Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------

ĐOÀN HOÀNG THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO
GỐC MỠ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ
BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƢỚNG TRONG ĐIỀU
TRỊ VẾT THƢƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................... Error! Bookmark not defined.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng . Error! Bookmark not defined.
1.2. Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thƣơng . Error! Bookmark not defined.

1.2.1. Tổn thƣơng da và nhu cầu chế tạo chế phẩm điều trị vết thƣơng ....... Error!
Bookmark not defined.
1.2.2. Một số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thƣơng từ nuôi cấy tế bào . Error!
Bookmark not defined.
1.3. Vai trò tế bào gốc trong liền vết thƣơng ........ Error! Bookmark not defined.
1.4. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ..................... Error! Bookmark not defined.
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark
not defined.
2.1. Đối tƣợng, nguyên - vật liệu nghiên cứu ....... Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................ Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu ................. Error! Bookmark not defined.
2.1.3. Trang thiết bị và vật tƣ ................................ Error! Bookmark not defined.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: .............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào ................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Nhân rộng tế bào ......................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào: ........................... Error! Bookmark not defined.
2.2.4. Xác định khả năng tạo dòng (colony) của tế bàoError!

Bookmark

not

defined.
2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào da nuôi
cấy ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.5.1. Đánh giá ảnh hƣởng của tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi
............................................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.5.2. Đánh giá ảnh hƣởng của tấm tế bào gốc mô mỡ lên khả năng di cƣ của
nguyên bào sợi ...................................................... Error! Bookmark not defined.


2.2.5.3. Đánh giá ảnh hƣởng của tế bào gốc mỡ đến tăng sinh tế bào sừng . Error!
Bookmark not defined.
2.2.5.4. Đánh giá ảnh hƣởng của tế bào gốc mỡ đến sự di cƣ tế bào sừng .. Error!
Bookmark not defined.
2.2.6. Phƣơng pháp chế tạo tấm tế bào gốc mỡ cho thí nghiệm đồng nuôi cấy Error!
Bookmark not defined.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................... Error! Bookmark not defined.
3.1. Đặc điểm phân lập và hình thái tế bào ........... Error! Bookmark not defined.
3.2. Khả năng tạo dòng của tế bào (CFU-F) ......... Error! Bookmark not defined.

3.3. Ảnh hƣởng tế bào gốc mỡ lên sự tăng sinh và di cƣ tế bào da qua thí nghiệm
đồng nuôi cấy ........................................................ Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Tác động của tế bào gốc mỡ đến nguyên bào sợiError!

Bookmark

not

defined.
3.3.2. Tác động của tấm tế bào gốc mỡ đến tế bào sừngError! Bookmark not
defined.
BÀN LUẬN .............................................................. Error! Bookmark not defined.
4.1. Về đặc điểm tế bào phân lập .......................... Error! Bookmark not defined.
4.2. Tinh lọc tế bào, đặc điểm hình thái và khả năng tạo colony ................. Error!
Bookmark not defined.
4.3. Ảnh hƣởng của tế bào gốc mỡ lên tế bào da nuôi cấy . Error! Bookmark not
defined.
4.3.1. Ảnh hƣởng của tế bào gốc tới nguyên bào sợi daError!

Bookmark

not

defined.
4.3.2. Ảnh hƣởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào sừngError! Bookmark not
defined.
4.4. Chế phẩm tấm tế bào gốc trên giá đỡ ............ Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ............................................................... Error! Bookmark not defined.
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................60


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lôi cuốn nhất hiện nay.
Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã đƣợc y học thế giới lựa chọn nhƣ là liệu pháp hữu
hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy,
xƣơng khớp…Trên thế giới, có một số nguồn tế bào gốc đƣợc đƣa vào ứng dụng
nhƣ tế bào gốc tủy xƣơng và tế bào gốc máu cuống rốn, các tế bào gốc từ 2
nguồn này chủ yếu là tế bào gốc tạo máu nên đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu
và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh cần có sự tái tạo thuộc hệ thống trung
mô thì ít đƣợc ứng dụng. Trong khi đó, các bệnh của trung mô lại rất thƣờng gặp
nhƣ các vết thƣơng, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc
khác đang đƣợc kỳ vọng nhiều chính là tế bào gốc phôi, mặc dù có tiềm năng lớn
nhƣng việc nghiên cứu và sử dụng còn rất khó khăn về công nghệ và đặc biệt là
bị cản trở bởi vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy đi
một phôi vốn có thể trở thành một con ngƣời). Gần đây, nhiều nghiên cứu tập
trung khai thác các tế bào gốc từ phần phụ của thai nhƣ bánh rau, dây rốn. Thành
công về công nghệ đã có thể tách và nhân lên các tế bào gốc nhƣng chỉ có những
bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh ra mới có hy vọng đƣợc
dùng các nguồn tế bào gốc này. Hiện nay, chỉ có số lƣợng rất ít ngƣời đƣợc lƣu
giữ dây rốn hay bánh rau sau khi sinh ra, đồng thời chi phí cũng rất tốn kém và
xác suất ngƣời lƣu trữ mô lại có các bệnh cần đƣợc điều trị bằng các tế bào gốc
này cũng không phải cao.
Tế bào gốc mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành
nhiều dòng khác nhau. Mô mỡ là loại mô có sẵn với số lƣợng lớn và dễ dàng thu
hồi nên đây là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tƣơng lai có thể
sử dụng để ghép tự thân và đặc biệt là không gặp phải những vấn đề y đức. Đối
với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thƣơng thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một
trong những dạng tế bào quan trọng di cƣ đến vùng tổn thƣơng để thực hiện
nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thƣơng.


Tế bào gốc trung mô đã đƣợc nghiên cứu tách từ mô mỡ nhƣng trong
thành phần tế bào đƣợc tách còn nhiều dạng tế bào khác nhƣ bạch cầu, hồng
cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định chính xác cần sử dụng
bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế bào trong hỗn dịch tế bào mới tách
là đủ để cho một lần ghép điều trị vết thƣơng. Do đó, cần nghiên cứu xây dựng
hoàn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mô. Nếu nhƣ các tế bào
gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cƣ của 2 loại tế
bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các
nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hƣớng cho các
nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thƣơng thuộc
hệ thống trung mô đặc biệt là vết thƣơng và vết bỏng.
Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thƣơng bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, cụ
thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu ngƣời mang các
vết thƣơng mạn tính. Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 ngƣời
cần đƣợc điều trị bằng da nhân tạo. Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu ngƣời bị loét
và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị.
Tại Việt Nam hàng năm ƣớc tính khoảng 791.000 ngƣời gặp tai nạn về
bỏng [8]. Tuy chƣa có con số thống kê cụ thể nhƣng chỉ tính riêng tại Viện Bỏng
Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị thì nhu cầu về
ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc
mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế
bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong
điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau:
1. Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều
kiện nuôi cấy invitro
2. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng
Diễn biến liền vết thƣơng nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu,
viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo [3]. Tuy quá trình liền vết thƣơng có nhiều
cơ chế phức tạp nhƣng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn
thƣơng. Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con ngƣời cần có da. Thành phần tế
bào da ngƣời chủ yếu bao gồm 2 loại là nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào
sừng (Keratinocytes). Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào
sừng tạo ra lớp biểu bì. Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhƣng
lại tƣơng tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Hai loại tế bào
này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thƣơng da. Khi da bị tổn
thƣơng, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng
trƣởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thƣơng tăng sinh che phủ bề
mặt làm lành vết thƣơng.
Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn
tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu
mô hoá và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu
mô bám và trƣợt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết
thƣơng. Chúng tạo ra protein đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và
toàn vẹn của mô. Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số
yếu tố tăng trƣởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thƣơng nhƣ TGF-β,
PDGF, KGF...[44], [45], [67], [76]. Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành
myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thƣơng nhanh hơn. Nguyên bào sợi
còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết
thƣơng. Ngày thứ 2 sau khi bị thƣơng bị bỏng, nguyên bào sợi xuất hiện ở vết
thƣơng do sự dịch chuyển từ mô liên kết bên cạnh. Sản xuất các siêu sợi actin


