Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa pusa basmati (luận văn thạc sĩ)

MỞ ĐẦU
Tình hình biến đổi khí hậu toàn cầu (BĐKH) hiện nay đang là một vấn đề hết
sức thời sự, thu hút sự quan tâm, lo lắng của toàn nhân loại. BĐKH hiện đang diễn
ra thường xuyên trên diện rộng, vượt ra ngoài tầm kiểm soát của con người và gây
ra những tác động rất lớn đến đời sống và kinh tế toàn cầu, đặc biệt là nông nghiệp.
Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng có khả năng thích ứng cao với
bất lợi thời tiết là hết sức cần thiết và cấp bách.
Việt Nam là một trong những quốc gia được dự đoán là bị ảnh hưởng nhiều
nhất do tác động bởi biến đổi khí hậu. Diễn biến thời tiết trong những năm gần đây
cho thấy hạn đã và đang là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất
cây trồng; thậm chí có nơi, có vụ hạn gây thất thu làm sản lượng nông nghiệp không
ổn định. Vì vậy, việc tạo ra các giống cây trồng có tính kháng hạn cao có ý nghĩa
đặc biệt quan trọng góp phần tăng năng suất, xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội,
tăng dân trí và vị thế quốc gia.
Từ hàng ngàn năm về trước, con người đã biết tạo ra giống cây trồng mang
các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa hai dòng
mang gen mong muốn). Tuy nhiên, phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức
và trong nhiều trường hợp, cây lai thu được kèm cả tình trạng không mong muốn.
Ngày nay, các nghiên cứu hệ gen đã xác định đặc tính, chức năng của các gen hữu
ích và kỹ thuật di truyền đã chuyển trực tiếp các gen hữu ích vào các đối tượng cây
trồng khác nhau và tạo ra các cây trồng chuyển gen mang các đặc tính quý như

tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất
lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hóa học cần sử dụng…
Trong những năm vừa qua, hàng loạt các nghiên cứu chuyển các gen hữu ích
vào các đối tượng cây trồng đã được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm và kết quả
đã tạo được nhiều giống cây trồng chuyển gen mang các đặc tính quý như chống
sâu, kháng thuốc diệt cỏ, năng suất cao, chất lượng tốt.... Đặc biệt một số giống

1


chuyển gen đã được thương mại và diện tích gieo trồng ngày càng tăng trong sản
xuất, đáp ứng được kỳ vọng của thực tế sản xuất.
Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen, vì vậy mặc dù rất nhiều nghiên cứu
tạo giống cây trồng chuyển gen chịu hạn đã được nghiên cứu trong những năm qua
nhưng kết quả là vẫn chưa có giống cây trồng chịu hạn thương mại hóa [9, 54, 60].
Gần đây, xu hướng tạo giống cây trồng chuyển gen chịu hạn đang tập trung vào các
nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn (gen điều khiển chịu hạn) vì những lý do:
(1) sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn liên quan chặt chẽ đến quá
trình phiên mã, (2) các gen điều khiển tính chịu hạn mã hoá các protein có khả năng
hoạt hoá sự biểu hiện của hàng loạt các gen chức năng liên quan đến chịu hạn thông
qua quá trình phiên mã và kết quả là thực vật tăng cường tính chịu hạn. Điều này
giải thích vì sao tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen nhưng chỉ cần chuyển một
gen điều khiển tính chịu hạn có thể tăng sức chống hạn của cây chuyển gen. Vì vậy,
việc phân lập và nghiên cứu đặc tính của các gen điều khiển đang trở thành vấn đề
thời sự mang tính toàn cầu cả về nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu áp dụng. Hiện
đã có rất nhiều công bố chuyển thành công các gen điều khiển chịu hạn vào cây mô
hình Arabidopsis, lúa, cà chua, đậu tương, ngô...
Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati“
Với những mục tiêu chính như sau:
- Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 điều khiển tính chịu hạn ở lúa.
- Tập trung tối ưu hoá quy trình chuyển gen và thao tác di truyền trên cây lúa.
- Tạo ra cây lúa chuyển gen OsNAC6 có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. NÔNG NGHIỆP TRONG ĐIỀU KIỆN BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU
1.1.1. TÌNH HÌNH BIẾN ĐỔI KHÍ HẦU TOÀN CẦU


Theo Bộ Tài nguyên- Môi trường, biến đổi khí hậu đã và đang diễn ra trên
phạm vi toàn cầu, khu vực và ở Việt Nam. Biến đổi khí hậu đã và sẽ tác động
nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi thế giới, trong đó
có Việt Nam.
Biến đổi khí hậu chính là sự thay đổi của hệ thống khí hậu gồm khí quyển, thuỷ
quyển, sinh quyển, thạch quyển hiện tại và trong tương lai bởi các nguyên nhân tự
nhiên và nhân tạo trong một giai đoạn nhất định từ tính bằng thập kỷ hay hàng triệu
năm. Sự biển đổi có thể là thay đổi thời tiết bình quân hay thay đổi sự phân bố các
sự kiện thời tiết quanh một mức trung bình. Sự biến đổi khí hậu có thể giới hạn
trong một vùng nhất định hay trên toàn Địa Cầu. Trong những năm gần đây, biến đổi
khí hậu được gọi chung bằng hiện tượng nóng lên toàn cầu. Nguyên nhân chính của
hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu là do sự gia tăng các hoạt động tạo ra các chất
thải khí gây hiệu ứng nhà kính (bao gồm hơi nước, CO2, CH4, N2O, O3, các khí CFC),
các hoạt động khai thác quá mức các bể hấp thụ và bể chứa khí nhà kính như sinh
khối, rừng, các hệ sinh thái biển, ven bờ và đất liền khác.
Theo Trung tâm Nghiên cứu Khí tượng - Khí hậu (Viện Khoa học Khí tượng
thủy văn và Môi trường), tình hình biến đổi khí hậu ở Việt Nam đang diễn ra theo
chiều hướng gia tăng tần suất và cường độ của các hiện tượng bão, mưa lớn, nhiệt
độ cao và hạn hán. Thời tiết trong năm 2010 diễn biến phức tạp, bất thường, dịch
bệnh trên cây trồng, vật nuôi xảy ra ở nhiều huyện thị, hạn hán nặng ở vụ hè thu, lũ
lụt hồi tháng 10/2010 đã gây ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất nông nghiệp của
người dân. Theo Phó phòng Dự báo khí tượng hạn vừa và dài (Trung tâm dự báo
Khí tượng-Thủy văn Trung ương) Nguyễn Đức Hoà thì trong những tháng tiếp theo
của mùa khô 2010, ở Bắc bộ, đặc biệt là Bắc Trung bộ hạn hán sẽ gay gắt hơn nhiều

