Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tác dụng và cơ chế chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm của cây Chặc Chìu Tetracera scandens (L.) Merr. (TT)

GI I THI U LU N ÁN
1. TÍNH C P THI T C A LU N ÁN
Viêm là một triệu chứng rất phổ biến, là kết quả của nhiều bệnh, do nhiều
nguyên nhân gây ra. Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối
loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể, gây ra nhiều ảnh hư ng
xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của ngư i bệnh. Hiện nay, các thuốc
chống viêm giảm đau đang sử dụng rất đa dạng và phong phú, gồm cả thuốc y
học cổ truyền và các thuốc tân dược có nguồn gốc từ hóa học. Các thuốc tân
dược thư ng có tác dụng nhanh, hiệu quả nhưng thư ng gây nhiều tác dụng
không mong muốn, nhất là dùng lâu dài.
Cây Chặc chìu (dây chiều) có tên khoa học là Tetracera scandens (L.)
Merr., thuộc họ Sổ (Dilleniaceae), là cây phân bố rộng rãi Việt Nam. Theo y
học dân gian Việt Nam, thân Chặc chìu được dùng nhiều làm thuốc chữa tê
thấp, gân xương đau nhức, ứ huyết, phù thũng, đau bụng. Đến nay, đã có một
số công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của Chặc chìu như dọn gốc tự
do, chống oxy hóa và hạ đư ng huyết, nhưng vẫn chưa có một nghiên cứu khoa
học nào về tác dụng chống viêm và giảm đau của cây Chặc chìu.
Để đóng góp cơ s khoa học cho việc điều trị các bệnh viêm đau bằng thuốc
có nguồn gốc dược liệu, nghiên cứu sinh đã thực hiện đề tài “Nghiên c u tác
d ng vƠ c ch ch ng viêm, gi m đau trên th c nghi m c a cây Ch c chìu
(Tetracera scandens (L.) Merr.)” với 2 mục tiêu chính.

2. M C TIÊU C A LU N ÁN
1. Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau của Chặc chìu trên thực nghiệm.
2. Tìm hiểu cơ chế tác dụng chống viêm, giảm đau của Chặc chìu.
3. NH NG ĐịNG GịP M I C A LU N ÁN
Các kết quả nghiên cứu cho thấy dược liệu Chặc chìu và đặc biệt là phân
đoạn EtOAc được công bố có tác dụng chống viêm trên thực nghiệm. Tác dụng
chống viêm thể hiện rõ rệt trên mô hình gây viêm cấp và mạn tính. Khi sử dụng
5 ngày liên tục, Chặc chìu thể hiện khả năng ức chế phù chân chuột gây b i
carrageenan; ức chế lượng dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu và hàm lượng
protein trong dịch rỉ viêm trên chuột bị gây viêm bằng carrageenan và
formaldehyd; ức chế u hạt thực nghiệm trên chuột gây viêm bằng amiăng. Do
đó, có thể hướng đến việc sử dụng dược liệu này để phòng và chống các bệnh
viêm đặc biệt là viêm khớp như đã được sử dụng trong dân gian. Luận án cũng
đánh giá được tác dụng giảm đau của Chặc chìu theo hướng tác dụng giảm đau
ngoại vi, chủ yếu do tác dụng chống viêm đem lại. Đây là lần đầu tiên có một
1


nghiên cứu khẳng định tác dụng chống viêm, giảm đau của chặc chìu hướng
dược lý thực nghiệm một cách có hệ thống dựa trên cơ chế bệnh sinh của viêm
và đau, đưa ra các bằng chứng chứng minh cho công dụng của chặc chìu trong
dân gian.
Luận án cũng đã khảo sát và định hướng được cơ chế chống viêm của Chặc
chìu là do ức chế các enzym có liên quan đến viêm là XO, 5-LOX, COX-2,
đồng th i ức chế sự hình thành NO, ức chế sự hoạt động của COX-2 và NF-B
trong tế bào. Ngoài ra, Chặc chìu cũng có tác dụng hiệp đồng với các chất
chống viêm của tuyến thượng thận và chống viêm thông qua đáp ứng miễn dịch
tế bào. Đồng th i, các thực nghiệm của luận án cũng góp phần hoàn chỉnh thêm
các nghiên cứu về tác dụng chống viêm của Chặc chìu trên động vật thực
nghiệm, như tác dụng dọn gốc tự do và tác dụng chống peroxy hoá lipid.
Luận án cũng đã chứng minh được các hoạt chất có tác dụng chống viêm,
giảm đau và chống oxy hóa của chặc chìu là các flavonoid, trong đó các
flavonoid chính thuộc nhóm flavon là quercetin, kaempferol và các dẫn xuất.
Đây là những thành phần chính của dược liệu chặc chìu, cho thấy các flavonoid
đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình thể hiện tác dụng chống viêm của
dược liệu Chặc chìu.
4. ụ NGHĨA C A LU N ÁN
Đối tượng nghiên cứu (cây Chặc chìu) được xác định đúng giúp kết quả
nghiên cứu về hóa học, sinh học chính xác, tin cậy.
Luận án này là công trình nghiên cứu về dược liệu Chặc chìu (Tetracera

scandens) được tiếp cận theo hướng dược lý thực nghiệm một cách có hệ thống
dựa trên cơ chế bệnh sinh của viêm và đau. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa
học và thực tiễn, là cơ s cho các nghiên cứu ứng dụng Chặc chìu trong y học
dân gian, y học cổ truyền.
Luận án cũng cung cấp thêm một phương pháp tiếp cận khoa học tương đối
đầy đủ, áp dụng các nghiên cứu dược lý thực nghiệm, nghiên cứu trên in vitro
và trên tế bào một dược liệu theo hướng điều trị các bệnh viêm xương khớp,
viêm gây ra sưng đau, bệnh gút và chứng minh cơ chế tác dụng của dược liệu.
5. C U TRÚC LU N ÁN
Luận án gồm 4 chương, 12 bảng, 31 hình, 2 phụ lục, 139 tài liệu tham khảo.
Luận án gồm 119 trang, gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan
(34 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (24
trang); Kết quả nghiên cứu (26 trang); Bàn luận (29 trang); Kết luận và kiến
nghị (4 trang).
2