của cơ trơn chuyển nguyên bào sợi thành myofibroblast, gây co kéo làm hẹp vết
thƣơng (1-2 mm/24 giờ). Tổng hợp men Metalloproteinase, collagenase gây
thoái huỷ protein khoảng kẽ; men Stomalysin thoái huỷ protein màng nền. Điều
hoà tổng hợp và thoá biến collagen thông qua FGF-, TGF-. Sắp xếp collagen
theo cấu trúc mô. Trong khoảng thời gian từ 5-7 ngày, các nguyên bào sợi tăng
sinh, và đƣợc kích thích tiết PDGF, TGF-beta để điều khiển quá trình tổng hợp
và lắng đọng các thành phần đệm gian bào bao gồm: fibronectin, laminin,
glycosaminoglycans (GAGs) và collagen. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai
đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thƣơng đã liền.
Tế bào sừng (Keratinocytes) tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể. Biểu bì
gồm nhiều lớp tế bào biểu mô lát tầng sừng hóa, thành phần chính là các tế bào
sừng gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau [1]. Lớp mầm hay còn gọi
là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái sinh nhiều lần
và nhanh trong suốt cuộc sống của con ngƣời. Giữa các tế bào sừng có các cầu
nối gian bào làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau. Các tế bào lớp đáy có cấu
trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự
tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào
biệt hoá ở phía trên. Trong các tế bào của lớp mầm biểu bì thì chỉ có 10% là tế
bào mầm biểu bì còn lại là các tế bào đang ở các giai đoạn gián phân. Bình
thƣờng sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy
của biểu bì nhƣng khi da bị tổn thƣơng thì chúng tăng cƣờng phân chia để tạo ra
nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô sẽ di cƣ vào trung tâm của vết thƣơng
ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân
chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực
hiện chức năng bảo vệ của biểu bì. Trong quá trình di cƣ chúng cần đệm gian
bào đủ chất lƣợng nhƣ trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám
vào và trƣợt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thƣơng. Trong
trƣờng hợp các vết thƣơng mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thƣơng không


hồi phục, vết thƣơng trở nên xơ sợi, các nguyên bào sợi nghèo nàn hoặc không
thể thực hiện đầy đủ chức năng nên các tế bào biểu mô không thể phân chia hay
di cƣ vào vết thƣơng. Chính các mối tƣơng tác chặt chẽ giữa hai loại tế bào trên
mà trong điều trị cần chú ý tới các điều kiện để cả hai cùng tăng sinh, cùng biệt
hoá, cùng thực hiện chức năng liền vết thƣơng thì vết thƣơng mới nhanh liền.

Hình 1. Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau
của quá trình liền vết thương
(Nguồn: Werner S et al (2003), Physiol. Re;83:835-870), [79].
A. 12-24 giờ sau bị thương, nguyên bào sợi quanh tổn thương được kích
hoạt.

B. Từ 3-7 ngày sau bị thương, nguyên bào sợi di cư vào vùng tổn thương,
tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào.
C. Từ 1-2 tuần sau bị thương, mô hạt hình thành, nguyên bào sợi chuyển
dạng thành myofibroblast gây co hẹp vết thương và tiết collagen.


1.2. Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thƣơng
1.2.1. Tổn thương da và nhu cầu chế tạo chế phẩm điều trị vết thương
Nhƣ chúng ta đã biết da là cơ quan lớn nhất của cơ thể và có vai trò là một
cơ quan bảo vệ cơ thể trƣớc các tác động với môi trƣờng xung quanh. Da bảo vệ
các cơ quan phía dƣới da và bảo vệ cơ thể chống lại các mầm bệnh và vi sinh
vật. Da trực tiếp tiếp xúc với các yếu tố độc hại tiềm tàng nhƣ vi khuẩn, nhiệt,
các tác động cơ học và hóa học. Trong 25 năm qua, các cố gắng lớn đã tạo ra các
vật liệu thay thế mang tính bắt chƣớc da ngƣời [50]. Ở da công nghệ mô, các vật
liệu tổng hợp hay sinh học đƣợc kết hợp với các tế bào nuôi cấy để tạo ra các mô
có chức năng của da [74].
Các vật liệu thay thế da này đƣợc chế tạo dựa trên các tiến bộ về công nghệ
mô và đã đƣợc ứng dụng trong lâm sàng, chúng thúc đẩy sự liền vết thƣơng cấp
và mạn tính và đƣợc sử dụng nhƣ một cơ quan phức hợp cho hệ thống thử
nghiệm cơ bản hoặc các nghiên cứu về dƣợc [59]. Một vấn đề chính trong việc tăng
sinh tế bào là đáp ứng yêu cầu cần đạt đủ số lƣợng các tế bào cần thiết, trong khi
vẫn đảm bảo đƣợc tính chất bình thƣờng của tế bào và cả chức năng của chúng. Các
tế bào này sau đó chỉ đƣợc sử dụng cho các mục đích hoặc là tạo vật liệu thay thế da
phù hợp cho cấy ghép hoặc là cho các thử nghiệm in vitro [27], [66].

