếp: Hai ĐPĐQ được tạo dẫn chất với một hợp chất đối quang khác
để tạo ra hai sản phẩm không đối quang ở ngoài hệ thống phân tích. Các sản phẩm của
quá trình tạo dẫn chất sẽ có tính chất hóa lý khác nhau nhiều hơn so với các ĐPĐQ
ban đầu và được phân tích bằng phương pháp sắc ký hoặc điện di thông thường.
- 10 -


 Theo cách trực tiếp: Chất chọn lọc hoạt quang được đưa trực tiếp vào hệ thống phân
tích. Khi mức độ tương tác giữa hai ĐPĐQ với chất chọn lọc hoạt quang khác biệt đủ
lớn, các phức hợp tạm thời giữa các ĐPĐQ và tác nhân chọn lọc hoạt quang sẽ được
tách riêng ngay trên hệ thống phân tích [84], [164], [187].
So với phương pháp trực tiếp thì phương pháp gián tiếp có một số nhược điểm như:
tốn thời gian xử lý mẫu; tác nhân chọn lọc hoạt quang phải có độ tinh khiết cao; chỉ áp
dụng được đối với các ĐPĐQ có chứa nhóm chức hoạt động hóa học như amin,
hydroxyl, carboxylic… để phản ứng tạo phức diễn ra với tốc độ và hiệu suất đủ lớn.
Thông thường, không dễ dàng giải quyết tất cả các vấn đề này trong quá trình thực
nghiệm nên phương pháp phân tích gián tiếp ít được áp dụng trong thực tế. Phương
pháp gián tiếp chỉ áp dụng trong trường hợp phương pháp trực tiếp không thể áp dụng
được hoặc khi cần phương pháp phân tích có độ nhạy cao [77], [78], [109].
1.1.2.2. Phân loại tác nhân chọn lọc hoạt quang
Tác nhân chọn lọc hoạt quang đóng vai trò quan trọng trong phân tích ĐPĐQ, dựa trên
phản ứng và ái lực khác nhau giữa tác nhân chọn lọc hoạt quang và các đồng phân tả
tuyền, hữu tuyền mà các phức hợp phi đối quang với các đặc điểm hóa lý, năng lượng
liên kết và độ bền vững khác nhau được hình thành, trên cơ sở đó các ĐPĐQ trong hỗn
hợp được phân tách khỏi nhau. Chính vì vậy, trong quá trình phát triển phương pháp
phân tích ĐPĐQ, người ta luôn chú ý nghiên cứu, tìm kiếm tác nhân chọn lọc hoạt
quang phù hợp. Trên thực tế, tác nhân chọn lọc hoạt quang khá phổ biến, đa dạng về
nguồn gốc và cấu trúc hóa học. Tuy vậy chỉ có một số ít các chất chọn lọc hoạt quang
có ái lực khác nhau với các ĐPĐQ của một hỗn hợp racemic [24], [77], [78], [109].
Dựa trên nguồn gốc, bản chất hóa học và cơ chế tạo phức, các tác giả Alain Berthod
[24], Gerhard K.E. Scriba và cộng sự [78] đã chia tác nhân chọn lọc hoạt quang thành
năm nhóm chính:
 Nhóm 1: Một số protein như albumin huyết thanh người (HSA), albumin huyết
thanh bò (BSA); α1- acid glycoprotein (AGP); ovalbumin trong trứng gà…; một số
cyclopeptid và một số kháng sinh nhóm macrocyclic glycopeptid (vancomycin,
teicoplanin, avoparcin, tubocuracin…). Các chất thuộc nhóm 1, có bản chất là các chất
hoạt quang tự nhiên, phân tử có nhiều trung tâm bất đối xứng có thể tạo phức hợp với
ĐPĐQ theo nhiều cơ chế khác nhau [48], [78], [79]. Ví dụ, cấu tạo và các vị trí hình
thành liên kết với các thuốc/ ĐPĐQ của phân tử HSA được trình bày ở Hình 1.4 [78].
- 11 -