3


so với năm ngoái. Cùng với đó, vào đầu vụ từ tháng 1 đến tháng 3-2011, mực nước
trên các sông lớn sẽ ở mức thấp hơn TBNN, trong khi đó độ mặn vùng cửa sông
khả năng cao hơn TBNN, nước mặn sẽ xâm nhập sâu vào các cửa sông và thẩm
thấu ngầm, ảnh hưởng đến nhiều diện tích canh tác của các địa phương ven biển.
Do vậy khả năng vào vụ có thể thiếu hụt lượng nước tưới tiêu tương đương với
khoảng 200.000 ha. [80]
1.1.2. ẢNH HƢỞNG CỦA BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU ĐẾN SẢN XUẤT
NÔNG NGHIỆP

Nông nghiệp thế giới hiện nay đang đối mặt với những khó khăn lớn do tình
trạng biến đổi khí hậu gây ra. Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên
xảy ra ở các tỉnh miền Bắc. Tính trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7 năm nay đã
ảnh hưởng nghiêm trọng vùng trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu
hẹp 60% diện tích trồng trọt. Ấn Độ đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm
trọng nhất trong vòng 7 năm qua. Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi
vào tình trạng hạn hán. Thiếu hụt lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh
tế của quốc gia này giảm sút 1% trong năm nay. Đợt hạn hán tồi tệ nhất trong lịch
sử gần 20 năm qua tại Thái Lan trong năm nay đang đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn
nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu. Thông báo mới nhất cho biết, sản lượng
gạo của nước này trong vụ mùa tới, kết thúc vào tháng 8, có thể chỉ đạt 2 triệu tấn
so với mức dự báo 5 triệu tấn trước đó.
Chưa bao giờ vấn đề biến đổi khí hậu (BĐKH) lại được đề cập nhiều và nóng
bỏng như trong thời điểm này. Theo nghiên cứu mới nhất của Liên Hợp Quốc [81],
Việt Nam sẽ là quốc gia bị ảnh hưởng nhiều nhất ở khu vực Đông Nam Á từ sự
BĐKH này.
Việt Nam, một nước đang phát triển trong thời kỳ công nghiệp hóa, nằm
trong nhóm nước dễ bị tổn thương bởi các vấn đề môi trường do BĐKH gây ra như
lũ lụt, hạn hán, bão… Bên cạnh đó, với bờ biển dài, vấn đề mực nước biển dâng cao
có thể làm mất 12,2% diện tích đất của Việt Nam và đe dọa tới chỗ sinh sống của
4


17 triệu người. Những biến động thời tiết bất thường gây thiệt hại lớn cho đời sống
dân nhân và đất nước mà chúng ta thường gọi là thiên tai cần được nghiên cứu, xem
xét theo hướng báo động toàn cầu về gia tăng nhiệt độ bề mặt trái đất và mực nước
biển ngày càng dâng cao. Theo nghiên cứu mới nhất chuẩn bị công bố, đến cuối thế
kỷ (2100), nhiệt độ của Việt Nam sẽ tăng lên khoảng 2 đến 4,5oC và mực nước biển
sẽ dâng lên khoảng 10 đến 68 cm. Và nếu sự biến đổi khí hậu cứ diễn ra như với tốc
độ hiện nay thì trong vòng khoảng 100 năm nữa, nhiều diện tích đất liền trên trái
đất, trong đó có vùng đồng bằng châu thổ sông Cửu Long và sông Hồng, có thể sẽ
ngập chìm trong nước biển [81]. Theo ước tính của IPCC, nếu mực nước biển dâng
cao 1 m thì làm cho 22 triệu người Việt Nam mất nhà cửa, đồng bằng Sông Hồng sẽ
bị ngập 5.000 km2 và đồng bằng Sông Cửu Long bị ngập 15.000 - 20.000 km2; mà
đây là hai vựa lúa lớn nhất, tập trung đông dân cư nhất cả nước. Mất đất, sản lượng
lương thực của Việt Nam sẽ giảm 12% (xấp xỉ 5 triệu tấn). Trong khi miền Trung
vẫn chưa hết mùa mưa lũ, các tỉnh miền Bắc lại đang phải gồng mình chống hạn. Sự
thay đổi khắc nghiệt và bất thường của thời tiết đang khiến cả dải đồng bằng sông
Hồng "khát" nước. Mực nước các sông, hồ chứa đều xuống thấp, ba hồ thuỷ lợi lớn
của miền Bắc là Hoà Bình, Thác Bà, Tuyên Quang hiện mới chỉ tích được hơn 5,2 tỉ
m3, còn thiếu hơn 4,5 tỉ m3 so với thiết kế, đe doạ ảnh hưởng nghiêm trọng đến an
ninh lương thực [82].
Theo tính toán của Tổng cục Thuỷ lợi, nếu kéo dài tình trạng ít mưa như hiện
nay thì sẽ có khoảng 650.000 ha lúa Đông Xuân 2010- 2011 rơi vào cảnh thiếu
nước tưới. Trong khi đó, nhận định của Trung tâm Dự báo Khí tượng Thuỷ văn
Trung ương cho thấy, thời tiết từ nay đến cuối năm và đặc biệt đúng thời điểm gieo
cấy vụ Đông Xuân sẽ rất khắc nghiệt do khô hạn tiếp tục kéo dài. Đến hết năm
2010, dòng chảy các sông Bắc Bộ từ thượng lưu đến hạ lưu giảm nhanh và có khả
năng nhỏ hơn mức trung bình nhiều năm (TBNN) từ 20-40%. Trong đó, 2 hệ thống
sông chính là sông Hồng và sông Thái Bình sẽ thiếu hụt với mức 35-45%.