Có rất nhiều lý do gây nên tổn thƣơng da bao gồm các hội chứng do gen,
chấn thƣơng cấp tính, vết thƣơng mạn tính hoặc các can thiệp ngoại khoa. Một
trong các lý do phổ biến nhất là tổn thƣơng da do bỏng. Ngay khi da bị tổn
thƣơng, hàng loạt các vấn đề phức hợp bắt đầu diễn ra: các tế bào miễn dịch bị
lôi kéo tới vùng thƣơng tổn, mô đệm mới đƣợc sinh ra bởi nguyên bào sợi, tiếp
theo là tái biểu mô hóa do tế bào sừng đảm nhiệm và cuối cùng là sự tái phân bố
mạch của vết thƣơng [54]. Quá trình liền vết thƣơng phức tạp này đƣợc kích
thích và kiểm soát bởi các cytokine và các yếu tố tăng trƣởng khác nhau [25].
Kích thƣớc vết thƣơng là yếu tố chủ đạo cho biểu mô hóa. Tổn thƣơng toàn bộ
lớp da với kích thƣớc lớn hơn 1 cm đƣờng kính thì cần phải ghép da để đề phòng


tạo sẹo dẫn đến di chứng về chức năng hay thẩm mỹ [55]. Mảnh ghép hoàn hảo
nên phải sẵn có, không gây đáp ứng miễn dịch, che phủ và bảo vệ nền vết
thƣơng, làm tăng nhanh liền vết thƣơng, ít gây đau và ít tạo sẹo.
Trong trƣờng hợp tổn thƣơng diện tích rộng các tế bào có chức năng liền
vết thƣơng của bệnh nhân không đủ khả năng làm lành tổn thƣơng mà cần phải
ghép da tự thân nhƣng nguồn da tự thân cũng không phải vô hạn nên ghép da tự
thân cũng chỉ cứu đƣợc những bệnh nhân bỏng sâu 50% diện tích cơ thể là chủ yếu.

Trong lĩnh vực điều trị bỏng và chấn thƣơng lớn, mặc dù đã có nhiều tiến
bộ trong cứu chữa nhƣ cắt hoại tử - ghép da ngay, tăng độ giãn rộng của da ghép
[14], sử dụng da đồng loại hay các vật liệu thay thế da khác nhau [9], [10], [11],
[12] nhƣng các rối loạn về protein, thay đổi hệ thống miễn dịch... làm cho vết
thƣơng trở nên chậm lành hay rất khó lành [2], [7].
Ngoài ra chúng ta còn gặp các loại vết thƣơng mạn tính rất khó lành nhƣ
các vết loét do tiểu đƣờng, loét do viêm tắc tĩnh mạch, loét điểm tỳ, loét xạ trị…
mà không thể can thiệp bằng phẫu thuật ghép da nguy cơ thất bại rất cao do khả
năng tiếp nhận mảnh ghép của vết thƣơng rất kém và tình trạng bệnh nhân không
cho phép phẫu thuật. Số lƣợng bệnh nhân này ngày càng tăng cao cùng sự phát
triển kinh tế - xã hội và tuổi thọ con ngƣời [10], [26]. Các vết thƣơng này bị gián
đoạn giai đoạn tăng sinh hoặc tế bào tham gia liền vết thƣơng bị chuyển dạng
[7], [9], [13], [23], [38]. Để khắc phục hạn chế này nhằm thay thế các tế bào đã
tổn thƣơng, công nghệ nuôi cấy tế bào da phát triển.
Từ những năm trƣớc, một số nhà nghiên cứu cho rằng điều trị vết thƣơng
vết bỏng trong tƣơng lai sẽ trở nên đơn giản, nhanh chóng và dễ dàng che phủ
tổn thƣơng sau cắt hoại tử. Nhƣng thực tế, điều đó còn rất xa vời. Khái niệm này
đã dẫn đến một số quan niệm sai trầm trọng dẫn đến việc đƣa ra những hứa hẹn
quá sớm về công nghệ mô da mà chậm đƣợc nhận ra trên thực tế lâm sàng. Khái
niệm sai này là coi da nhƣ một mô giống nhƣ xƣơng sụn và sẽ liên quan đơn
giản tới nơi có thay đổi về công nghệ mô. Dù da không phải là một mô nhƣng là


một tổ chức hoàn toàn tổng hợp mang đến bởi sự kết hợp tế bào từ 3 nguồn gốc
phôi gồm ngoại bì trung bì và ống thần kinh. Những thành công hiện đại về tạo
ra những sản phẩm thay thế da đã trở nên bị hạn chế hơn so với mong đợi và bây
giờ những sản phẩm da công nghệ mô đang đƣợc mô tả nhƣ vật liệu thay thế da
giúp liền vết thƣơng và sửa chữa, thay thế da tạm thời và thƣờng hỗ trợ cho việc
tái sinh. Quá trình liền vết thƣơng, vết bỏng có nhiều cơ chế phức tạp nhƣng kết
quả cuối cùng là tái lập các mô tế bào đã bị tổn thƣơng. Do đó, quan niệm mới
trong điều trị các tổn thƣơng ở bất cứ cơ quan nào trên cơ thể là các tế bào tổn
thƣơng phải đƣợc thay thế bằng các tế bào khỏe mạnh [4].
Cho đến ngày nay, ngƣời ta đã chế tạo đƣợc các tấm nguyên bào sợi, tấm tế
bào sừng, thậm chí cả các tấm vật liệu chứa cả hai loại tế bào trên mà ngƣời ta
gọi là các vật liệu tƣơng đƣơng da hoặc da nhân tạo…[57], [70]. Tuỳ theo nguồn
gốc tế bào sừng trên tấm vật liệu là tự thân hay khác gen đồng loài (gọi tắt là
đồng loài) mà ngƣời ta chế đƣợc vật liệu có tính chất vĩnh viễn (không thải ghép)
hoặc tạm thời.
Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da đƣợc ứng dụng
trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn tính trong thẩm mỹ và nghiên cứu thuốc….
So với ghép da tử thi, các vật liệu này có thuận lợi lớn là không phụ thuộc nguồn
da ngƣời cho, việc sản xuất chúng gần nhƣ vô hạn và hầu nhƣ không có nguy cơ
lây nhiễm bệnh do có thể kiểm soát trƣớc đƣợc nguồn cho tế bào bằng các xét
nghiệm tầm soát các bệnh lây truyền qua ghép mô/tế bào. Có hai thành phần
chính của vật liệu tƣơng đƣơng da là thành phần khuôn và thành phần tế bào.
Thành phần khuôn hay đƣợc sử dụng là collagen, acid hyaluronic, polymer tổng
hợp hoặc sinh tổng hợp. Thành phần tế bào bao gồm các tế bào da nhƣ nguyên
bào sợi, tế bào sừng là hai tế bào chủ yếu, ngoài ra có thể có tế bào sắc tố… Đã
có những sản phẩm thƣơng mại sẵn có trên thị trƣờng nhƣ Epicell, Integra,
Transcyte, Apligraft, Dermagraft…


