Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. BỆNH LAO ........................................................................................................... 3
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC ................................................................... 3
1.3. VI KHUẨN LAO .................................................................................................. 5

1.3.1. Cấu tạo ........................................................................................................... 5
1.3.2. Cơ chế gây bệnh ............................................................................................ 8
1.3.3. Đặc điểm hệ gen ............................................................................................ 9
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO ................................................ 9
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao ....................................................................... 9
1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc .................................................................. 10
1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng ....................................................................... 12
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng .......................................................................... 15
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ....................... 16
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng ............................... 16
1.5.2. Xác định kiểu hình ...................................................................................... 18
1.5.3. Xác định kiểu gen........................................................................................ 18
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR ............................. 19
Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................. 23
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 23
2.1.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .................................................... 23
2.1.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu ......................................................... 24


2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 25
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 25
2.2.2. PCR nhân đoạn gen đích ............................................................................ 26
2.2.3. Tạo dòng gen ............................................................................................... 27
2.2.4. Multiplex real-time PCR ............................................................................ 28
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 30
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ............................................... 30
3.1.1. Kết quả nhân gen katG và rpoB t DNA tách t vi khuẩn lao ............... 30
3.1.2. Kết quả tách dòng gen ................................................................................ 31
3.1.3. Kết quả phân tích trình tự gen katG ......................................................... 34
3.1.4. Kết quả phân tích trình tự gen rpoB ......................................................... 36
3.2. TỐI ƢU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN
NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC ......................................................... 41
3.2.1. Thiết kế các primer và probe cho phản ứng multiplex real-time PCR . 41
3.2.2. Kết quả tối ƣu thành phần và chu trình phản ứng multiplex real-time
PCR phát hiện đột biến liên quan kháng thuốc ................................................. 44
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 60
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 62
PHỤ LỤC ...................................................................... Error! Bookmark not defined.



MỞ ĐẦU
Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã đƣợc biết rõ từ một
thế kỷ nay. Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao đƣợc ƣớc tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9
triệu ngƣời mắc lao mới và hơn 3 triệu ngƣời chết do lao mỗi năm. Bệnh lao đang trở
nên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs
Resistant - MDR), tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao
mạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo số liệu thống kê của chƣơng
trình chống lao Quốc gia năm 2007, thế giới có khoảng 511.000 trƣờng hợp nhiễm lao
kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trƣờng hợp tử vong. Do những khó khăn
trong việc điều trị những bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa
kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọng
trong điều trị bệnh lao.
Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phƣơng
pháp nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh
học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc.
Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến
xuất hiện trong một số gen chức năng, trƣớc hết là ở gen rpoB và katG. Thời gian chẩn
đoán có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện
cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn. Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn
đoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do xuất hiện các đột biến
trên gen tƣơng ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy việc xác định các trƣờng hợp nhiễm
lao kháng thuốc thƣờng đi kèm với những chẩn đoán phát hiện đột biến gen đối với các
chủng lao phát hiện đƣợc. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan
tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin do xuất
hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB.

1


Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát
hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng
thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và
rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.
Để đạt đƣợc mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên
cứu nhƣ sau:
1.

Xác định trình tự gen rpoB và katG.

2.

Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân
lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG.

3.

Tối ƣu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR phát
hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc.

2


Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1. BỆNH LAO
Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm mạn tính, là tình trạng nhiễm vi
khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thƣờng gặp nhất ở phổi nhƣng cũng có thể ảnh
hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao
kê), xƣơng và khớp. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài ngƣời từ hàng
ngàn năm nay, trên thế giới chƣa bao giờ và không một quốc gia nào, một khu vực nào,
một dân tộc nào không có ngƣời mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn lao lần đầu tiên
đƣợc bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882. Trong thời gian này ở Mỹ
và châu Âu, cứ 7 ngƣời thì có 1 ngƣời chết vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là
một bƣớc ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại trừ căn bệnh này. Trƣớc đây,
lao đƣợc xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới,
lƣu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nƣớc thuộc châu Phi và khu vực
châu Á, trong đó có Việt Nam.
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nƣớc có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu.
Trong khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và
Philippines về số bệnh nhân lao, cũng nhƣ số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm. Hiện
nay nguy cơ nhiễm lao ở nƣớc ta hằng năm đƣợc ƣớc tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh
phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao
hàng năm có thể cao hơn 1,5%, nhƣ vậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn. Điều
đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác phòng chống lao không những trong các
năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở
thiên niên kỷ mới [3, 35].
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC
Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hƣởng nặng nề khi xuất hiện
thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng

3


lao kháng thuốc đƣợc chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant
- MDR) và lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng
vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của
cộng đồng. Theo ƣớc tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42
vạn ngƣời mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lƣợng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái
Bình Dƣơng có 15 vạn trƣờng hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu
vực Châu Phi và Đông Âu. Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ
rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17]. Tình hình lao siêu kháng thuốc cũng
ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và Trung
tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia trên toàn
thế giới, và thấy rằng có 20% trƣờng hợp là kháng đa thuốc và 2% trƣờng hợp là kháng
thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chƣơng trình Chống lao Quốc gia
thì có 32,5% các trƣờng hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3].
Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chống
lao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao
kháng lại nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi
thuốc trên trực khuẩn lao không giống nhau. Hiện nay ngƣời ta chia thuốc chống lao
thành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại
một, thuốc chống lao hàng đầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi là các thuốc
chống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ hai). Trong khi các thuốc chống lao loại
một là những thuốc có hiệu quả nhất và cũng ít độc tính nhất, thì các thuốc chống lao
hàng thứ hai là những thuốc có tác dụng kém hơn lại có độc tính cao và giá thành rất
đắt. Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân nhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong
khi đó điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000 USD. Hiện nay số tử vong hàng
năm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử vong do HIV, sốt rét và các bệnh nhiệt đới
cộng lại. Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đã quay trở lại và trở
nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [17].

4


Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhƣng vài năm
sau khi kháng sinh này đƣợc sử dụng thì ngƣời ta đã nhận thấy hiện tƣợng đề kháng lại
streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời:
para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhƣng đều không mang lại hiệu quả sau
một thời gian điều trị nhất định [7]. Nghiên cứu tìm kiếm hoá dƣợc mới có hiệu quả
điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc luôn luôn đƣợc thực hiện và càng ngày càng
có nhiều hợp chất chống lao mới đƣợc đƣa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid
[43]. Tuy nhiên, theo cơ chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều
chủng mới hơn có khả năng kháng thuốc nhanh chóng hơn [52]. Khả năng điều trị
thành công có thể đạt 95-100% đối với những bệnh nhân mắc lao thông thƣờng, trong
khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chí
còn không điều trị đƣợc khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù
đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn
chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều
trị lao hiện nay [7, 10, 35].
1.3. VI KHUẨN LAO
1.3.1. Cấu tạo
Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thƣớc 2
- 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi đƣợc nhuộm bằng phƣơng
pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm
mất màu carbonfuchsin. Ở môi trƣờng nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực
khuẩn lao vẫn phát triển đƣợc, vì vậy, chúng đƣợc gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng
toan (acid fast bacilli - AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi
mycobacteria. Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phƣơng
pháp hình thái học (nhuộm màu) trong các mẫu bệnh phẩm. Một số giả thiết cho rằng
mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi mycolic acid. M. tuberculosis có khả năng

5


thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, amino acid và các enzyme
cofactor thiết yếu của tế bào. Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram
dƣơng nhƣng chúng không đƣợc xếp vào loại vi khuẩn Gram dƣơng do các phân tử gắn
với thành tế bào là lipid chứ không phải protein hay polysaccharide. Do đó, chúng
không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram [2, 5, 37, 38].
Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37oC và dƣới áp suất của O2 là
100 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dƣới xƣơng đòn thƣờng hay mắc lao nhất vì có áp
suất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xƣơng và đầu xƣơng vì áp suất O 2
ở đây là 100 mmHg. Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp suất O2 thấp.
Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ 20 giờ mới có một lần phân chia tế bào,
trong điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một
lần trên môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng Loewenstein [46]. Tốc độ phát triển
chậm có thể là do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinh
dƣỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2).