5


1.2. HẠN VÀ PHÂN LOẠI HẠN
1.2.1. KHÁI NIỆM HẠN

Tất cả các sinh vật trên Trái đất đềucần có nước để duy trì các hoạt động
sống của cơ thể, vì vậy nước có ý nghĩa sống còn đối với sinh vật, đặc biệt là thực
vật – những sinh vật không có khả năng di chuyển để tìm nguồn nước. Lượng nước
cần thiết cho cơ thể thực vật phụ thuộc vào từng loài và từng giai đoạn phát triển
của chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm chỉ sự thiếu nước do môi trường gây
ra trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đọan phát triển, làm ảnh hưởng đến
quá trình sinh trưởng và phát triển.
Mức độ tổn thương của thực vật do khô hạn gây ra có nhiều mức độ khác
nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường. Khả năng giảm thiểu mức
độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính chịu hạn” của thực vật và những
cây trồng có khả năng phát triển bình thường trong điều kiện khô hạn gọi là “cây
chịu hạn”. Khả năng có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra
gọi là “tính chịu hạn” của thực vật [3].
Tuy nhiên, rất khó để xác định được thế nào là trạng thái hạn đặc trưng vì
mức độ khô hạn do môi trường gây ra khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng
vùng địa lý và không thể dự đoán trước được. Mức độ khô hạn do môi trường gây
nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, làm giảm năng suất cây trồng,
thậm chí có thể dẫn đến mất mùa... [61]
Các yếu tố của môi trường như thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu,
nhiệt độ cao, gió nóng... gây nên hiện tượng mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa
cây và môi trường, dẫn đễn sự thiếu hụt nước trong tế bào, gây ra hiện tượng hạn
hán. Hạn được phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện
[11].

6


1.2.2. PHÂN LOẠI HẠN

1.2.2.1. Hạn không khí
Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp
(< 65%). Hiên tượng này thường gặp ở những tỉnh miền Trung nước ta vào những
đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông. Hiện tượng này còn xuất hiện
ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel; gió Mistral ở miền nam nước
Pháp… đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loài cây trồng như phong lan,
cam, chanh, đậu tương…. [56].
Hạn không chỉ ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây như hoa, lá, chồi
non… nhất là ảnh hưởng đến quá trình tung phấn của cây. Đối với thực vật nói
chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời
vì nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát hơi nước nhanh vượt qua mức độ
bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, cây lâm vào tình
trạng mất cân bằng về nước. Nước cũng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và giai
đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa hóa sinh, là môi trường để các phản ứng
trao đổi chất xảy ra [63]. Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho cây chính là một biện
pháp canh tác quan trọng. Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây
trồng là một trong những mục tiêu của các nhà tạo chọn giống.
Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh
trưởng của cây. Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng
sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi
bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn
thương và chết.
1.2.2.2.

Hạn đất

Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề măt và khả
năng giữ nước của đất. Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến
mức cây không thể lấy nước qua tế bào rễ, vì thế hạn đất có thể gây ra cho cây héo
lâu dài. Hạn đất tác động trực tiếp đến bộ phận rễ làm ảnh hưởng rất lớn đến quá
7


trình sinh trưởng và phát triển của cây. Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh
hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm. Lượng nước trong đất
không đủ làm co mầm và héo; nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết.
1.2.2.3.

Hạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng
một lúc. Trong trường hợp này, cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm
lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút
nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ
cung cấp cho cây. Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây
không có khả năng phục hồi. Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy ra ở các tỉnh
miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh…), gây nên thiệt hại đáng kể cây trồng nói chung
và cây lúa nói riêng.
1.3. PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN
Điều kiện bất lợi môi trường gây ra hàng loạt các thay đổi về hình thái, sinh
lí, sinh hoá và phân tử, ảnh hưởng bất lợi cho sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Trong các điều kiện bất lợi môi trường, hạn là một trong những yếu tố quan trọng
nhất, đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu. Điều kiện hạn hán sẽ làm
cho thực vật phải tạo ra hàng loạt các thay đổi về mặt sinh lý để tồn tại và thích nghi
với điều kiện hạn như: Cụ thể hạn hán sẽ dẫn đến việc thực vật đóng các khí khổng,
giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô, chậm quá trình sinh
trưởng. Ở mức độ phân tử, điều kiện hạn sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu
hiện và tích luỹ của các gen/protein chống chịu stress [15, 59, 74].
Ở Arabidopsis, các protein như kinase, nhân tố phiên mã (transcription factor),
phosphatase, protease, protein biểu hiện trong giai đoạn muộn của phôi (late
embryogenesis abundant(LEA), protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), các
protein sinh tổng hợp đường (proline, mannitol, sorbitol) và hàng loạt các protein
chức năng khác tham gia vào quá trình chịu hạn ở thực vật [59].