1.2.2. Một số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào
Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm
sàng, một số tế bào đƣợc nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là:
Tế bào sừng (Keratinocyte) Trong vài thập niên trở lại đây, cấy ghép tế
bào sừng tự thân nuôi cấy đã đƣợc triển khai tại các trung tâm điều trị bỏng lớn ở
Anh, Mỹ, Nhật... Việc cấy ghép tế bào sừng lên vết thƣơng góp phần giải quyết
sự thiếu hụt nguồn da lành. Thành công do ghép tế bào sừng nuôi cấy còn nhiều
hạn chế, do khi đặt tế bào sừng nuôi cấy lên vết thƣơng bỏng sâu, nền vết thƣơng
thiếu các yếu tố trung bì do chƣa hoặc hình thành chậm màng đáy. Để khắc phục
điều đó, ngƣời ta đã sử dụng cấy ghép kết hợp fibroblasts và tế bào sừng [40].
Ứng dụng tế bào sừng nuôi cấy, ngƣời ta đã chế tạo ra các tấm vật liệu thay thế
biểu bì. Để sản xuất vật liệu thay thế biểu bì, một mẩu da sinh thiết khoảng 25cm2 cần phải đƣợc lấy từ bệnh nhân. Công việc này có thể phải kết hợp với lần
phẫu thuật cắt hoại tử của bệnh nhân bỏng. Rồi sau đó, biểu bì đƣợc tách khỏi
lớp trung bì và các tế bào sừng đơn lẻ đƣợc phân lập nhờ enzyme và nuôi cấy
cùng với nguyên bào sợi chuột đã bất hoạt khả năng phân chia. Môi trƣờng nuôi
cấy tăng sinh đƣợc sử dụng có chứa FBS và các chất cần thiết khác; tuy nhiên,
cũng có thể làm tăng sinh các tế bào này trong điều kiện không có tế bào dị loại.
Hiện nay, đã có các vật liệu thay thế biểu bì tự thân đƣợc thƣơng mại hóa cho sử
dụng trên lâm sàng nhƣ: Epicel, EpiDex, EpiBase, MySkin, Laserskin, Bioseed-S.
Đã có một số nghiên cứu thử nghiệm ghép tế bào biểu bì đồng loại nhƣ
Celaderm [17], [42]; tuy nhiên, hiệu quả và tính an toàn của các sản phẩm này
phải đƣợc khẳng định bằng nghiên cứu lâm sàng có đối chứng. Các sản phẩm
đồng loại có lợi ích là giảm chi phí sản xuất so với chi phí sản xuất sản phẩm tự
thân. Hơn bao giờ hết, sự thiếu sót của cả hai sản phẩm là chúng khó bám và do
đó dễ dẫn đến việc tạo thành nốt phồng [80].
Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào có nguồn gốc trung mô, chúng sản
sinh ra collagen có vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa vết thƣơng, phục


hồi cấu trúc và chức năng của mô [5]. Ở mức độ phân tử, lớp trung bì rất quan
trọng cho các tế bào biểu bì phát triển và trƣởng thành chúng tiết ra các yếu tố
nhƣ các sợi fibrin gắn kết, các yếu tố kết dính để gắn biểu bì vào trung bì. Vết
bỏng sâu thiếu các thành phần trung bì hoặc lớp trung bì chƣa hình thành hoặc
hình thành chậm. Cần thiết phải tạo ra một lớp trung bì mới để tạo điều kiện cho
da ghép tự thân hoặc tế bào sừng nuôi cấy che phủ lên vết thƣơng cho kết quả tối
ƣu nhất [40]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đều cho rằng, vật liệu thay thế da lý
tƣởng nhất là phải thay thế đƣợc cả lớp trung bì và biểu bì. Sự tƣơng tác giữa
các yếu tố thuộc lớp biểu bì và trung bì sẽ kích thích sự trƣởng thành của từng
lớp. Boyce và Hansbrough đã tạo ra vật liệu thay thế da hỗn hợp (composite
subtitues) gồm nguyên bào sợi ngƣời nuôi cấy đƣợc cấy lên tấm màng collagenglycosaminoglycan sau đó cho tế bào sừng phát triển lên trên, vật liệu này đã
đƣợc thử nghiệm thành công trên mô hình chuột, nhƣng còn một số hạn chế khi
thử nghiệm lâm sàng. Một xu hƣớng khác, đơn giản hơn và không đòi hỏi cao về
công nghệ đó là sử dụng fibroblasts nuôi cấy đƣa lên vết thƣơng. Nguyên bào
sợi sẽ tổng hợp các thành phần của trung bì, tạo điều kiện cho việc ghép da tự
thân hoặc cấy ghép tế bào sừng thành công [33], [40], [70].
Để điều trị bỏng sâu, cả lớp biểu bì và lớp trung bì của da cần đƣợc thay
thế, việc điều trị bằng tấm tế bào biểu bì đơn thuần sẽ dẫn đến chất lƣợng liền
vết thƣơng thấp. Tƣơng phản với tấm biểu bì nuôi cấy, các cấu trúc trung bì từ
công nghệ có thể dự phòng co kéo vết thƣơng và tạo ra tính bền vững cơ học tốt
hơn. Vật liệu tƣơng đƣơng trung bì và biểu bì phải đƣợc ghép kế tiếp nhau việc
làm cho tuần hoàn hóa trung bì tốt sau khi loại bỏ nền vết thƣơng là cần thiết
trƣớc khi ghép lớp biểu bì [35]. Một số vật liệu này là mảnh ghép đồng loại đã
đƣợc xử lý bằng hóa chất, ví dụ Alloderm không có thành phần tế bào gây ra đáp
ứng miễn dịch thải ghép [77]. Ngƣợc lại, Dermagraft lại có các nguyên bào sợi
từ da bao quy đầu của ngƣời đƣợc nuôi cấy trên lƣới polyglactin có khả năng
giáng hóa [72]. Trong các vật liệu này, các tế bào tiết protein đệm gian bào, hàng


loạt các yếu tố tăng trƣởng và cytokin vào trong vết thƣơng cho đến khi chúng
trải qua quá trình tự hủy bình thƣờng sau vài tuần ghép.
Purdue (1997) sử dụng tấm fibroblasts nuôi cấy là Dermagraft và so sánh
với ghép da tử thi cho 66 bệnh nhân bỏng sâu đƣợc cắt hoại tử. Tác giả nhận
thấy, tấm fibroblasts nuôi cấy có kết quả tốt tƣơng đƣơng với da tử thi trong việc
hình thành mô hạt, kết quả về da ghép tự thân là tƣơng đƣơng, nhƣng tấm
fibroblasts dễ bóc khỏi mô hạt để ghép da tự thân nên không gây chảy máu nhƣ
da tử thi. Tiếp tục theo dõi di chứng bỏng, tác giả nhận thấy vùng ghép
fibroblasts có kết quả rất tốt về thẩm mỹ [61]. Hansbrough (1997) đã đánh giá
khả năng của Dermagraft che phủ vết bỏng sau cắt hoại tử trên 10 vết thƣơng có
so sánh với da tử thi. Tác giả nhận thấy, khả năng bám dính, khả năng sống của
Dermagraft là tƣơng đƣơng da tử thi, kết quả da ghép sống tƣơng đƣơng vùng
ghép da tử thi. Không thấy có biểu hiện thải loại miễn dịch trong khi 4/10 vùng
ghép da tử thi có biểu hiện thải loại lớp thƣợng bì [33].
1.3. Vai trò tế bào gốc trong liền vết thƣơng
Mặc dù có nhiều tiến bộ đáng kể trong y tế và chăm sóc vết thƣơng bằng các
can thiệp ngoại khoa, việc điều trị các tổn khuyết da diện rộng và vết thƣơng mạn
tính vẫn còn là thách thức lớn với y học hiện nay. Trong liền vết thƣơng, tế bào
gốc trung mô đƣợc xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác
nhau [65]. Đã và đang có rất nhiều ngƣời quan tâm cả về khoa học nghiên cứu và
lĩnh vực lâm sàng điều trị vết thƣơng về tiềm năng và vai trò của các trị liệu tế
bào dựa trên MSC trong việc kích thích tăng nhanh quá trình sửa chữa và tái tạo
mô vết thƣơng. Các nghiên cứu với MSC tủy xƣơng đã cho thấy việc điều trị vết
thƣơng bằng tế bào MSC tủy xƣơng đều làm tăng nhanh quá trình liền vết
thƣơng, tăng quá trình biểu mô hóa và tăng tạo mạch [26], [82]. Ngƣời ta thấy.
MSC làm tăng nhanh liền vết thƣơng ở cả vết thƣơng cấp tính ở chuột có tăng và
không gây tăng đƣờng máu và cả ở vết thƣơng cấp tính trên ngƣời [26].