Hình 1.1. Hình dạng của tế bào M.
tuberculosis
(http://www.diseasedetectives.org/mi
crobe_gallery/tuberculosis)

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn lao phát
triển trong môi trƣờng nuôi cấy.
(http://abcnews.go.com/Health/Germs
/story?id=3079114&page=1)

6


Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có đƣợc.
Dƣới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo chính nhƣ sau (hình 1.3):
- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipid
gồm 2 nhóm: nhóm ƣa nƣớc hƣớng vào bên trong, nhóm kỵ nƣớc quay ra ngoài. Cấu
trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của
vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác nhƣ các protein truyền
tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên
quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lƣợng, các chất mang làm trung gian cho
quá trình vận chuyển các chất dinh dƣỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng
hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme
ngoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].
- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đƣờng arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có
độ cứng nhất định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất đƣợc biết
ở prokaryote, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thƣờng, mức độ liên
kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn
E. coli là 20 - 30% [38]
- Lớp ngoài đƣợc tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất
phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm
tăng khả năng chống thấm nƣớc của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại
lâu với môi trƣờng bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế
bào miễn dịch [38].
- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid.
Nó đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện
tƣợng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn
khó bi tiêu diệt.

7


Hình 1.3. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis
(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm)

1.3.2. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đƣờng khác nhau:
thƣờng là đƣờng hô hấp, hoặc có thể qua đƣờng tiêu hóa, da, kết mạc mắt. Sau khi gây
tổn thƣơng tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đƣờng bạch huyết hoặc đƣờng máu để
đến gây tổn thƣơng thứ phát ở các cơ quan khác: Phổi, thận, màng não, xƣơng, hạch
nhƣng thƣờng bị hơn cả là đỉnh phổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg vì đây là điều
kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao. Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord
factor” (trehalose - 6,6’- dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu,
gây nên những u hạt mạn tính [7].
Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn dịch
qua trung gian tế bào. Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và các
nguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào.
Chức năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M. tuberculosis mà
còn tạo môi trƣờng tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23]. Bên
trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, nhƣ γ interferon, hoạt hóa đại

8


thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các
tế bào bị nhiễm. Nhƣng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn
mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18].
1.3.3. Đặc điểm hệ gen
Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M. tuberculosis chủng H37Rv đƣợc giải trình
tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều
guanine và cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự đƣợc dự đoán là có mã
hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di
truyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi
Mycobacterium, trƣớc hết là của vi khuẩn lao (M. tuberculosis) và vi khuẩn phong
(M. leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã đƣợc lƣu giữ
tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chƣơng trình để truy cập khám phá và
sử dụng [11, 53].
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao
Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng
không giống nhau. Hiện nay ngƣời ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc
chống lao chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin (RMP),
ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM). Đây là những thuốc kháng
lao hiệu quả và cũng ít độc tính nhất. (2) Các thuốc chống lao thứ yếu: là những thuốc
chống lao có tác dụng kém hơn và có độc tính cao, không đƣợc dùng trong phác đồ
điều trị lao nhƣng lại đƣợc dùng trong các trƣờng hợp điều trị thất bại do vi khuẩn lao
kháng lại các loại thuốc chống lao loại một. Các thuốc này gồm có: ethionamide,
prothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin,
thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…

9


Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng ức chế tổng vách tế
bào. Các thuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng ức chế tổng hợp
protein. Các thuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleic
acid. Thuốc paraminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38].
1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc
Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự tác động của các loại kháng
sinh dùng điều trị chúng. Thƣờng nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới những
trƣờng hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất:
isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35]
Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính:
-

Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó
các thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn.

-

Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc đƣợc vi khuẩn
sản xuất thừa ra, do đó lƣợng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức
chế hoàn toàn vi khuẩn lao.

-

Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào
bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt
tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh.