8


Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật được phân thành hai
nhóm: (1) nhóm protein chức năng trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn
(ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol...); (2) nhóm protein điều khiển sự biểu hiện
của các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase...).
Các nhân tố phiên mã này bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gen
của các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của các
gen này, kết quả là tăng cường tính chịu hạn ở thực vật. Các nghiên cứu về gen đã
chứng minh vùng khởi động gen của nhiều gen chức năng chứa một hoặc nhiều
trình tự ADN đặc hiệu là điểm bám của một nhân tố phiên mã. Điều này chứng tỏ
một nhân tố phiên mã có thể hoạt hóa biểu hiện của nhiều gen chức năng. Các
nghiên cứu biểu hiện gen đã chứng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu hiện mạnh trong
điều kiện hạn chứng tỏ nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa
và biểu hiện của các gen tăng cường tính kháng hạn ở thực vât. [60, 74].

9


Điều kiện hạn
hán
Nhóm gen nhận, truyền tín hiệu
(G protein, Kinase…)
Các gen điều khiển
biểu hiện
Các nhân tố khởi đầu phiên mã
Các gen chức năng

(DREB, NAC, ZFHD, AREB, MYB, MYC,
…)

biểu hiện
Các gen chức năng
(late embryogenesis abundant (LEA), chaperones, proteases,
transporters, sugars, proline, mannitol, sorbitol...)

Thực vật tăng cường tính chịu hạn

Hình 1. Cơ chế phân tử của quá trình tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật
1.3.1. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CÁC QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA

Sự thay đổi chuyển hóa sơ cấp trong cơ thể là một cách đáp ứng thông
thường với điều kiện stress ở thực vật. Ví dụ, một cADN mã hoá cho enzym
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase được phân lập từ cây C. plantagineum
(bảng 1) tăng cường biểu hiện khi bị xử lý trong điều kiện hạn và xử lý ABA [68].
Tuy nhiên các mức độ tăng cường hoạt động của enzym có liên quan với các yếu tố
stress môi trường ở thực vật, phản ánh sự gia tăng nhu cầu về năng lượng. Các
protease có thể cũng là một đặc điểm quan trọng của các quá trình chuyển hoá
trong điều kiện stress. Chúng góp phần làm ngừng việc sử dụng các protein thừa và
phân hủy các chuỗi peptit trong các túi chứa, qua đó giải phóng các axit amin tự do

10


để sử dụng cho việc tổng hợp số lượng lớn các protein mới (bảng 1 và 2, [24]).
1.3.2. CÁC GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH BIẾN ĐỔI TÍNH THẤM CỦA TẾ BÀO

Thực vật có thể giữ được thế nước (giúp duy trì dòng chảy của nước trong
cây) trong điều kiện khô hạn nhẹ bằng cách biến đổi tính thấm của tế bào, quá trình
này bao gồm việc tận dụng các phân tử đường hay các giải pháp tương thích khác
[12]. Cả các kênh dẫn nước và ion đều có vai trò quan trọng như nhau trong việc
điều hòa dòng chảy của nước và sự liên hệ giữa các kênh này với điều kiện stress
hạn đã được khẳng định qua việc phân lập được các gen mã hóa cho protein của
các kênh này, biểu hiện trong việc đáp ứng sự khô hạn.
Phân tử cADN 7a từ cây đậu Hà Lan (bảng 2, [24]) mã hóa một chuỗi peptit với
các điểm đặc trưng của các kênh dẫn ion, trong khi phân tử cADN RD28 từ cây A.
thaliana (bảng 1, [72]) và có thể là cả phân tử cADN H2-5 từ cây C. plantagineum đều
mã hóa cho protein của các kênh dẫn nước [16].
1.3.3. CÁC GEN THAM GIA BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC

Các nhà khoa học đã chứng minh điều kiện stress hạn là nguyên nhân gây ra sự
biến đổi trong thành phần hóa học, đặc điểm sinh lý của thành tế bào và những sự thay
đổi này có thể liên quan đến các gen mã hóa cho enzym sinh tổng hợp Sadenosylmethionine (bảng 1, [21]). Trong điều kiện binh thường, việc tăng cường
biểu hiện của các gen sinh tổng hợp S-adenosyl- L-methionine có liên quan đến các
vùng đang diễn ra sự hóa gỗ [47]. Do đó, việc tăng cường biểu hiện trong các mô
chịu điều kiện stress hạn có thể dẫn đến việc hóa gỗ của thành tế bào. Quá trình
kéo dài tế bào bị dừng lại dưới điều kiện stress hạn kéo dài liên tục và ngay sau đó
các quá trình hóa gỗ được khởi động [44].