Các nghiên cứu gần đây gợi ý rằng, MSC có khả năng tiết ra nhiều
cytokin và các chất hóa ứng động khác nhau vốn có vai trò quan trọng cho hoạt
động sửa chữa mô, thậm chí trên cả các mô hình tổn thƣơng thận và não [73].
MSC làm nhanh quá trình liền vết thƣơng là do ít nhất có 2 cách thức khác nhau
bao gồm thông qua tăng biệt hóa tế bào và thông qua các tín hiệu ngoại lai. Các
MSC tủy xƣơng đã đƣợc báo cáo là có thể biệt hóa thành tế bào sừng trong các
nghiên cứu có sử dụng EGFP [82]. Trong các vết thƣơng này, một phần trăm các
tế bào có biểu hiện EGFP dƣơng tính ở cả trung bì và biểu bì cũng có biểu hiện
với keratin vốn là marker chuyên biệt của tế bào sừng. Tuy nhiên, với tỷ lệ đƣợc
đƣa ra là quá thấp nên MSC vẫn chƣa đƣợc coi chắc chắn là có trách nhiệm đối
với quá trình sửa chữa mô thông qua tăng biệt hóa chuyển dạng và tái sinh hoặc
phá hủy mô [58], [82]. Những chứng cớ tích cực hơn cũng đã cho thấy, MSC có
thể thúc đẩy liền vết thƣơng thông qua các tín hiệu ngoại lai đƣợc tiết ra mà cải
thiện các đáp ứng với tổn thƣơng của các tế bào da cƣ trú tại đó. Các báo cáo gần
đây bắt đầu xác định những tƣơng tác ngoại lai này giữa MSC và các dạng tế bào
chuyên biệt khác trong vết thƣơng da [15], [22], [81]. Khi nghiên cứu các vết
thƣơng đƣợc điều trị bằng dịch nổi nuôi cấy MSC (dịch chiết ngoại bào MSC),
các tác giả nhận thấy dịch chiết ngoại bào MSC đã làm vết thƣơng nhanh đóng
kín và nó tăng hấp dẫn với các đại thực bào và các tế bào nội mô đầu dòng thâm
nhập đến vết thƣơng [22] và các thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng dịch ngoại bào
MSC cũng thúc đẩy tế bào sừng và tế bào nội mô tăng sinh. Hơn nữa, MSC tủy
xƣơng còn tiết ra các chất hóa ứng động với đại thực bào, tế bào sừng và các tế
bào nội mô. Các quan sát này rõ ràng chỉ ra rằng MSC tủy xƣơng là một nguồn
các tín hiệu ngoại lai có tác dụng điều khiển các đáp ứng tế bào quan trọng trong
sửa chữa vết thƣơng da.
Do đó, một trong những hƣớng nghiên cứu khác trong điều trị vết thƣơng
là sử dụng các tế bào gốc. Ngƣời ta thấy chúng đảm nhiệm việc đánh giá sự thiếu
hụt sinh lý học về các thành phần đệm và các cytokine, chúng sửa chữa các thiếu


hụt đó bằng cách tạo ra những yếu tố thích hợp thúc đẩy liền vết thƣơng. Điều
này có nghĩa là tế bào gốc hoạt động nhƣ một cỗ máy có kiểm soát tƣơng tác các
thông tin ngƣợc một cách thông minh có thể tự điều chỉnh hệ thống sinh học.
Tủy xƣơng, máu ngoại vi, máu cuống rốn đều đã đƣợc nghiên cứu sử dụng trong
điều trị vết thƣơng mạn tính để thúc đẩy các đáp ứng liền vết thƣơng [75].
Tế bào gốc là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm
năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới.
Đây là các tế bào còn chƣa hay rất ít biệt hoá nên chúng có khả năng biệt hoá
theo nhiều hƣớng và tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau. Ngoài ra, chúng cũng có
khả năng tự sinh ra các tế bào giống hệt nó. Thông thƣờng các tế bào phân chia
theo phƣơng thức nhân đôi đối xứng tạo ra hai tế bào giống hệt nhau về mức độ
biệt hoá. Tế bào gốc không chỉ có khả năng phân chia đối xứng mà còn có khả
năng phân chia không đối xứng thành hai tế bào khác nhau, trong đó một tế bào
giữ nguyên mức độ biệt hoá cũng nhƣ giữ nguyên vai trò là tế bào gốc và một tế
bào thứ hai đã biệt hoá hơn, chúng sẽ tiếp tục biệt hoá thành các tế bào tiền thân
để sau đó phát triển thành tế bào chuyên biệt tham gia vào cấu trúc và chức năng
của mô, cơ quan. Nhờ đó mà số lƣợng tế bào gốc đƣợc duy trì hoặc tăng lên chứ
không mất đi do quá trình biệt hoá tế bào.
Những nghiên cứu về tế bào gốc đã chứng minh, hàng ngày cơ thể chúng
ta thay thế những tế bào già chết là do nguồn tế bào gốc biệt hoá thành những tế
bào chức năng. Khi bị thƣơng các tế bào gốc từ các ổ (niche) có thể ở gần vết
thƣơng hoặc từ các mô khác nhau nhƣ tuỷ xƣơng… sẽ di cƣ đến và biệt hoá
thành các tế bào chuyên biệt có chức năng liền vết thƣơng. Khi nguồn tế bào gốc
này không đủ đáp ứng với những tổn thƣơng tế bào do tổn thƣơng diện tích rộng,
do cơ thể bị suy yếu… thì hậu quả là gây ra những vết thƣơng vết loét lâu lành,
thậm chí không liền đƣợc. Do đó công nghệ tế bào gốc đang mang lại những hy
vọng lớn trong việc khắc phục những nan giải hiện nay trong liền vết thƣơng.
Những tế bào gốc phôi có tiềm năng lớn thay thế toàn bộ các tế bào chức