Hiện tƣợng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trƣớc khi xâm nhập (tiên
phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể ngƣời bệnh (thứ phát). Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên
phát là hiện tƣợng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề
kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn
lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tƣợng
kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng

10


thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lƣợng, thời gian sử dụng thuốc
do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38].
Các chủng vi lao kháng thuốc đƣợc chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng
đa thuốc (MDR – TB): Là trƣờng hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai
thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin. (2) Các chủng lao
kháng thuốc phổ rộng (XDR – TB): Là trƣờng hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng
kháng đa thuốc và có thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là
capreomycin, kanamycin, amikacin [49].
Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, ngƣời ta đã xác định đƣợc cơ chế
kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tƣơng ứng. Trong hình 1.4 mô
tả các cơ chế phân tử của hiện tƣợng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao. Trong đó, kháng
isoniazid đƣợc cho là liên quan đến các gen: KatG, inhA, aphC và kasA. Kháng
streptomycin có thể là do đột biến ở gen rpsL. Kháng pyrazinamid có thể liên quan đến
gen pncA. Kháng quinolone có thể liên quan tới gen gyrA. Kháng rifampicin đƣợc xác
định là liên quan đến đột biến ở vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa tiểu phần β của
RNA polymerase [7, 25]. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế
kháng đa thuốc, tức là trƣờng hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao
mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu
các đột biến trên gen rpoB với katG.

11


Hình 1.4. Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao
(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis).

1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng
Rifampicin tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl]
(hình 1.5A). Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ rifampicin B, một kháng sinh
đƣợc chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn
mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Rifampicin không có
hiện tƣợng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ ức chế tối
thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in
vitro). Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48].

12


A

B

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động
của RNA polymerase. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn
vị khác nhau (α, β, β’, ω), và đƣợc mã hóa tƣơng ứng bởi các gen rpoA, rpoB,
rpoC, rpoD [7, 20].
Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế
các hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngƣng trệ các
hoạt động sống của vi khuẩn lao. Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vi
khuẩn lao (hình 1.6).

Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]

13


Gen rpoB có kích thƣớc 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase
(Tuberculosis, 2007). Những đột biến kháng kháng sinh rifampicin thƣờng xảy ra trên
đoạn gen rpoB, nhất là đoạn nằm gần trung tâm của gen dài 81 bp đƣợc giới hạn từ bộ
ba 507 đến 533, ngƣời ta gọi đây là vùng “nóng” – “hot-spot region” (hình 1.7). Đột
biến ở bộ ba thứ 526, 516, 531, cho kết quả đề kháng với rifampicin cao; đột biến ở bộ
ba 510, 515 và 512 thì cho khả năng kháng rifampicin ở mức độ thấp hơn [47]. Đoạn
nucleotide của vùng nóng gồm:
507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC
CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533
Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào
để tạo ra các đột biến đƣợc thể hiện trên hình 1.7 nhƣ sau: [41].

Hình 1.7. Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng”
của gen rpoB [41]

- Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu
phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP
với tiểu phần này giảm đi. Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao giảm

14


hoặc mất đi. Nhƣ vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn lao trở
nên kháng thuốc với rifampicin.
- 90 - 95 % các chủng M. tuberculosis kháng rifampicin đƣợc xác định là do các
đột biến trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB. Nhƣ vậy còn 5 - 10 % các chủng vi
khuẩn lao không có đột biến trên vùng này của gen rpoB. Điều này cho thấy cần phải xác
định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác định
chính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng
Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc
chống lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M. tuberculosis và các loại
Mycobacterium không điển hình khác nhƣ M. bovis, M. kansasii. Isoniazid diệt khuẩn
phụ thuộc vào nồng độ thuốc ở vị trí tổn thƣơng và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn. Cơ
chế tác dụng của isoniazid có liên quan tới sự hình thành phức hệ acyl isonicotinicNADH và nhƣ đã trình bày ở trên chúng ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho
thành tế bào vi khuẩn lao.
Gen katG có kích thƣớc 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase. Enzyme này
hoạt hóa INH bằng cách kết hợp acyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ acyl
isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreductase (mã hóa bởi
gen InhA), theo đó làm ngăn cản sự hình thành cơ chất enoyl-AcpM và hoạt động tổng
hợp acid béo. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào
vi khuẩn lao.