A. N I DUNG C A LU N ÁN
CH

NG 1. T NG QUAN

1.1. TH C V T H C
Cây Chặc chìu có tên khoa học là Tetracera scandens (L.) Merr., thuộc họ
Sổ (Dilleniaceae). Cây còn có một số tên khác là dây chiều, tích diệp đằng, nha
nhiêu đằng, u chạc chìu (Tày), chong co (Thái).
Chặc chìu phân bố rộng rãi hầu hết các nước vùng nhiệt đới Đông Nam Á,
Nam Á, Trung Quốc. Việt Nam Chặc chìu cũng phân bố khá phổ biến tất
cả các tỉnh thuộc vùng núi thấp (dưới 1000m) và trung du.
1.2. THÀNH PH N HÓA H C VÀ TÁC D NG SINH H C C A CH C
CHÌU
Một điều ngạc nhiên là mặc dù cây mọc phổ biến các nước Đông nam Á,
nhưng hiện nay mới có rất ít các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây
Chặc chìu (Tetracera scandens). Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự có ghi thành
phần hóa học của Chặc chìu gồm isorhamnetin, rhamnetin, azaleatin,
rhamnocitrin nhưng không ghi rõ tài liệu tham khảo. Dưới đây là tổng hợp một
số nghiên cứu về Chặc chìu.
Tác dụng chống đái tháo đường: dịch chiết MeOH của cao Chặc chìu có tác
dụng chống tăng đư ng huyết gây ra b i alloxan. Các dẫn xuất genistein phân
lập từ cao EtOAc của Chặc chìu được đánh giá là có triển vọng trên hoạt động
điều trị đái tháo đư ng typ 2, các hợp chất thử nghiệm kích thích đáng kể sự
hấp thu glucose, kích hoạt (AMPK) adenosin monophosphate, vận chuyển
glucose protein-4 (GLUT-4) và biểu hiện ARNm GLUT-1 và ức chế protein
tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) ức chế trong L6 myotube.
Tác dụng chống oxy hóa: dịch chiết của Chặc chìu có tác dụng chống oxy
hóa mạnh. Dịch chiết MeOH của thân Chặc chìu có tác dụng loại bỏ gốc tự do
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và tác dụng chống lại quá trình oxy hóa
lipid (lipid peroxidation) trên mô hình in vitro.
Tác dụng ức chế ho t động xanthin oxidase: cao chiết MeOH - nước của
cây Chặc chìu (tỉnh Khánh hòa) thể hiện tác dụng ức chế hoạt động xanthin
oxidase (XO) mạnh với giá trị IC50 < 20µg/ml, nên thể hiện tác dụng điều trị gút
và các triệu chứng liên quan như bệnh thấp khớp và viêm khớp. Gần đây, nhóm
này đã phân lập được một số chất có tác dụng ức chế enzym XO từ Chặc chìu.
Ngoài ra, dịch chiết của cây Chặc chìu còn dùng điều trị sốt và cảm cúm,
điều trị rối loạn tiết niệu.
3


CH

NG 2. NGUYÊN V T LI U, TRANG THI T B
VÀ PH
NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 NGUYÊN V T LI U NGHIÊN C U
2.1.1. Đ ng v t thí nghi m
Chuột cống trắng, cả hai giống đực cái, trọng lượng 120-150g. Chuột cống
trắng non, cả hai giống đực cái, trọng lượng 60-70g, do Học viện Quân Y cung
cấp. Chuột nhắt trắng, cả đực và cái, trọng lượng 18-20g, do Viện Vệ sinh dịch
tễ trung ương cung cấp.
2.1.2. Nguyên li u nghiên c u
Cao chiết toàn phần methanol (MeOH), các phân đoạn etylacetat (EtOAc),
butanol (BuOH), cao nước (H2O), n-Hexan của Chặc chìu. Các chất gồm
quercetin, quercitrin, afzelin, kaempferol đuợc phân lập từ phân đoạn EtOAc
của Chặc chìu.
2.2. PH
NG PHÁP NGHIÊN C U
2.2.1. Ph ng pháp chi t xu t và phân l p các h p ch t
 Dược liệu được chiết bằng MeOH, phân đoạn bằng các dung môi có độ
phân cực tăng dần.
 Phân lập các chất bằng sắc ký cột và HPLC.
2.2.2. Nghiên c u tác d ng d c lý
2.2.2.1. Nghiên cứu tác dụng chống viêm gi m đau
Đánh giá tác dụng chống viêm của cao chiết MeOH và phân đoạn của Chặc
chìu bằng các mô hình chống viêm thực nghiệm: gây phù chân chuột bằng
carrageenan, mô hình gây viêm màng bụng, mô hình u hạt bằng amiăng.
Đánh giá tác dụng giảm đau của cao chiết MeOH và các phân đoạn Chặc
chìu bằng các mô hình mâm nóng, mô hình mâm nóng có sử dụng thêm tác
nhân gây tăng nhận cảm đau và mô hình gây tăng đau do viêm (Randall Selitto
test).
2.2.2.2. Sơ bộ đánh giá cơ chế tác dụng chống viêm
Đánh giá tác dụng của Chặc chìu trên mô hình cắt tuyến thượng thận, mô
hình teo tuyến ức. Đánh giá tác dụng ức chế một số enzym có liên quan đến quá
trình viêm, gồm xanthin oxidase, lipoxygenase và cyclooxygenase (COX-1,
COX-2).
Đánh giá tác dụng của Chặc chìu trên mô hình kích thích đại thực bào Raw
264.7 như ức chế biểu hiện NO, COX-2, NF-B.
4


Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của Chặc chìu trên mô hình dọn gốc tự do
DPPH, peroxy hoá lipid và ức chế MDA gan chuột.
2.3. Ph ng pháp x lý s li u
Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SE (SE: sai số chuẩn).
So sánh giá trị trung bình của lô thử với lô chứng bằng nghiệm pháp t-test
student bằng phần mềm Microsoft-Excel. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa
khi p < 0,05. Trong thí nghiệm in vitro, kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị
trung bình ± SD từ ít nhất 3 lần làm thí nghiệm độc lập với nhau.

CH

NG 3. K T QU NGHIÊN C U

3.1. K T QU TÁC D NG CH NG VIÊM C A CH C CHÌU
3.1.1. K t qu chi t cao toàn ph n vƠ các phơn đo n Ch c chìu
B TD

Dựa
đã



C LI U (15kg)

tả

vào phuơng pháp chiết
phương pháp nghiên

+ MeOH
D ch MeOH

cứu,

kết quả chiết cao toàn
phần và các phân đoạn Chặc

Thu hồi MeOH

được thể hiện

Cao MeOH (1080g)

chìu

hình

+ Nước

3.1
D ch n

c
+ n-Hexan

D ch n-hexan

D ch n

c
+ EtOAc

Thu hồi n-Hexan

Cao n-hexan (105g)
D ch EtOAc

D ch n

c
+ BuOH

Thu hồi EtOAc

Cao EtOAc (195g)
D ch BuOH

D ch n



Thu hồi BuOH

Cao BuOH (414g)

Hình 3.1. Kết qu chiết xuất dược liệu
5

c

Cao n

c


3.1.2. K t qu tác d ng ch ng viêm c p trên th c nghi m
3.1.2.1. Kết quả tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân
chuột bằng carrageenan
Kết quả cho thấy cao MeOH liều 600mg/kg có tác dụng ức chế 28,99% độ
phù chân chuột so với lô chứng tại th i điểm 3 gi sau khi gây viêm (p < 0,05).
Phân đoạn EtOAc liều 300mg/kg và 600mg/kg có tác dụng ức chế phù chân
chuột tại th i điểm 3 gi sau khi gây viêm lần lượt là 27,43% (p < 0,05) và
42,92% (p < 0,01) độ phù chân chuột so với lô chứng. Như vây, phân đoạn
EtOAc có tác dụng ức chế phù chân chuột mạnh hơn so với cao MeOH.

Hình 3.2. nh hưởng của Chặc chìu lên mức độ phù chân chuột (n = 8).
Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg;Me-600: cao MeOH 600
mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg;Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg;
* p < 0,05; ** p< 0,01.

3.1.2.2. Kết quả tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng bụng
 Kết qu tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng bụng ở chuột cống
Kết quả thu được cho thấy cao MeOH liều 600mg/kg, cao EtOAc liều
300mg và 600mg/kg làm giảm số lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein và số
lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm trên chuột cống rõ rệt có ý nghĩa thống kê so
6


với lô chứng (p < 0,05).
Các mẫu Dic-5, MeOH 600, EtOAc 300, và EtOAc 600 làm giảm lượng
dịch rỉ viêm so với lô chứng của lần lượt là 31,87; 24,94; 27,02; và 30,25 (%);
làm giảm hàm lượng protein so với lô chứng lần lượt là 10,12; 6,44; 6,13; 7,98
(%); làm giảm số lượng bạch cầu so với lô chứng lần lượt là 35,49; 25,71;
21,83; 28,84 %; đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Hình 3.3. Tỷ lệ gi m (%) của lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein,
số lượng b ch cầu so với chứng trên chuột cống
Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; MeOH 300: Cao methanol: 300mg/kg; MeOH 600:
Cao MeOH 600mg/kg; EtOAc 300: Cao ethylacetat 300mg/kg; EtOAc 600:
Cao ethylacetat 600mg/kg; *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001.

 Tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng bụng ở chuột nhắt trắng
Cao MeOH liều 600mg/kg, cao phân đoạn EtOAc liều 300mg và 600mg/kg
làm giảm số lượng dịch rỉ viêm, giảm hàm lượng protein và số lượng bạch cầu
trong dịch rỉ viêm trên chuột nhắt rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p
< 0,05).

7


Hình 3.4. Tỷ lệ gi m (%) của lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein, số
lượng b ch cầu so với chứng trên chuột nhắt
Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; MeOH 300: Cao methanol: 300mg/kg;
MeOH 600: Cao meOH 600mg/kg; EtOAc 300: Cao ethylacetat 300mg/kg;
EtOAc 600: Cao ethylacetat 600mg/kg; *: p< 0,05; **: p< 0,01; ***: p< 0,001.