năng của cơ thể. Nhƣng việc sử dụng tế bào gốc phôi vào lĩnh vực liền vết thƣơng
hay bất cứ lĩnh vực nào khác đang gặp phải những vấn đề về đạo đức, cần có
nguồn thay thế. Hơn nữa, một báo cáo gần đây cho thấy tế bào gốc phôi của ngƣời
trong nuôi cấy có biểu hiện protein không phải của ngƣời và giả thiết đặt ra là có
thể từ protein chuột từ fibroblasts chuột của lớp nuôi (feeder layer), do đó tính an
toàn của tế bào gốc phôi còn phải tiếp tục nghiên cứu [51].
Một số nguồn tế bào gốc khác nhau từ máu cuống rốn, tế bào gốc máu
ngoại vi và tuỷ xƣơng cũng đang đƣợc nghiên cứu [19], [32], [37], [75]. Một
nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ bFGF và
VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xƣơng cao hơn rất nhiều so với fibroblasts
trung bì. Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xƣơng tại chỗ vết thƣơng
để thúc đẩy liền vết thƣơng.
Một nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ
bFGF và VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xƣơng cao hơn rất nhiều so với
fibroblasts trung bì. Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xƣơng tại chỗ
vết thƣơng để thúc đẩy liền vết thƣơng [32].
Tuy nhiên có tác dụng liền vết thƣơng vết bỏng nhƣng các nguồn tế bào
gốc từ các mô của cơ thể nhƣ máu tuỷ xƣơng, máu ngoại vi, máu cuống rốn, não,
mỡ, gan… đều rất hạn chế về số lƣợng nên tính ứng dụng chƣa cao. Trong khi
đó, khai thác các nguồn tế bào gốc trung mô trƣởng thành cũng đang là một
trong những hƣớng nghiên cứu điều trị vết thƣơng. Ngoại trừ các trƣờng hợp
ghép tế bào gốc trung mô đồng loại vốn sẵn có nguồn tế bào rất trẻ nhƣ tế bào
gốc trung mô từ màng ối, dây rốn và máu cuống rốn thì đối với các trƣờng hợp
ghép tế bào gốc trung mô tự thân chỉ có thể lấy từ 2 nguồn chính là tủy xƣơng và
mô mỡ, các nguồn khác từ mô gan, não và cơ hầu nhƣ không có khả năng ứng
dụng trong điều trị vết thƣơng. Nguồn tế bào gốc từ tuỷ xƣơng chủ yếu là tế bào
gốc tạo máu đã và đang đƣợc ứng dụng trong điều trị các bệnh về cơ quan tạo
máu nhƣng chúng có rất ít các tế bào trung mô vốn tham gia vào việc tái tạo vết


thƣơng. Tuy có một số nghiên cứu cho thấy tế bào gốc trung mô tủy xƣơng làm
tăng khả năng liền vết thƣơng mạn tính nhƣng tính ứng dụng chƣa cao bởi rất
hạn chế về số lƣợng tế bào trung mô. Do đó tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đƣợc
coi là nguồn tế bào gốc trƣởng thành tự thân lý tƣởng cho các nghiên cứu về y
học tái tạo, công nghệ mô và liền vết thƣơng.
1.4. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
Tế bào gốc mô mỡ đƣợc xác định là tế bào gốc trung mô. Tế bào gốc trung
mô lần đầu tiên đƣợc mô tả là dạng tế bào từ tủy xƣơng có khả năng tạo dòng,
bám dính bề mặt nuôi cấy [31] mà có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào
sụn và tế bào xƣơng [56]. Sau đó , chúng đƣợc xác định là có mặt ở rất nhiều mô
cơ quan khác nhau nhƣ cơ, não, và mô mỡ [52]. Ngày nay, tế bào gốc trung mô
từ tủy xƣơng và mô mỡ đƣợc xác định là rất giống nhau về quần thể tế bào và
kiểu hình tế bào [52].
Tế bào gốc đa tiềm năng đã đƣợc phát hiện trong mô mỡ của ngƣời và đƣợc
gọi là tế bào gốc mô mỡ. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng tế bào
gốc mô mỡ có thể điều trị một số bệnh về khớp, mà liệu pháp điều trị khác
không thành công. Mô mỡ còn đƣợc sử dụng để tạo hình một số bộ phận trong
cơ thể nhƣ ngực, má, cằm. Đây đƣợc coi nhƣ là cuộc cách mạng trong lĩnh vực
tạo hình thẩm mỹ. Tế bào gốc mô mỡ thể hiện các đặc điểm của tế bào gốc trung
mô nhƣ hình thái dạng nguyên bào sợi, là tế bào bám bề mặt nuôi cấy, có các
dấu ấn biệt hóa của tế bào trung mô, có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế
bào sụn, tế bào cơ…Do mô mỡ là loại mô sẵn có với số lƣợng lớn và dễ dàng thu
hồi mà ít gây những bất lợi cho bệnh nhân nên tế bào gốc mô mỡ có thể sẽ là
nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tƣơng lai đặc biệt các trƣờng
hợp sử dụng ghép tự thân. Các nhà nghiên cứu đề xuất nhiều cách thức phân lập
tế bào gốc mô mỡ khác nhau, có tác giả phân lập theo cách kinh điển là nuôi mô
mỡ trong đĩa nhựa có môi trƣờng dinh dƣỡng và chờ cho tế bào tự mọc từ các
mẩu mô ra và thu các tế bào có hình sao hoặc hình thoi là tế bào gốc trung mô.


Có tác giả lại dùng collagenase để phá hủy cấu trúc mô sau đó ly tâm lọc lấy các
tế bào. Môi trƣờng nuôi cấy cũng đƣợc công bố theo nhiều công thức khác nhau,
các tác giả dùng môi trƣờng cơ bản khác nhau nhƣ DMEM, DMEM-F12,
CMRL1066... ngay DMEM thì cũng có tác giả dùng môi trƣờng cơ bản là
DMEM có hàm lƣợng glucose cao nhƣng có tác giả dùng môi trƣờng có hàm
lƣợng glucose thấp, hoặc nhƣ thành phần các yếu tố bổ sung cũng chƣa thống
nhất... Khối tế bào thu đƣợc có thành phần tế bào khác nhau gồm tế bào gốc
trung mô, tế bào máu... có tác giả sử dụng nguyên khối tế bào sau khi phân lập
để điều trị vết thƣơng nhƣng cũng có tác giả sử dụng có chọn lọc chỉ tế bào gốc
trung mô thuần nhất... Cách thức sử dụng tế bào để tăng tối đa hiệu quả các lần
ghép điều trị vết thƣơng cũng khác nhau, có tác giả dùng khối tế bào tiêm vào
vết thƣơng, có tác giả phun hỗn dịch tế bào lên vết thƣơng nhƣng cũng có tác giả
nuôi cấy tế bào gốc trung mô trên giá đỡ và ghép vào bề mặt vết thƣơng. Chính
vì các lý do trên mà cần có những nghiên cứu đánh giá để xây dựng nên quy
trình phù hợp cũng nhƣ tiêu chuẩn khối tế bào dùng điều trị cũng nhƣ chỉ định
hay cách thức sử dụng tế bào gốc trung mô trong điều trị vết thƣơng.
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng của tế bào gốc mỡ đối với
các bệnh liên quan đến liền vết thƣơng. Theo Hyoju Kim và cộng sự (2012) điều
trị bằng laser công suất thấp với cấy ghép tế bào gốc mỡ trên chuột hủy miễn
dịch. Nhóm tác giả cho rằng sự kết hợp này tăng cƣờng phản ứng của tế bào về
biểu hiện gen và sự bài tiết của các yếu tố tăng trƣởng và phát triển tế bào thông
qua màng ty thể, giúp tăng đáng kể số lƣợng nang lông và tuyến bã nhờn[39].
Sheng-Ping Huang (2013), trên chuột Sprague-Dawley bị gây loét bằng chùm tia
điện tử sau đó đƣợc điều trị bằng ghép tế bào gốc mỡ. Kích thƣớc vết thƣơng sau
khi điều trị nhỏ hơn đáng kể sau 3 tuần. Tác giả cho rằng tế bào gốc mỡ có liên
quan với sự phát triển của các mạch máu mới [69]. Ann Katharin Reckhenrich
và cộng sự (2014), chậm liền vết thƣơng và hình thành sẹo là một trong những
biến chứng thƣờng gặp nhất sau khi can thiệp phẫu thuật. Do vậy sử dụng tế bào