11


Bảng 1. Các gen đƣợc tăng cƣờng biểu hiện bởi stress hạn và mã hoá
cho chuỗi polypeptide của các protein có chức năng đã biết (J.Ingram và D.
Bartels)

Espartero và cộng sự đã chứng minh được ở nấm sự thiếu nước có thể gây ra
hiện

tượng đồng cảm ứng phiên mã enzym sinh tổng hợp S-adenosyl-L-

methionine với các enzym khác như enzym thủy phân S-adenosyl-L-homocystein
12


hay một enzym chuyển hóa methyl cần thiết cho việc tạo thành tế bào [21].
Bảng 2. Các cADN tăng cƣờng biểu hiện trong điều kiện hạn nhƣng
chức năng chƣa xác định (J.Ingram và D. Bartels)

1.3.4. CÁC GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH PHÁ HỦY VÀ KHÔI PHỤC

Các gen cảm ứng với điều kiện hạn mã hóa cho các protein có trình tự tương
đồng với các enzym phân hủy protein đã được phân lập từ P. sativum (bảng 2,
[24]) vµ A. thaliana (bảng 1 và 2 [8, 35, 36, 70]). Một trong những chức năng của
các enzyme này là phá hủy các protein bị mất chức năng do tác động của điều kiện hạn
13


[24]. Trong giai đoạn đầu của quá trình bị hạn hán, A. Thaliana tăng cường tổng hợp
các phân tử ARN thông tin mã hóa cho các protein ubiquitin có hoạt tính mạnh [35].
Một protein dung hợp trong nhóm này có hoạt tính ubiquitin được phát hiện ra trong
quá trình dung giải protein và sự gia tăng này có thể tương đồng với việc phân hủy
protein đã xảy ra vì quá trình gắn ubiquitin có vai trò xác định protein cho quá trình
phân hủy
Sản phẩm của gen cảm ứng điều kiện hạn được phân lập bằng phương pháp
sàng lọc biệt hóa có trình tự tương đồng với các protein shock nhiệt (bảng 2; [35]).
Các gen mã hóa cho các protein này có thể là các chaperonin, có liên quan đến việc
sửa chữa protein thông qua sự trợ giúp các các phân tử protein khác để phục hồi
cấu trúc tự nhiên của protein sau khi bị phá hủy hay gấp nếp sai trong quá trình bị
hạn. Các protein shock nhiệt có khối lượng phân tử nhỏ cũng có thể là các
chaperonin.
1.3.5. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN VIỆC LOẠI BỎ ĐỘC TỐ

Các enzym liên quan đến việc loại bỏ độc tố trung gian trong các quá trình
chuyển hóa hiếu khí như khử hóa glutathione, bẻ gẫy liên kết superoxide được tăng
cường trong quá trình đáp ứng lại stress hạn chứng tỏ chúng có vai trò quan trọng
trong các quá trình chống chịu [39]. Việc giảm lượng nước ở lá và đóng khí khổng
dẫn đến việc giảm lượng CO2 [58]. Sự gia tăng hoạt động hô hấp sáng trong quá
trình hạn hán cũng đồng thời xảy ra do có sự tăng cường các hoạt động oxi hóa
glycolate, dẫn đến việc tạo ra các phân tử H2O2 [39]. Điều này có thể giải thích tại sao
các gen mã hóa cho các enzym có hoạt tính loại bỏ độc tố như ascorbate peroxidase
(bảng 1; [39]) và superoxide dismutase (bảng 1; [49, 69]) lại tăng cường biểu hiện trong
quá trình đáp ứng hạn hán.

14


Hình 2. Phân loại các gen biểu hiện đáp ứng với điều kiện hạn ở thực vật
1.4.

CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN CÁC GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Dòng chảy di truyền từ ADN đến protein trải qua quá trình rất quan trọng là quá
trình phiên mã. Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng
khởi động gen của các gen đích và điều hòa biểu hiện các gen này.

15


Hình 3. Mô hình quá trình phiên mã
Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8 - 10 % trong mỗi hệ
gen và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động của sự sống như quá trình sinh
trưởng, phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường... Ở lúa, hơn 2600 gen mã
hóa nhân tố phiên mã đã được phân lập và phân chia thành các nhóm, họ và siêu họ
dựa theo trình tự nucleotide và chức năng. Rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã
liên quan đến chịu hạn đã được nghiên cứu chức năng ở mức độ phân tử.
Đặc điểm đặc trưng của các protein điều khiển (nhân tố phiên mã) là có hai
vùng hoạt động (domain): (1) vùng hoạt hoá các protein chức năng (activation
domain) và (2) vùng liên kết (binding domain) với các trật tự ADN đặc hiệu (cisacting element) trên vùng điều khiển của gen (promoter). Các nhân tố phiên mã
điều khiển các gen chịu hạn được phân loại dựa vào trật tự ADN đặc hiệu mà
chúng liên kết. Vùng khởi động (promoter) của hầu hết các gen liên quan đến tính
chịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trật tự ADN đặc hiệu phổ biến là: ABRE
(ABA responsive element - yếu tố đáp ứng ABA) và DREB/CRT (Dehydration
responsive element/C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng hạn), NAC, MYB...
với chức năng tương ứng là điểm bám của các protein điều khiển quá trình phiên

16


mã biểu hiện phụ thuộc và không phụ thuộc vào nồng độ ABA (hình 4)

Hình 4. Hệ thống điều khiển phiên mã của vùng ADN đặc hiệu và nhân
tố phiên mã điều khiển biểu hiện các gen chức năng tham gia phản ứng chống
chịu với điều kiện bất lợi ở Arabidopsis

1.4.1. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN KHÔNG PHỤ THUỘC ABA

a. Nhóm nhân tố NAC
Các nhân tố phiên mã họ NAC chứa trình tự đồng nhất (đầu tiên được phát
hiện từ petunia NAM, từ Arabidopsis ATAF1, ATAF2 và CUC) gọi là vùng hoạt
động NAC ở đầu N-tận cùng, là một họ gen đặc trưng của thực vật có vai trò quan
trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi [50]; biệt hóa các cơ quan rễ, hoa
trong sinh trưởng phát triển thực vật [7]; phản ứng với điều kiện bị tổn thương và
tác nhân gây hại tấn công [7; 14]. Có ít nhất 100 gen NAC trong hệ gen
Arabidopsis và 75 gen NAC trong hệ gen lúa đã được phân lập nhưng chỉ một số ít
17