15


Hình 1.8. Cơ chế kháng INH ở vi khuẩn lao
(http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureId=2CCA)

Cơ chế phân tử của tính kháng INH chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm
đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại
codon 315 (Ser  Thr) của gen katG mã hóa catalase peroxidase [26]. Nếu có sự biến
dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến đổi thành ACC
hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của catalase peroxidase,
do đó M. tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc INH (hình 1.8) [14]. Do đó phát hiện sự
thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phƣơng pháp sàng lọc
nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid.
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng
*) Đặc điểm lâm sàng
Nhìn chung các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc không
khác nhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.

16


Trƣờng hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát có thể có triệu chứng cấp
tính hơn, sốt cao hơn.
Đối với kháng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân lao mạn tính,
đƣợc điều trị ít nhất 2 lần. Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số
bệnh nhân lao kháng đa thuốc. Hầu hết bệnh lao kháng đa thuốc bệnh tiến triển, hay
gặp dò phế quản – màng phổi mà điều trị gặp nhiều khó khăn [7].
*) Xét nghiệm lâm sàng
- Phản ứng Tuberculin: thƣờng thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát có mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.
Đối với kháng thuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễm
HIV (+) thì tỷ lệ phản ứng này âm tính khá cao.
- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh lao
phổi giữa trƣờng hợp lao kháng thuốc tiên phát với trƣờng hợp nhạy cảm với
thuốc không có sự khác biệt. Nhƣng những trƣờng hợp kháng thuốc mắc phải thì
gặp nhiều là thể xơ hang, diện tích phổi tổn thƣơng nhiều hơn và có nhiều hang,
kích thƣớc của hang lớn hơn.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thƣờng có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhƣng ở
vi khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớp
peptidoglycolipid ở ngoài cùng). Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế
bào cũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc. Khuẩn lạc của vi
khuẩn kháng thuốc có thể không điển hình khi nuôi cấy, mọc cằn cỗi [7]
+ Về số lƣợng vi khuẩn khi soi kính và nuôi cấy: những bệnh nhân kháng thuốc
thứ phát có số lƣợng vi khuẩn khi soi kính cao hơn nhiều so với bệnh nhân
thông thƣờng. Không có sự khác nhau nhiều giữa bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát và bệnh nhân thông thƣờng. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng đặc số khuẩn
lạc mọc ở bệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọc

17


nhanh hơn so với kháng thuốc tiên phát và ở những bệnh nhân này số khuẩn
lạc lại cao hơn ở bệnh nhân thông thƣờng [7].
+ Về đặc điểm kháng sinh đồ: kháng thuốc tiên phát thƣờng kháng hay kháng
với nồng độ thấp, kháng thuốc mắc phải thƣờng kháng với nồng độ cao hơn.
Kháng thuốc tiên phát hay gặp với một thuốc, kháng thuốc thứ phát thƣờng tỷ
lệ kháng cùng lúc với nhiều thuốc cao hơn [7].
Nhƣ vậy không thể dựa vào lâm sàng hay thời gian điều trị hiệu quả để chẩn
đoán bệnh nhân lao kháng thuốc đƣợc. Các xét nghiệm cận lâm sàng khác chỉ có giá trị
gợi ý. Chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc hiện nay vẫn phải lấy kết quả kháng sinh đồ
làm tiêu chuẩn.
1.5.2. Xác định kiểu hình
Gồm các phƣơng pháp sau: Phƣơng pháp xác định tƣơng quan, phƣơng pháp
xác định tỷ lệ kháng, phƣơng pháp đo màu, phƣơng pháp khử nitrate và nhiều phƣơng
pháp khác [13]. Các phƣơng pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn
lao trong môi trƣờng nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đƣa ra kết luận về khả năng kháng
thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu [12]. Nhƣợc điểm của các phƣơng pháp
này là vi khuẩn lao mọc chậm, trên môi trƣờng Lowenstein-Jensen thƣờng mất 4-6
tuần. Sử dụng hệ thống môi trƣờng lỏng đƣợc cải tiến nhƣ MGIT, BATEC cũng mất 2
tuần. Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng nhƣ bệnh
lao kháng thuốc còn khó khăn.
1.5.3. Xác định kiểu gen
Hiện nay có nhiều phƣơng pháp xác định kiểu gen đƣợc ứng dụng để chẩn đoán
vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 4], giải trình tự gen [6], lai trên pha rắn [36], Real – time
PCR [14]
Các phƣơng pháp chẩn đoán xác định kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến
ở các gen có liên quan tới tính kháng thuốc tƣơng ứng [51], sử dụng các kỹ thuật cao,