gốc trung mô từ mô mỡ nhƣ một nhân tố trung gian trong việc kích hoạt vật liệu
sinh học giúp liền các vết khâu phẫu thuật [62].
Trong công nghệ sinh học da, mục đích cuối cùng trong nghiên cứu và
điều trị là để nhanh chóng tạo ra một cấu trúc hoàn hảo phục hồi hoàn toàn chức
năng da.
Trong số bệnh nhân bỏng, có nhiều bệnh nhân bỏng nặng không đủ nguồn
da thay thế đã dẫn đến suy mòn, suy kiệt và tử vong. Viện Bỏng Quốc Gia trong
5 năm đã nghiên cứu trị liệu tế bào trong điều trị vết thƣơng vết bỏng, các tấm tế
bào da nuôi cấy đã đƣợc chế tạo và sử dụng trong điều trị đạt nhiều kết quả tốt
góp phần cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện rộng hoặc tổn thƣơng khuyết
da rộng hoặc những bệnh nhân vết thƣơng mạn tính lâu liền.
Viện Bỏng Quốc Gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế
bào sừng để điều trị vết thƣơng và vết bỏng. Tuy nhiên, việc nuôi cấy tế bào da
tự thân không đáp ứng kịp nhu cầu lâm sàng do quy trình cần thời gian dài, việc
nuôi cấy các tế bào da đồng loại đáp ứng kịp thời về mặt thời gian nhƣng gặp
phải vấn đề thải ghép. Mô mỡ tự thân dễ dàng lấy hơn, nhất là vùng bụng rất
thích hợp để nuôi cấy tế bào gốc mỡ [41].
Xuất phát từ các cơ sở khoa học và thực tiễn về tiềm năng ứng dụng của tế
bào gốc trung mô từ mô mỡ, cần thiết phải nghiên cứu thiết lập quy trình chuẩn
và có hiệu quả tách tế bào cao nhất, các tế bào cần đƣợc tinh lọc và thể hiện tính
gốc nhƣ khi chúng tồn tại trong cơ thể ngƣời. Việc đánh giá tác động của nguồn
tế bào gốc sau khi tách tới sự tăng sinh và di cƣ của cả 2 loại tế bào da gồm
nguyên bào sợi và tế bào sừng là cơ sở tiếp tục cho việc định hƣớng và chế tạo
chế phẩm điều trị vết thƣơng trong tƣơng lai.
Tế bào gốc mô mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành
nhiều dòng tế bào khác nhau nhƣ tế bào xƣơng, tế bào tiết insulin, tế bào sụn
[45], [84], [85]. Tác giả Xu W (9-2014) đã biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô
mỡ thành tế bào dạng nguyên bào sợi để điều trị vết thƣơng ở thanh quản [36].


Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thƣơng thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là
một trong những dạng tế bào quan trọng di cƣ đến vùng tổn thƣơng để thực hiện
nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thƣơng.
Trƣớc khi ứng dụng tế bào gốc trung mô vào lĩnh vực điều trị vết thƣơng,
cần đánh giá tiền lâm sàng bằng các thử nghiệm trong labo về tác động của
chúng đối với các tế bào da nhƣ nguyên bào sợi và tế bào sừng. Nếu nhƣ các tế
bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cƣ của 2
loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục
các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hƣớng cho các
nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thƣơng thuộc
hệ thống trung mô đặc biệt là vết thƣơng và vết bỏng.
Tế bào gốc trung mô có các dấu ấn bề mặt và dấu ấn gen tƣơng tự nhƣ tế
bào gốc trung mô tủy xƣơng. Điều thuận lợi hơn là tế bào gốc mô mỡ lại dễ phân
lập và có khả năng tăng sinh mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô tủy xƣơng.
Do đó, tế bào gốc mô mỡ có nhiều hy vọng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sửa
chữa và tái tạo mô.
Khám phá vai trò của tế bào gốc mô mỡ đối với liền vết thƣơng da, chúng
tôi khảo sát liệu tế bào gốc mô mỡ và sự tƣơng tác qua tiếp xúc tế bào giữa tế
bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi da và tế bào sừng của ngƣời có thúc đẩy sự
tăng sinh và di cƣ không. Hơn nữa, sự tiết collagen đƣợc đánh giá và hoạt động
di cƣ của nguyên bào sợi cũng nhƣ tế bào sừng đƣợc nghiên cứu trên mô hình
vết thƣơng thực nghiệm in vitro.


Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, nguyên - vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
ADSCs: tế bào gốc đƣợc phân lập từ mẫu mô mỡ. 30 mẫu mô mỡ đƣợc thu
từ bệnh nhân di chứng bỏng cần phẫu thuật ghép da.
Tế bào sừng và nguyên bào sợi đã đƣợc phân lập từ mẫu da thu từ phẫu
thuật cắt bỏ bao quy đầu của 05 trẻ em.
Các bệnh nhân hoặc ngƣời nhà bệnh nhân này đều đồng ý hiến phần mỡ
hoặc phần da bỏ đi dùng cho nghiên cứu và đƣợc chấp nhận bởi ban đạo đức
nghiên cứu y sinh bệnh viện. Tiêu chuẩn ngƣời hiến mô đạt yêu cầu về sàng lọc
HIV, HBsAg, HCV và giang mai với test nhanh âm tính.
Tiêu chuẩn về pháp lý: Bệnh nhân và ngƣời nhà bệnh nhân đồng ý hiến
phần mô bỏ đi trong các phẫu thuật điều trị di chứng bỏng. Các mẫu hồ sơ hiến
mô đƣợc ghi chép theo quy định của Bộ Y tế đƣợc hội đồng đạo đức trong
nghiên cứu sinh y của Viện Bỏng Lê Hữu Trác thông qua.
2.1.2. Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu
- DMEM và DMEM-F12 do hãng Gico/Life tech cung cấp
- Huyết thanh bào thai bê (FBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp
- Collagenase do hãng Gico/Life tech cung cấp
- Epilife do hãng Gico/Life tech cung cấp
- EDGS do hãng Gico/Life tech cung cấp
- Antibiotic/Antimycotic do hãng Gico/Life tech cung cấp
- Trypsin/EDTA do hãng Gico/Life tech cung cấp
- Phosphate bufferd saline (PBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp
2.1.3. Trang thiết bị và vật tƣ
- Máy ly tâm, bể ổn nhiệt