gen NAC được nghiên cứu chức năng [46]. Phần lớn protein của gen NAC chứa
đựng vùng bám ADN ở tận cùng đầu N có độ bảo thủ cao, trình tự tín hiệu định vị
nhân và một vùng tận cùng đầu C biến đổi [29].
Dựa vào phân tích trình tự axit amin, các gen thuộc nhóm NAC ở thực vật
có thể được chia thành vài phân họ như NAM, ATAF và OsNAC3. Ở lúa, OsNAC1
và OsNAC2 được xếp vào trong phân họ NAM. Trong phân họ này còn bao gồm
NAM và CUC. Trong khi đó, OsNAC5 và OsNAC6 thuộc hoàn toàn phân họ
ATAF. Ngoài những thành phần của các phân họ này thì trong bộ gen của lúa còn
có các gen OsNAC3, OsNAC4 (thuộc phân họ OsNAC3), OsNAC7 và OsNAC8.
Trật tự ADN đặc hiệu NACR bao gồm 62 nucleotide lần đầu tiên được phát
hiện trên đoạn điều khiển gen ERD1 (early responsive to dehydration-1) liên quan
đến tính kháng hạn ở thực vật. Sản phẩm protein của ba gen điều khiển quá trình
phiên mã thuộc nhóm gen NAC bám vào trật tự ADN đặc hiệu NACR (14bp
CACTAAATTGTCAC và trình tự lõi CATGTG giống MYC) trên đoạn điều khiển
các gen tăng cường tính kháng hạn làm cho các gen này biểu hiện mạnh và kết quả
là cây chuyển gen có tính kháng rất cao với điều kiện hạn. Các phân tích ADN
microarray về sự liên quan giữa biểu hiện của các gen điều khiển quá trình phiên
mã thuộc nhóm NAC với biểu hiện của các gen liên quan đến tính kháng hạn cũng
đã đưa ra kết luận là khi các gen điều khiển quá trình phiên mã biểu hiện trong cây
chuyển gen đã hoạt hoá sự biểu hiện của một số gen chức năng sinh ra trong điều
kiện hạn [65]. Từ nghiên cứu về khả năng điều khiển tính chịu hạn của nhóm gen
NAC trên Arabidopsis, nhóm nghiên cứu của Lizhong Xiong ( Trung tâm Quốc gia
về nghiên cứu gen thực vật Trung Quốc) đã phân lập gen OsNAC1 và chuyển vào
lúa. Cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và qua phân tích ADN
microarray thì sự biểu hiện của gen ngoại sinh OsNAC1 đã hoạt hóa hàng loạt gen
chức năng liên quan đến tính chịu hạn. Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng cho
thấy các cây lúa chuyển gen OsNAC1 cho năng suất cao hơn 22-34% so với các
cây đối chứng ở điều kiện hạn [29]. Tương tự nhóm nghiên cứu của Shinozaki đã
phân lập và nghiên cứu đặc tính gen OsNAC6 và cho kết quả là các cây lúa chuyển
18


gen tăng cường tính chịu hạn, mặn, lạnh. Đặc biệt, ngoài việc tăng cường tính
chống chịu với bất lợi thời tiết, cây lúa chuyển gen OsNAC6 còn tăng cường tính
kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng [42]. Gần đây, gen NAC ở lúa ONAC045
cũng được công bố liên quan đến tính chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường.
Gen ONAC045 định vị ở nhân và biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn, mặn, lạnh và
xử lý ABA. Cây lúa chuyển gen ONAC045 tăng cường tính chịu hạn, mặn [77].
b. Nhóm nhân tố DREB2
Hai gen DREB2A và DREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện hạn và hoạt hoá
các gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn của thực vật. Tuy nhiên biểu hiện
của các gen DREB2A và DREB2B không làm tăng tính kháng hạn ở các cây
Arabidopsis chuyển gen chứng tỏ nhóm gen này cần quá trình sửa đổi sau phiên
mã ví dụ như qua quá trình phosphoryl hóa để chuyển protein sang dạng hoạt hoá
[38]. Gen DREB2A được thay đổi cấu trúc để loại bỏ 30 axit amin tương ứng với
trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra dạng DREB2ACA. Kết quả, sự biểu hiện của gen
DREB2ACA giúp cây chuyển gen Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn.
Các phân tích sử dụng kỹ thuật ADN microarray và Northern blot đã chứng minh
là gen DREB2ACA điều khiển sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng tham gia
vào tính kháng hạn ở thực vật [56]. Gen ZmDREB2A cũng đã được phân lập và
nghiên cứu đặc tính chi tiết ở ngô. Không giống như ở Arabidopsis (DREB2A),
gen ZmDREB2A tạo ra hai dạng phiên mã và qua phân tích RT- PCR thì chỉ có
dạng phiên mã có hoạt tính sinh ra đáng kể trong điều kiện hạn. Ngoài ra, qua thí
nghiệm phân tích hoạt hoá phiên mã (transactivation assay) ở tế bào trần
Arabidopsis thì ZmDREB2A có hoạt tính hoá quá trình phiên mã (transactivation
activity) mạnh hơn nhiều DREB2A. Vì vậy quá trình sửa đổi sau dịch mã là không
cần thiết trong việc tạo ra protein hoạt tính trong trường hợp gen ZmDREB2A. Sự
biểu hiện liên tục gen ZmDREB2A làm tăng cường tính chịu hạn rõ rệt trong các
cây chuyển gen. Kết quả này cho thấy có sự khác nhau về cơ chế điều khiển tính
chịu hạn trong cùng nhóm gen giữa cây mô hình hai lá mầm (Arabidopsis) và cây
một lá mầm [52].
19