Các mẫu Dic 5, MeOH 600, EtOAc 300, và EtOAc 600 làm giảm lượng
dịch rỉ viêm so với lô chứng của lần lượt là 39,74; 34,62; 25,52; 36,60 (%); làm
giảm hàm lượng protein lần lượt là 35,14; 17,39; 15,63; 19,37 (%); và làm giảm
số lượng bạch lần lượt là 49,05; 25,57; 18,83; 34,47 (%); đều đạt ý nghĩa thống
kê (p < 0,05).
3.1.3. K t qu tác d ng ch ng viêm m n trên chu t c ng
Cao MeOH và phân đoạn EtOAc các liều 300mg; 600mg/kg đều có tác
dụng giảm trọng lượng u hạt có ý nghĩ thống kê so với lô chứng, tỷ lệ giảm
trọng lượng u hạt tương ứng là 18,79%, 25,66%, 19,72% và 30,49%. Trọng
lượng u hạt lô uống chất đối chiếu dương prednisolon liều 5mg/kg giảm là
34,18% so với lô chứng.

8


Hình 3.5. nh hưởng của Chặc chìu lên khối lượng u h t trên chuột cống (n = 8).
Pred: prednisolon 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg;
Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; ** p< 0,01, *** p < 0,001

M c đ phù chân chu t (%)

3.2. K T QU ĐÁNH GIÁ C CH CH NG VIÊM C A CH C CHÌU
3.2.1. K t qu đánh giá c ch ch ng viêm in vivo
3.2.1.1. Tác dụng chống viêm trên mô hình cắt tuyến thượng thận
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5

Ch ng
Me-600

Dic-5
Et-300

*

Me-300
Et-600

*

*
1 giờ

3 giờ

5 giờ

Hình 3.6. nh hưởng của Chặc chìu lên độ phù chân chuột
cắt tuyến thượng thận (n= 10).
Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300mg/kg;Me-600: cao MeOH 600
mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg;Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg;
*: p< 0,05; **: p< 0,01.

Kết quả cho thấy chuột uống cao MeOH và phân đoạn EtOAc với các liều
300 mg/kg và 600 mg/kg có xu hướng ức chế độ phù chân chuột trên mô hình
cắt tuyến thượng thận nhưng không có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó
diclofenac liều 5mg/kg vẫn thể tác dụng ức chế phù chân chuột rất tốt ngay từ
gi đầu tiên và kéo dài đến gi thứ 5.
3.2.1.2. Tác dụng chống viêm thông qua hormon vỏ thượng thận
9


Chuột uống cao MeOH liều 600mg/kg/ngày, phân đoạn EtOAc liều 300
mg/kg và 600 mg/kg có tác dụng làm giảm khối lượng tuyến ức so với lô chứng
lần lượt là 36,70%, 38,26%, 45,12% (p < 0,001). Chuột uống prednisolon
5mg/kg /ngày có khối lượng tuyến ức giảm tới 70,37% (p < 0,001).

Hình 3.7. nh hưởng của cao Chặc chìu trên trọng lượng tuyến ức (n = 8).
Dic-5: diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg;Me-600: cao MeOH 600
mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; ***: p< 0,001.

3.2.2. K t qu kh o sát c ch ch ng viêm trên m t s enzym
3.2.2.1. Tác dụng ức chế xanthin oxidase (XO), lipoxygenase (5-LOX) in
vitro
Kết quả cho thấy cao MeOH có tác dụng ức chế XO với giá trị IC50 là 21,39
g/ml, cao n-Hexan và cao nước có tác dụng rất yếu và có thể coi là không có
tác dụng (IC50 > 100 g/ml), còn các cao EtOAc và BuOH đều cho tác dụng.
Tuy nhiên, phân đoạn BuOH (IC50 = 28,23 g/ml) cho tác dụng kém cao chiết
MeOH, còn phân đoạn EtOAc (IC50 = 9,38 g/ml) thì có tác dụng mạnh hơn
cao chiết MeOH. Trong số các hợp chất phân lập từ dược liệu, quercetin cho tác
dụng mạnh với giá trị IC50 là 1,01 μg/ml, mạnh hơn so với catechin (IC50 = 2,34
μg/ml) và kaempferol (IC50 = 1,85 μg/ml), mạnh hơn nhiều so với các flavone
glycosid là quercitrin (IC50 = 11,25 μg/ml) và afzelin ((IC50 >100 μg/ml).
Kết quả thí nghiệm cho thấy cao MeOH có tác dụng ức chế 5-LOX (IC50 =
18,6 g/ml), mạnh hơn các cao phân đoạn của dịch chiết này là Hx, H2O và
BuOH (đều có (IC50 > 30 g/ml), nhưng có tác dụng yếu hơn cao phân đoạn
EtOAc (IC50 = 9,3 g/ml); cũng giống như tác dụng ức chế XO, phân đoạn
EtOAc thì có tác dụng mạnh hơn cao chiết MeOH và các cao phân đoạn khác.
Hợp chất quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 là 1,66 μg/ml, mạnh hơn
10


so với aspirin (IC50 = 2,60 μg/ml) và diclofenac (IC50 = 2,08 μg/ml) và tương
đương với catechin có IC50 là 1,65 μg/ml.
3.2.2.2. Kết quả tác dụng ức chế cyclooxygenase-1,2 in vitro của Chặc Chìu
Kết quả cho thấy trong các cao chiết MeOH vẫn có tác dụng ức chế COX-1
với giá trị IC50 là 34,35 μg/ml, có tác dụng mạnh hơn các cao phân đoạn BuOH
và nước có tác dụng rất yếu, nhưng yếu hơn phân đoạn EtOAc (IC50 = 22,65
μg/ml). Hợp chất phân lập từ dược liệu là quercetin cho tác dụng mạnh với giá
B ng 3.1. Tác dụng ức chế xanthin oxidase, 5-lipoxygenase của Chặc chìu
M u th

Ho t tính c ch xanthin
oxidase (IC50, µg/ml)

Cao n-Hexan

> 100

Cao MeOH
Cao EtOAc
Cao BuOH
Cao nước
Quercetin
Quercitrin
Afzelin
Kaempferol
Catechina
Allopurinola
Aspirina
Diclofenaca