- Tủ ấm CO2 (Incubator) hoạt động ở 370C, CO2 5%
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu
- Kính hiển vi đảo ngƣợc
- Thiết bị để thanh trùng khô, thiết bị thanh trùng ƣớt (nồi hấp áp lực)
- Ống ly tâm falcol thể tích 15ml, 50ml, falcol do hãng Corning cung cấp
- Đĩa petri đƣờng kính 60mm, 100mm do hãng Corning cung cấp
- Pipet aid, đầu pipet loại 5ml, 10ml, 25ml
- Găng tay vô trùng
- Các dụng cụ khác
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào
Mô mỡ dƣới da đƣợc lấy vô trùng từ phòng mổ và bảo quản ngay trong tube môi
trƣờng, giữ ở 40C và vận chuyển về labo. Môi trƣờng bảo quản mô mỡ bao gồm
DMEM có 500U/ml penicillin, 500microgam/ml streptomycin và amphotericin B.

Xử lý mô mỡ và phân lập tế bào gốc tại labo nuôi cấy tế bào:
- Rửa mô mỡ 3 lần bằng PBS để loại bỏ các cấu trúc thuộc mạch máu, da...
- Mô mỡ đƣợc phân tách bằng Collagenase, nồng độ collagenase trong tube
mô mỡ là 0.15%.
- Đặt tube hỗn dịch trên vào incubator khoảng 30 phút, cứ sau 10 phút lại
lắc một lần, sau 30 phút thêm FBS để dừng tác dụng của enzym
- Ly tâm tốc độ 1500rpm trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi và thu đƣợc tế bào
lắng dƣới đáy tube.
- Đếm số lƣợng tế bào thu đƣợc trong buồng đếm Nauebaer để xác định
nồng độ tế bào có trong hỗn dịch thu đƣợc.
- Cấy vào đĩa petri sao cho đạt 20.000 TB/cm2 bề mặt nuôi cấy.
- Mỗi đĩa d=100mm sau đó đƣợc bổ sung ít nhất đủ 8ml môi trƣờng
DMEM/1% kháng sinh/10% FBS
- Đặt đĩa vào incubator ẩm, nhiệt độ 370C và CO2 5%
- Quan sát tế bào và tiến hành thu tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin khi
mật độ tế bào đạt 80% diện tích che phủ.


- Các tế bào thu đƣợc sau đó đƣợc đếm xác định số lƣợng. Sau đó, bảo
quản lạnh sâu hoặc cấy trở lại đĩa nuôi với mật độ 5000 TB/cm2 cho tới thế hệ
thứ 5 để cung cấp cho nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Nhân rộng tế bào
- Kiểm tra tình trạng tế bào, đánh giá mức độ che phủ của tế bào trên bề
mặt đĩa nuôi cấy (độ che phủ đạt khoảng 70% có thể cấy chuyển làm thí nghiệm)
- Hút bỏ dịch nổi trong đĩa nuôi cấy rồi đem rửa bằng dung dịch đệm PBS
- Thêm dung dịch Trypsin/EDTA 1X với thể tích 0,1ml/cm2, đặt đĩa nuôi
cấy vào tủ ấm với tiêu chuẩn nhiệt độ 370C, CO2 5% trong 5 phút. Sau khi lấy ra
ngừng quy trình trypsin bằng 0,1 ml/cm2 môi trƣờng nuôi cấy, thu tế bào vào
ống ly tâm, đếm số lƣợng tế bào.
- Ly tâm ở tốc độ 1600 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm
và bổ sung môi trƣờng nuôi cấy.
- Khối tế bào thu đƣợc cấy chuyển sang đĩa khác để gia tăng số lƣợng tế
bào hoặc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào:
Phƣơng pháp này sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer.
Sau khi tiến hành quy trình trypsin, lấy 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin pha
tỷ lệ 1:1 với chất nhuộm màu Trypan-blue. Hút hỗn dịch tế bào và chất nhuộm
màu bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để
hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm. Đếm số lƣợng tế bào dƣới kính hiển vi.
Số lƣợng TB đƣợc tính theo công thức: C = n/v
n: số lƣợng TB đã đếm đƣợc trong buồng đếm
v: thể tích đếm (ml)
C: mật độ tế bào (TB/ml).
Buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3 = 1.10-4 ml do đó công thức tính là:

C = n x 104/ml
2.2.4. Xác định khả năng tạo dòng (colony) của tế bào
Để xác định tính gốc của tế bào thông qua khả năng tự đổi mới của chúng,
hỗn dịch các tế bào đơn lẻ đƣợc chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy nhựa có


đƣờng kính 60mm ở mật độ là 50 TB/cm2. Đĩa nuôi cấy sau đó đƣợc duy trì
trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony. Đĩa tế bào nuôi cấy sau
đó đƣợc cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào đƣợc
xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào. Khả năng tạo dòng đƣợc
tính toán theo tỷ lệ % số colony đạt đƣợc so với số tế bào đƣợc cấy. Cụ thể các
bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Bƣớc 1. Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa có đƣờng kính 60mm với
mật độ tế bào 50TB/cm2, mỗi đĩa cho 4mm môi trƣờng nuôi cấy, thay môi
trƣờng sau mỗi 3 ngày.
Bƣớc 2. Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:
-

Hình thành colony chƣa?

-

Mỗi colony có khoảng bao nhiêu tế bào?

-

Hình thái tế bào?

Bƣớc 3. Nhuộm giemsa sau 3 tuần
Bƣớc 4. Tính tỷ lệ % số colony/số tế bào đƣợc cấy, mỗi colony khi đó đƣợc
xác định là có từ 50 tế bào trở lên.
2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào
da nuôi cấy
Để xác định hiệu quả của các yếu tố hòa tan bởi ADSCs lên sự tăng sinh và
di cƣ của hai loại tế bào, nguyên bào sợi da và tế bào sừng đƣợc đồng nuôi cấy
với tế bào gốc mô mỡ trong 2 khoang đĩa để tránh sự tiếp xúc trực tiếp giữa các
loại tế bào nhƣng lại cho phép sự trao đổi các yếu tố có khả năng khuếch tán.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×