Gần đây, nhóm gen mới ở lúa OsRap2.4A/DBF1 biểu hiện mạnh trong điều kiện
hạn được phân lập bằng phương pháp one hybrid sử dụng mồi là 4 đoạn ADN lặp lại,
mỗi đoạn gồm 50 nucleotide chứa trật tự ADN đặc hiệu DRE định vị sau hộp TATA trên
promoter JRC2606 (Glutamate dehydrogenase-like proteins).
1.4.2. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN PHỤ THUỘC ABA
a. Nhóm nhân tố ABRE/ABF
Trật tự ADN đặc hiệu ABRE có trình tự lõi là ACGTGGC lần đầu tiên được
phát hiện nằm trên đoạn điều khiển gen Em ở lúa mì [25], gen RAB16 ở lúa [40].
Hai nhóm protein điều khiển quá trình phiên mã AREB/ABF bám vào trật tự ADN
đặc hiệu ABRE trên các đoạn ADN điều khiển và hoạt hoá sự biểu hiện các gen
liên quan đến tính kháng hạn và kết quả là tăng cường tính kháng hạn ở các cây
chuyển gen [67]. Trên cây mô hình Arabidopsis, biểu hiện của gen ABF3 hoặc
AREB2/ABF4 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn [32], trong khi
đó biểu hiện của gen ABF2 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn,
mặn và nhiệt độ cao[34].
b. Nhóm nhân tố MYB và MYC
Hai gen điều khiển quá trình phiên mã ở Arabidopsis có tên gọi là AtMYC2
và AtMYB2 cũng được công bố bám vào trật tự ADN đặc hiệu MYC (CANNTG)
và MYB (C/TAACNA/G) trên đoạn điều khiển gen RD22. Gen RD22 mã hóa
protein đồng nhất với protein ở hạt và có vai trò quan trọng trong quá trình sinh
tổng hợp protein. Biểu hiện các gen AtMYC và AtMYB làm cho câyArabidopsis
chuyển gen có ngoại hình mẫn cảm với ABA và có tính kháng hạn cao [6].

c. Nhóm nhân tố DREB1/CBF

20


Trật tự ADN đặc hiệu DRE/CRT có trình tự lõi là A/GCCGAC lần đầu tiên
được phát hiện nằm trên đoạn điều khiển gen RD29 ở Arabidopsis[73] và sau này
được phát hiện trên rất nhiều đoạn điều khiển gen của các gen sinh ra trong diều
kiện hạn và lạnh [9; 64]. Các gen điều khiển quá trình phiên mã thuộc nhóm AP2
(APETALA2)/ethylene-responsive element-binding factor (ERF) bám vào trật tự
ADN đặc hiệu DRE và được đặt tên là: DREB1/CBF và DREB2[74]. Trên cây mô
hình, biểu hiện của gen DREB1A/CBF3, DREB1B/CBF1, DREB1C/CBF2 dẫn đến
cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn, mặn và lạnh [26;33; 38]. Trong khi đó,
biểu hiện của gen DREB1D/CBF4 dẫn đến cây chuyển gen chỉ tăng cường tính
kháng hạn [28]. Các gen DREB1/CBF cũng đã được phân lập ở các cây trồng khác
nhau như như đậu tương, súp lơ, cà chua, cỏ linh lăng, thuốc lá, anh đào, dâu tây,
lúa mì, lúa, lúa mạch, lúa mạch đen, ngô[76].
Điều thú vị là khi chuyển các gen OsDREB1/CBF ở lúa, ZmDREB1/CBF ở
ngô vào cây mô hình Arabidopsis hoặc các gen DREB1/CBF ở Arabidopsis vào lúa
cho kết quả tương tự về chức năng của nhóm gen này trong việc tăng cường tính
chống chịu của cây chuyển gen với điều kiện thời tiết bất lợi [20;45; 30; 53]. Điều
này chứng tỏ có sự tương đồng về chức năng của các gen điều khiển quá trình
phiên mã ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm và mở ra triển vọng tốt cho việc
tăng cường tính kháng hạn ở thực vật thông qua việc chuyển gen điều khiển từ các
đối tượng cây trồng khác nhau. Hiện tại, các gen điều khiển DREB1/CBF đã và
đang được sử dụng có hiệu quả trong việc tăng cường tính chống chịu với bất lợi
của thời tiết trên nhiều đối tượng cây trồng trong điều kiện nhà kính và sản xuất
thử nghiệm trên đồng ruộng như lúa [45; 30], lúa mì [48], khoai tây [13], cà chua
[28].