18


đòi hỏi thiết bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhƣng thời
gian chẩn đoán bằng phƣơng pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Để xác định đột biến trên gen có liên quan tới kháng thuốc (gen rpoB và katG)
hiện nay giải trình tự gen vẫn là phƣơng pháp xác định cơ bản, chính xác nhất và thời
gian cho kết quả từ 3 - 5 ngày. Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa đƣợc tách dòng từ
chủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với
trật tự nucleotide chuẩn để biết đƣợc các vị trí sai lệch [22, 16].
Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid
bằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần
nghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao
ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá đƣợc tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên
các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Qua đó làm tiền đề xây dựng một
số bộ kit real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và
isoniazid tại Việt Nam.
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị đƣợc
ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real-time PCR ngƣời
làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các bƣớc thí nghiệm để đọc và phân tích
kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của
phản ứng khuếch đại cũng đƣợc hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại.
Nhƣ vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống
nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong
ống phản ứng đƣợc hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để ngƣời làm thí
nghiệm có thể thấy đƣợc.
Chìa khóa của kỹ thuật real-time PCR chính là hóa chất và thuốc thử có trong
phản ứng, trong đó chất huỳnh quang đƣợc thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố đầu

19


tiên mà ngƣời làm real-time PCR cần quan tâm. Chất huỳnh quang này phải làm thế
nào để ống phản ứng có thể phát đƣợc huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích
thích một khi trong ống phản ứng này có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ
DNA đích, và sẽ không thể phát đƣợc huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đại
trong ống. Cho đến nay, nhiều chất huỳnh quang nhƣ vậy đã đƣợc tìm ra và sử dụng
rộng rãi. Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi chỉ xin trình bày chất huỳnh quang
thƣờng đƣợc sử dụng nhất đó là Taqman probe [8].
Probe hay còn gọi là “đoạn dò” là những đoạn oligonucletides sợi đơn có trình
tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó là
sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích). Đoạn dò này với đầu 5’ có gắn chất phát
huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất dập tắt huỳnh quang tƣơng ứng
(gọi là quencher) để dập tắt đƣợc ánh sáng huỳnh quang đƣợc phát ra từ reporter. Cơ
chế của sự phát tín hiệu huỳnh quang khi có sản phẩm khuếch đại là nhờ hoạt tính 5’-3’
exonuclease của enzyme Taq polymerase có khả năng cắt bỏ các probe khi các probe
bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi để tổng hợp sợi
bổ sung (hình 1.9)

20


Hình 1.9. Nguyên lý hoạt động của real-time PCR sử dụng Taqman probe
(http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx)

Trên hình 1.9 minh họa nguyên lý hoạt động của Taqman probe trong real-time
PCR. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ
bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Taq
polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy reporter của
Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc
nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lƣợng reporter
tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cƣờng độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ
mạnh thì máy sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận
đƣợc nguồn sáng kích thích. Ngƣợc lại, khi không có sự xuất hiện của sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà
huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher của probe hấp phụ (dập tắt tín hiệu) do

21


đó ống thử nghiệm sẽ không phát đƣợc tín hiệu huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn
sáng kích thích [8].
Multiplex real-time PCR là một dạng thay đổi của phản ứng real-time PCR
thông thƣờng, ở đó trong cùng một lúc hai hay nhiều gen đích đƣợc khuyếch đại bằng
cách sử dụng đồng thời các cặp mồi và các probe khác nhau.
Kỹ thuật multiplex real-time PCR cho phép tiết kiệm thời gian, công sức và
đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen,
tính đa hình DNA và phân tích định lƣợng, phản ứng multiplex real-time PCR rất hữu
ích cho việc phát hiện trực tiếp các đột biến của M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng.

22


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×