21,39 ± 1,70
9,38 ± 0,50
28,23 ± 1,04
> 100
1,01 ± 0,18
11,25 ± 1,06
> 100
1,85 ± 0,21
2,34 ± 0,46
0,23 ± 0,01
KT
KT
a: chất đối chứng dương; KT: không thử

Ho t tính c ch
5-lipoxygenase
(IC
51,25, µg/ml)
± 3,68
18,60 ± 0,24
9,30 ± 0,39
30,66 ± 0,32
33,54 ± 0,95
1,66 ± 0,03
KT
KT
KT
1,65 ± 0,05

KT
2,60 ± 0,03
2,08 ± 0,06

trị IC50 là 7,07 μg/ml, yếu hơn chút ít so với tác dụng của hai chất đối chiếu
dương là diclofenac và catechin (giá trị IC50 là 6,22 μg/ml và 5,98 μg/ml).
Kết quả cũng giống như tác dụng trên COX-1, cho thấy các phân đoạn
BuOH và cao nước có tác dụng rất yếu. Cao MeOH và phân đoạn EtOAc có tác
dụng ức chế COX-2 tốt với các giá trị IC50 lần lượt là 20,89 μg/ml và 13,86
μg/ml. Hoạt chất của dược liệu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 là
2,22 μg/ml. Tác dụng của quercetin mạnh hơn so với của diclofenac và catechin
(giá trị IC50 là 2,80 μg/ml và 2,52 μg/ml).

11


B ng 3.2. Tác dụng ức chế cyclooxygenase-1,2 của Chặc Chìu
M u th

Ho t tính c ch COX-1
(IC50, µg/ml)

Ho t tính c ch COX-2
(IC50, µg/ml)

Cao MeOH

34,35 ± 1,18

20,89 ± 0,26

Cao EtOAc

22,65 ± 0,82

13,86 ± 0,18

Cao BuOH

48,78 ± 1,52

40,10 ± 0,31

Cao nước

51,26 ± 0,91

44,09 ± 0,14

7,07 ± 0,44

2,22 ± 0,01

6,22 ± 0,39

2,80 ± 0,09

5,98 ± 0,19

2,52 ± 0,01

Quercetin
Diclofenac

a

a

Catechin

a: chất đối chứng dương

3.2.2.4. Kết quả tỷ lệ chọn lọc tác dụng ức chế cyclooxygenase-1 so với
cyclooxygenase-2 in vitro của Chặc Chìu
Như vậy, có thể thấy các phân đoạn của Chặc chìu và hợp chất quercetin
có tác dụng ức chế cả COX-1 và COX-2 in vitro. Hợp chất quercetin có mức độ
chọn lọc tốt hơn so với diclofenac. Tuy nhiên, các kết quả thể hiện các mẫu thử
không có tác dụng ức chế chọn lọc đối với COX-2.
3.2.3. K t qu đánh giá tác d ng trên đ i th c bào Raw 264.7
B ng 3.3. Tỷ lệ chọn lọc ức chế cyclooxygenase-1 so với
cyclooxygenase-2 của Chặc Chìu
M u th

Ho t tính c ch cyclooxygenase-2(IC50,
µg/ml)

Cao MeOH

20,89 ± 0,26

Cao EtOAc

13,86 ± 0,18

Cao BuOH

40,10 ± 0,31

Cao nước

44,09 ± 0,14

Quercetin
Diclofenac
a

Catechin

2,22 ± 0,01
a

12

2,80 ± 0,09
2,52 ± 0,01

a: chất đối chứng dương


nh hưởng của Chặc chìu đối với sự t o thành nitric oxid (NO) trong tế
bào Raw 264.7 bị kích thích bởi LPS
Kết quả cho thấy cao phân đoạn EtOAc cả hai nồng độ 10 và 50 µg/ml có
tác dụng ức chế sự tạo thành NO trên tế bào Raw 264.7 bị kích thích b i LPS
(chỉ ủ với LPS), trong đó có tác dụng rất mạnh nồng độ 50 g/ml. Cao chiết
MeOH chưa có tác dụng ức chế sự tạo thành NO nồng độ 10 mg/ml nhưng có
tác dụng nồng độ 50 g/ml. Trong khi BuOH không cho tác dụng ức chế sự
tạo thành NO có ý nghĩa thống kê cả hai nồng độ thử 10 và 50 µg/ml. Như
vậy, có thể kết luận các mẫu cao thử có tác dụng ức chế tạo thành NO trên tế
bào RAW 264.7 theo thứ tự EtOAc > MeOH > BuOH, thể hiện mức độ chống
viêm của các mẫu trên mô hình thử này.


13


Hình 3.8. nh hưởng của cao Chặc chìu lên sự ức chế
t o thành nitric oxide (NO)
Et-10: LPS 100ng/ml + EtOAc 10 µg/ml; Et-50: LPS 100ng/ml + EtOAc 50
µg/ml; Me-10: LPS 100ng/ml + MeOH 10 µg/ml; Me-50: LPS 100ng/ml +
MeOH 50 µg/ml; Bu-10: LPS 100ng/ml + BuOH 10 µg/ml; Bu-50: LPS
100ng/ml + BuOH 50 µg/ml; LPS: Lipopolysaccharide 1 µg/ml; Cont-1,
Cont-2, Cont-3: NO của tế bào khi nuôi cấy trong môi trường bình thường
12.0

Nitric oxide (µM)