Hình 1.4. Cấu tạo, vị trí hình thành liên kết giữa HSA và các ĐPĐQ
Chú thích hình: HSA: dải ruy băng, các phối tử (thuốc hoặc ĐPĐQ): quả cầu tô màu.
 Nhóm 2: Các oligosaccharid không vòng và các dẫn chất polysaccharid (chủ yếu là
các dẫn chất của cellulose và amylose) như các dẫn chất ester, benzoat, carbamat của
amylose hay cellulose... Các chất thuộc nhóm này đều là các chất hoạt quang tự nhiên,
tạo phức hợp với ĐPĐQ thông qua liên kết hydro, liên kết π-π hay tương tác lưỡng
cực... [109], [139], [202]. Cấu tạo một số pha tĩnh HPLC gắn chất chọn lọc hoạt quang
dẫn chất của cellulose và amylose được trình bày ở Hình 1.5 [109].

Hình 1.5. Cấu tạo pha tĩnh đối quang dẫn chất polysaccharid cuả một số cột HPLC.
- 12 -


Ngoài các liên kết, tương tác nêu trên các chất chọn lọc hoạt quang thuộc nhóm
hai còn có thể tạo phức với ĐPĐQ thông qua cấu trúc thứ cấp “xoáy ốc” của phân tử
chất chọn lọc hoạt quang.
 Nhóm 3: Các chất chọn lọc hoạt quang phân tử lượng nhỏ, tạo phức hợp với ĐPĐQ
dựa trên tương tác 3 điểm trong đó có ít nhất một tương tác giữa tác nhân chọn lọc
hoạt quang và ĐPĐQ là liên kết π-π giữa một nhóm cho điện tử π và một nhóm nhận
điện tử π (chất chọn lọc hoạt quang kiểu Pirkle). Cấu trúc chung của các chất chọn lọc
hoạt quang nhóm này thường có: một nhóm chức acid hoặc base liên kết với vòng
thơm (có khả năng hình thành các liên kết π); một nhóm chức/cấu trúc phân cực mạnh
có khả năng hình thành liên kết hydro và một nhóm chức/cấu trúc không phân cực
tương tác với phân tử ĐPĐQ bằng các lực liên kết Van der Wall. Nhóm chức/cấu trúc
không phân cực thường có cấu tạo “cồng kềnh” quyết định hình dạng cấu trúc phân tử
chất chọn lọc hoạt quang và ít nhất một trong 3 nhóm chức/cấu trúc nêu trên của tác
nhân chọn lọc hoạt quang sẽ phân bố ở gần vị trí nguyên tử carbon bất đối của phân tử.
Các chất chọn lọc hoạt quang nhóm này rất đa dạng, có cả các chất có nguồn gốc tự
nhiên và các chất bán tổng hợp hóa học như dẫn chất 3,5-dinitrobenzoyl của 1,2diaminocyclohexan; 3,5-dinitrobenzoyl leucin; 3,5-dinitrobenzoyl phenylglycin... hay
các dẫn chất của quinin, quinidin như tert-butylcarbamoylquinin... Hiện có tới gần 100
loại cột sắc ký lỏng mà thành phần pha tĩnh là silicagen liên kết với chất chọn lọc hoạt
quang thuộc nhóm này. Cấu tạo một số pha tĩnh của cột sắc ký lỏng chứa tác nhân
chọn lọc hoạt quang nhóm 3 được trình bày ở Hình 1.6 [164], [187].

Hình 1.6. Cấu tạo một số pha tĩnh liên kết tác nhân hoạt quang kiểu Pirkle
- 13 -


 Nhóm 4: Các chất chọn lọc hoạt quang mà cấu trúc phân tử có các “hốc” chọn lọc
đối quang tạo “phức lồng” với đồng phân, bao gồm các cyclodextrin (CD) và dẫn chất,
các ether vòng và một số polymer... Trong nhóm này, CD và dẫn chất là tác nhân chọn
lọc hoạt quang tự nhiên, còn ether vòng và các polymer thường là tác nhân chọn lọc
hoạt quang tổng hợp hoặc bán tổng hợp hóa học.
 Cyclodextrin và dẫn chất: Cyclodextrin (CD) là các oligosaccharid mạch vòng do
các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết α(1-4) tạo thành. Các CD khác
nhau ở số đơn vị glucose và số lượng các nhóm hydroxyl. Các CD có cấu trúc hình
nón cụt rỗng với một “hốc” có bề mặt phía trong kỵ nước và phía ngoài thân nước.
Vành hẹp của hốc được tạo thành từ các nhóm 6-OH sơ cấp, vành rộng hơn được tạo
thành từ các nhóm 2- và 3-OH thứ cấp. Các liên kết -O- của dị vòng quay vào trong
tạo hốc rỗng kỵ nước. Cấu tạo chung của các CD được trình bày ở Hình 1.7, các đặc
điểm hóa lý của một số CD tự nhiên được trình bày ở Bảng 1.2 [53], [181], [196].
Bảng 1.2. Tính chất hóa lý của một số cyclodextrin tự nhiên