1.4.3. NHÓM CÁC GEN ĐIỀU KHIỂN ĐÁP ỨNG HẠN KHÁC
21


Gần đây, các nhóm gen điều khiển khác như protein kinase và các gen tham
gia vào quá trình sinh tổng hợp ABA cũng đang được xem là vấn đề thời sự trong
các nghiên cứu nhằm tăng cường tính kháng hạn ở thực vật. Các protein kinase xúc
tác việc chuyển một nhóm phosphate từ các hợp chất giàu năng lượng như ATP tới
các protein trong tế bào thông qua phản ứng phosphoryl hóa và làm cho các protein
đó chuyển sang dạng hoạt động. Vì vậy, các protein kinase đóng vai trò đặc biệt
quan trọng trong việc tăng hoặc giảm hoạt tính protein và trong quá trình truyền tín
hiệu từ các tín hiệu bề mặt tế bào đến các protein điều khiển, các protein chức năng
trong tế bào. Với khía cạnh chịu hạn, các protein kinase truyền tín hiệu hạn từ môi
trường đến nhóm gen điều khiển phiên mã và hoạt hóa các gen này. Khi các gen
điều khiển quá trình phiên mã hoạt động sẽ hoạt hoá các gen chức năng tham gia
vào tính kháng hạn. Ngoài ra, các protein kinase còn tham gia trực tiếp vào quá
trình hoạt hoá các gen chức năng sinh ra trong điều kiện hạn.
Nhóm protein kinase SnRK2 bao gồm 10 thành viên được phát hiện ở
Arabidopsis và lúa. OST/SRK2E đóng vai trò trong vận chuyển tín hiệu ABA và
kiểm soát hoạt động đóng mở khí khổng, SRK2s hoạt hoá trong điều kiện hạn, mặn
và ABA [75; 41]. SRK2C hoạt hóa trong điều kiện hạn, mặn và xử lý ABA, biểu
hiện rất mạnh ở đầu rễ và tham gia vào phản ứng của rễ với điều kiện hạn. SRK2C
đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tăng cường tính kháng hạn ở thực vật
thông qua việc hoạt hóa các gen tham gia vào tính chịu hạn [66].
Gen OsMAPK5 cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính ở lúa. Biểu
hiện gen OsMAPK5 trong cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và
lạnh trong khi ức chế sự biểu hiện của gen OsMAPK5 trong cây chuyển gen tăng
cường tính kháng cao với các bệnh đạo ôn (Magnaporthe grisea), bệnh thối hạt do
vi khuẩn (Burkholderia glumae). Kết quả này mở ra tiềm năng áp dụng gen
OsMAPK5 trong các cây chuyển gen nhằm tăng cường tính chống chịu với cả điều
kiện sinh học và phi sinh học [71]. ABA là một hoormon thực vật đóng vai trò
quan trọng trong các phản ứng của thực vật với ngoại cảnh bất lợi thông qua việc
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein trong giai đoạn phát triển phôi hạt và
22


các bộ phận già cỗi. Gen mã hoá 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) là
enzym đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong sinh tổng hợp ABA, biểu hiện của
NCED đã tăng cường tính kháng hạn trong các cây chuyển gen [31]. Gần đây, gen
mã hoá ABA 8-hydroxylase là enzym tham gia vào việc phân huỷ ABA trong quá
trình hút nước của hạt và chống mất nước cũng đã được phân lập và nghiên cứu
đặc tính [40].
Nhóm protein ADN helicase tương đồng với eIF4A (eukaryote
innitiation factor 4A) có hoạt tính mở xoắn ADN/ARN cũng được phát hiện tham
gia vào việc tăng cường tính chống chịu với điều kiện thời tiết bất lợi ở thực vật.
Gen pdh45 (pea ADN helicase 45 KDa) được phân lập ở đậu Hà Lan; nghiên cứu
chi tiết đặc tính sinh lý, hoá sinh và chuyển vào thuốc lá. Kết quả là các cây thuốc
lá chuyển gen sinh trưởng, kết hạt và cho năng suất bình thường trong điều kiện
mặn liên tục [51, 50]. Gen pdh45 cũng đã được chuyển vào lúa và kết quả là các
cây lúa chuyển gen có tính chịu mặn cao và hiện tại phòng thí nghiệm sinh học
phân tử thực vật - Trung tâm kỹ thuật gen và Công nghệ Sinh học Quốc tế đang thử
tính chịu hạn với các cây lúa chuyển gen pdh45.
1.5.

CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật. Tuy nhiên những
phương pháp có giá trị thực tiễn quan trọng chỉ hạn chế trong hai nhóm phương
pháp chính: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn đất
Agrobacterium.

1.5.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN TRỰC TIẾP

23


Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật chuyển gen thông qua tiếp nhận ADN tinh
chế vào tế bào trần nhờ sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý.
a.

Chuyển gene trực tiếp bằng súng bắn gene ( gene gun).

Nguyên tắc chung của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ ( vi đạn)
bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5-1,5 µm với
dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn
này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5-0,9 cm. Đĩa kim
loại này được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật
liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn áp
suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng sung, viên đạn lớn sẽ bị
cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ ( vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển
với vận tốc lớn tới 1300m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn,
tách các mô, tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của
tế bào mang gen chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là
helium áp lực cao để bắn gen.

a.

Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện ( electroporation).

Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung
điện để chuyển gene vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có
thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần ( protolast) làm cho ADN bên ngoài môi
trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị một huyền phù
protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gene mong muốn cần chuyển vào
thực vật. Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao ( 200-400V/cm) trong khoảng
24


thời gian 4-5 phần nghìn giây. Kết quả là màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng
tạm thời giúp cho plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập vào hệ gene của thực vật. Quá
trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau quá trình xung điện, đem
protolast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường chọn lọc để tách các
protolast đã được biến nạp. Tiếp theo là nuôi cây in vitro, tái sinh cây và chọn lọc
cây chuyển gene.

b.

Chuyển gene trực tiếp nhờ kỹ thuật siêu âm.

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gene vào tế bào trần protoplast. Sau khi tạo
protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn
để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong
hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3 mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20 KHz
theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 miligiây. Số nhịp khoảng từ 6-9 nhịp với
tổng thời gian tác động từ 600 – 900 miligiây. Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi
trong môi trường, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gene. Nuôi cấy in
vitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường bên ngoài.
c.

Chuyển gene trực tiếp bằng phƣơng pháp hóa học.

Là phương pháp chuyển gene vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như
polyethylene glycol (PEG). Khi có mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và
protoplast có thể thu nhận ADN ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp
chuyển gene bằng hóa chất có thể áp dụng đối với nhiều loài thực vật nhưng khả
năng chuyển gene với tần số chuyển gene rất thấp. Tuy nhiên với khả năng tạo ra số
lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của phương pháp này.
25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×