10.0
8.0
6.0
4.0

2.0
0.0
Cont-1

Et-10

Cont-2

Me-10

LPS

LPS

Cont-3

Bu-10
LPS

nh hưởng của Chặc chìu đối với sự biểu hiện của COX-2 trên tế bào Raw
264.7 bị kích thích bởi LPS
Kết quả phân tích bằng Western blot cho thấy cao phân đoạn EtOAc
nồng độ 50 µg/ml có tác dụng ức chế mức độ biểu hiện của COX-2 trong tế bào
Raw 264.7 bị kích thích b i LPS (cột 4). nồng độ 10 µg/ml, cao EtOAc có
tác dụng không rõ ràng (cột 3). Các cao chiết MeOH (cột 5, 6) và phân đoạn
BuOH (cột 7, 8) cả hai nồng độ 10 µg/ml, 50 µg/ml, đều không có tác dụng
hoặc tác dụng nhưng không rõ ràng sự ức chế biểu hiện COX-2 trên tế bào Raw


14


264.7 bị kích thích b i LPS. Mức độ biểu hiện của -actin là như nhau các
cột (1-8). Như vậy nồng độ 50 g/ml, cao phân đoạn EtOAc có làm giảm
mức độ biểu hiện của COX-2 trong tế bào Raw 264.7 bị kích thích b i LPS,
chứng minh mẫu có tác dụng chống viêm khi thử mô hình này.

COX-2

-actin

Hình 3.9. nh hưởng của Chặc chìu đến mức độ biểu hiện COX-2 trong tế
bào Raw 264.7 bị kích thích bởi LPS

Cột 1: Cont. (chỉ có môi trường); Cột 2: Lipopolysaccharid (LPS)1 µg/ml; Cột 3:
LPS 100 ng/ml + EtOAc 10 µg/ml; Cột 4: LPS 100 ng/ml + EtOAc 50 µg/ml; Cột 5:
LPS 100 ng/ml + MeOH 10 µg/ml; Cột 6: LPS 100 ng/ml + MeOH 50 µg/ml; Cột 7:
LPS 100 ng/ml + BuOH 10 µg/ml; Cột 8: LPS 100 ng/ml + BuOH 50 µg/ml.

nh hưởng của Chặc chìu đối với sự biểu hiện của NF-B trong tế bào
Raw 264.7 bị kích thích bởi LPS
Kết quả cho thấy cao MeOH và cao phân đoạn EtOAc nồng 50 µg/ml (lần
lượt là cột 4 và 6) có tác dụng ức chế rõ rệt sự biểu hiện NF-B trong tế bào
Raw 264.7 bị kích thích b i LPS. Nhưng cũng các mẫu này nồng độ 10 g/ml
(phân đoạn EtAOc cột 3, cao MeOH cột 5) không thể hiện tác dụng ức chế sự
biểu hiện rõ ràng. Cao phân đoạn BuOH cả 2 nồng độ (cột 7 và 8) đều không
cho tác dụng ức chế mức độ biểu hiện NF-B. Như vậy nồng độ đủ (50
g/ml), cao MeOH và phân đoạn EtOAc có làm giảm mức độ biểu hiện của
NF-B trong tế bào Raw 264.7 bị kích thích b i LPS. Điều này chứng minh tác
dụng chống viêm của các mẫu này.


15


NF-B

-actin

Hình 3.10. nh hưởng của Chặc chìu lên sự biểu hiện của NF-B
Cột 1: Cont. (chỉ có môi trường); Cột 2: Lipopolysaccharid (LPS); Cột 3: LPS + EtOAc
10 µg/ml; Cột 4: LPS + EtOAc 50 µg/ml; Cột 5: LPS + MeOH 10 µg/ml; Cột 6: LPS +
MeOH 50 µg/ml; Cột 7: LPS + BuOH 10 µg/ml; Cột 8: LPS + BuOH 50 µg/ml.

3.3. K T QU ĐÁNH GIÁ TÁC D NG GI M ĐAU
3.3.1. K t qu đánh giá tác d ng gi m đau trung ng
 Tác dụng gi m đau trên mô hình mâm nóng (ảot plate)
B ng 3.4. Tác dụng gi m đau của Chặc chìu lên trên mô hình mâm nóng


Thời gian ph n ng đau (giơy)

n
Tr

c u ng thu c

Sau 1 giờ u ng thu c

Đối chứng

10

19,90 ± 2,27

20,10 ± 1,29

Morphin

10

20,30 ± 2,29

48,20 ± 9,27**

Me-300

10

20,44 ± 2,43

20,60 ± 3,61

Me-600

10

20,70 ± 2,25

21,00 ± 1,58

Et-300

10

20,10 ± 2,15

20,70 ± 2,46

Et-600

10

21,30 ± 2,29

28,30 ± 6,05

Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300:
cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; ** p < 0,01.

Chuột uống cao MeOH và phân đoạn EtOAc cả hai liều thử 300 mg/kg và
600 mg/kg có th i gian phản ứng đau tại th i điểm sau khi uống thuốc một gi
khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Lô chuột dùng morphin
liều 10mg/kg có tác dụng kéo dài th i gian phản ứng với nhiệt độ rất rõ rệt so
với lô chứng.
16


3.3.2. K t qu đánh giá tác d ng gi m đau ngo i vi
3.3.2.1. Tác dụng giảm đau trên mô hình mâm nóng sử dụng chất tăng nhận
cảm đau
Cao MeOH các liều 300 mg/kg; 600 mg/kg và phân đoạn EtOAc 300
mg/kg không thể hiện tác dụng giảm đau trên mô hình mâm nóng sử dụng chất
tăng nhận cảm đau. Tuy nhiên, chuột uống phân đoạn EtOAc liều 600 mg/kg có
thể hiện tác dụng giảm đau thông qua việc rút ngắn th i gian phản ứng đau, tỷ
lệ phần trăm ức chế phản ứng đau tương ứng là 57,61%. Tác dụng này kém hơn
diclofenac liều 5mg/kg với phần trăm ức chế phản ứng đau là 63,34%.
B ng 3.5. Tác dụng gi m đau của Chặc chìu trên chuột có sử dụng
chất tăng nhận c m đau