Số đơn vị glucose

α
6

Loại cyclodextrin
β
7

γ
8

Số nhóm hydroxyl

18

21

24

Trọng lượng phân tử (MW)

972

1135

1297

0,47-0,52

0,60-0,64

0,75-0,85

Tính chất

Đường kính trong của “hốc” (nm)
Đường kính ngoài của “hốc” (nm)

1,46 ± 0,05 1,54 ± 0,04

1,75 ± 0,04

Thể tích “hốc” (nm3)

0,176

0,346

0,510

Độ tan trong nước ở 250C (g/100ml)

14,50

1,85

23,20

Hình 1.7. Cấu tạo và kích thước hốc kỵ nước của các cyclodextrin.
- 14 -


Khi thay đổi hóa học ở các nhóm -OH tự do của CD bằng cách cho phản ứng tạo
liên kết với các nhóm thế khác nhau, người ta thu được các dẫn chất CD có mức độ
phân cực, độ tan, khả năng liên kết tạo phức… khác nhau [53], [181], [196]. Cấu trúc
của một số dẫn chất CD được trình bày ở Hình 1.8 [196].

Hình 1.8. Cấu trúc của một số tác nhân hoạt quang dẫn chất cyclodextrin
Sự hình thành “phức lồng” giữa ĐPĐQ (chất lạ) và tác nhân chọn lọc hoạt quang
dẫn chất CD liên quan đến quá trình “lồng” các gốc thân dầu của phân tử chất lạ vào
“hốc rỗng” của các CD thay thế cho phân tử dung môi (thông thường là nước) ở phía
trong của hốc rỗng [152], [196]. Các phân tử lạ ăn khớp toàn bộ phân tử hoặc phần kỵ
nước với hốc rỗng của phân tử CD. Tương tác kỵ nước với riêng hốc rỗng là không đủ
để có thể tách các chất ĐPĐQ, các liên kết yếu giữa các nhóm thế ở trung tâm bất đối
trong cấu trúc chất phân tích và các nhóm hydroxyl thứ cấp và/hoặc sơ cấp của CD
chịu trách nhiệm chính cho cơ chế nhận diện chọn lọc đối quang. Tùy vào chất tan,
loại CD và môi trường thực nghiệm mà quá trình lồng phân tử chất tan vào phân tử
CD có thể xảy ra ở vành sơ cấp hoặc vành thứ cấp [53], [152]. Các dẫn chất CD có các
nhóm -OH tự do liên kết với các nhóm thế khác nhau nên mức độ phân cực và khả
năng tạo phức với ĐPĐQ của các dẫn chất CD khác so với các CD tự nhiên. Tùy thuộc
vào số lượng các nhóm –OH tự do, số lượng và cấu trúc của các nhóm thế mà các dẫn
chất CD sẽ có độ phân cực, độ tan, khả năng và cơ chế tạo phức khác nhau. Ngoài
tương tác kỵ nước và hình thành “phức lồng” với các ĐPĐQ, các dẫn chất CD có thể
có thêm tương tác ion trong trường hợp nhóm thế tích điện hoặc tương tác π-π khi các
nhóm thế có chứa nhân thơm [53], [152].
 Các ether dạng vòng [30], [142], [196]: Các ether dạng vòng là các polyether
macrocyclic có khả năng tạo phức chất với các cation vô cơ và hữu cơ. Sự thay đổi ở
vòng ether với việc có thêm bốn nhóm carboxylic làm cho nhóm này có thể sử dụng
làm chất chọn lọc đối quang. Phức hợp giữa ether dạng vòng và các ĐPQH có nhóm
chức amin được tạo thành nhờ các liên kết hydro giữa nhóm chức với các nguyên tử
- 15 -


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×