(n = 12)

Thời gian ph n ng đau (giây)

Thời gian

% c

rút ngắn
ph n ng

ch so
v i lô
ch ng

Bình th ờng

Sau 3 giờ

đau (giơy)

Đ i ch ng

22,45 ± 2,89

14,02 ± 1,06

8,43 ± 2,10

Dic-5

22,32 ± 2,90

19,24 ± 2,51

3,09 ± 1,25*

63,34

Me-300

22,96 ± 1,87

16,91 ± 1,12

6,05 ± 1,19

28,15

Me-600

22,85 ± 2,56

17,85 ± 1,50

5,00 ± 1,49

40,67

Et-300

22,46 ± 2,17

17,35 ± 1,45

5,11 ± 1,46

39,38

18,95 ± 2,01

*

57,61

Et-600

22,52 ± 2,35

3,57 ± 0,95

Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg;Me-600: cao MeOH 600
mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05.

3.3.2.2. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây tăng đau do viêm
Chuột uống cao MeOH liều 600mg/kg có tăng ngưỡng phản ứng đau tại
th i điểm 3 gi sau uống thuốc và có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng
đau so với lô chứng là 49,22%.
Chuột uống phân đoạn EtOAc liều 600mg/kg hay liều thấp hơn là 300mg/kg
đều có tác dụng làm tăng ngưỡng phản ứng đau của chuột sau uống thuốc 3 gi ,
phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng lần lượt là 59,30%
và 44,51%. Diclofenac vẫn có tác dụng tốt trong thí nghiệm này, làm đảo
ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng là 78,97%.
17


Hình 3.11. nh hưởng Chặc chìu lên phần trăm đ o ngược ngưỡng ph n ứng
đau của chuột 3 giờ sau khi uống thuốc (n =8).
Dic: diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg;
Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05; ** p < 0,01.

Hình 3.12. nh hưởng của Chặc chìu lên ngưỡng ph n ứng đau
của chuột cống (n = 8).
Dic: diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg;
Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05; ** p < 0,01.

3.4. K T QU ĐÁNH GIÁ TÁC D NG CH NG OXY HOÁ
3.4.1. K t qu tác d ng d n g c t do DPPH, ch ng peroxy hoá lipid c a
Ch c Chìu
Kết quả cho thấy trong các phân đoạn của dịch chiết, phân đoạn Hx và nước
18


có tác dụng rất yếu, còn hai phân đoạn EtOAc và BuOH đều cho tác dụng
mạnh. Tuy nhiên, phân đoạn BuOH cho tác dụng kém cao chiết MeOH, còn
phân đoạn EtOAc thì có tác dụng mạnh hơn cao chiết MeOH. Trong số các hợp
chất chiết được từ Chặc chìu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 của
SADPPH là 1,26 g/ml. Tác dụng của quercetin mạnh hơn của catechin (giá trị
IC50 là 2,17 g/ml) và kaempferol (giá trị IC50 là 2,43 g/ml). Hai flavonoid
glycosid cho tác dụng chống oxy hóa kém hơn các aglycon quercetin,
kaempferol và cả chất đối chiếu catechin.
Kết quả cho thấy trong các phân đoạn của dịch chiết, phân đoạn Hx và nước
có tác dụng rất yếu. Hai phân đoạn EtOAc và BuOH đều cho tác dụng mạnh.
Tuy nhiên, phân đoạn BuOH cho tác dụng kém cao chiết MeOH. Phân đoạn
EtOAc thì có tác dụng mạnh hơn cao chiết MeOH. Trong số 4 hợp chất của
dược liệu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 của LPIA là 9,26 g/ml.
Tác dụng của quercetin mạnh hơn của catechin (IC50 = 13,47 g/ml) và
kaempferol (giá trị IC50 = 18,48 g/ml).
B ng 3.6. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH, chống peroxy hóa lipid của Chặc Chìu

M u th

Tác d ng d n g c t do
DPPH (IC50, µg/ml)

Ho t tính ch ng peroxy
hoá lipid (IC50, µg/ml)

Cao n-Hexan

> 20

> 100

Cao MeOH

11,87 ± 0,41

37,90 ± 0,94

Cao EtOAc

9,29 ± 0,35

32,39 ± 0,83

Cao BuOH

17,10 ± 0,26

99,07 ± 4,09

Cao nước

> 20

> 100

Quercetin

1,26 ± 0,08

9,26 ± 0,07

Quercitrin

5,24 ± 0,13

> 100

Afzelin

> 20

> 100

2,43 ± 0,28

18,48 ± 2,98

2,17 ± 0,28

13,47 ± 5,09

Kaempferol
a

Catechin

a: chất đối chứng dương

3.4.3. Tác d ng ch ng oxy hoá trên mô hình in vivo
Từ kết quả sàng lọc chống oxy hóa in vitro, cao chiết MeOH và các phân
đoạn EtOAc, BuOH cho tác dụng mạnh nhất. Các cao chiết và phân đoạn này
19


và hơp chất quercetin được tiếp tục thử mô hình in vivo trên chuột để đánh
giá tác dụng chống oxy hóa của Chặc chìu.
các liều thử 200mg; 400mg và 600mg/kg, phân đoạn EtOAc ức chế lần
lượt 9,66; 36,04; 48,55% sự tạo thành MDA gan chuột, các giá trị này của
của phân đoạn BuOH là 12,74; 14,67; và 23,47%. Đối với cao chiết MeOH cho
tác dụng ức chế sự hình thành MDA gan chuột lần lượt là 29,16; 40,21; và
36,32 % có ý nghĩ thống kê so với nhóm đối chứng khi thử các liều lần lượt là
600mg; 1000mg; và 1500mg/kg. liều 200mg và 400mg/kg, cao MeOH không
có tác dụng hay cho tác dụng rất kém, rất khó phát hiện. Như vậy, phân đoạn
EtOAc có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất trên mô hình in vivo. liều 100
mg/kg, hợp chất của Chặc chìu là quercetin có tác dụng ức chế 29,28% sự hình
thành MDA trong gan chuột, có ý nghĩa thống kê. Còn liều 100 UI/kg,
vitamin E ức chế 67,10% sự hình thành MDA gan chuột.
B ng 3.12. Kết qu tác dụng chống oxy hoá in vivo
Tác d ng ch ng oxy hoá

Li u
Lô thí nghi m

(mg/kg)

N ng đ MDA
(nmol/ml)

HTCO
(%)

p

Ch ng sinh lý (1)

-

36,42 ± 2,33

-

p1,2< 0,001

Ch ng b nh lý (2)

-

58,93 ± 5,15

-

600

41,75 ± 6,03

29,16

p3,2< 0,05

1000

35,24 ± 2,40

40,21

p3,2< 0,001

1500

37,53 ± 3,62

36,32

p3,2< 0,01

200

53,24 ± 3,24

9,66

p4,2> 0,05

400

37,69 ± 2,90

36,04

p4,2< 0,01

600

30,32 ± 1,75

48,55

p4,2< 0,001

200

51,42 ± 5,61

12,74

p5,2> 0,05

400

50,29 ± 4,82

14,67

p5,2> 0,05

600

45,10 ± 4,02

23,47

p5,2< 0,05

100

41,68 ± 3,48

29,28

p6,2 < 0,05

100 UI/kg

19,39 ± 1,27

67,10

p7,2< 0,001

Cao MeOH (3)

Cao EtOAc (4)

Cao BuOH (5)
Quercetin (6)
a

α-Tocopherol (7)

a: chất đối chiếu dương

20


CH

NG 4. BÀN LU N

4.1. TÁC D NG CH NG VIÊM, GI M ĐAU C A CH C CHÌU
4.1.1. Tác d ng ch ng viêm
4.1.1.1. Tác dụng chống viêm cấp trên phù thực nghiệm bằng carrageenan
Cao chiết từ cây Chặc chìu dùng đư ng uống trên chuột cống trắng gồm cao
MeOH chỉ có tác dụng liều cao 600 mg/kg (phù giảm 29,0%, p > 0,05); cao
EtOAc liều 300 mg/kg mức độ phù giảm 27,4% (p > 0,05), liều 600 mg/kg
(mức độ phù giảm 42,9%, p < 0,01). Tuy mức độ tác dụng có kém so với
diclofenac 5 mg/kg (phù giảm 64,6%, p < 0,01), nhưng cũng chứng tỏ Chặc
chìu có tác dụng chống viêm cấp và các chất có tác dụng chống viêm cấp nằm
nhiều phân đoạn EtOAc. Có thể suy luận rằng, cao MeOH có tác dụng chống
viêm vì đó là cao toàn phần, cao này bao hàm cả phân đoạn EtOAc; nhưng tác
dụng kém hơn cao EtOAc vì có chứa nhiều thành phần khác không có hoặc có
tác dụng chống viêm kém cao EtOAc.
4.1.1.2. Tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng bụng
Trong công trình này, đã đánh giá thêm 2 thông số là số lượng bạch cầu và
hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm là các thông số dễ tiến hành và có giá trị.
Trên mô hình dùng chuột cống trắng, lượng dịch rỉ viêm nhiều, nên th i gian
lấy dịch rỉ viêm chỉ cần 24 gi sau khi gây viêm. Kết quả cho thấy, lô đối
chứng, thể tích dịch rỉ viêm là 3,61 ml. Lô cho chuột uống cao MeOH liều 300
mg/kg, thể tích dịch rỉ viêm là 2,96 ml, giảm 18,0% (p > 0,05), liều 600 mg/kg
là 2,71 ml, giảm 24,9% (p < 0,05); cao EtOAc liều 300 mg/kg, thể tích dịch rỉ
viêm là 2,63 ml, giảm 27,0% (p < 0,05), liều 600 mg/kg, là 2,52 ml, giảm
30,3% (p < 0,05); diclofenac liều 5 mg/kg, thể tích dịch rỉ viêm là 2,46 ml,
giảm 31,9% (p < 0,05).
Hàm lượng protein lô đối chứng là 51,97% g/L. Liều cao MeOH liều 300
mg/kg, hàm lượng protein là 50,79 g/L, giảm 2,3% (p > 0,05); liều 600 mg/kg
là 48,62 g/L, giảm 6,4% (p < 0,05). Cao EtOAc liều 300 mg/kg, hàm lượng
protein là 48,78 g/L, giảm 6,1%, (p <0,01); liều 600 mg/kg là 47,82 g/L, giảm
8,0% (p < 0,001). Lô chứng dương diclofenac liều 5 mg/kg, hàm lượng protein
là 46,70 g/L, giảm 10,1% (p < 0,001).
Trên số lượng bạch cầu, lô đối chứng là 18,90 × 106/ mL. Các lô cao MeOH
liều 300 và 600 mg/kg, cao EtOAc liều 300 và 600 mg/kg và lô diclofenac, số
lượng bạch cầu (106/mL) theo thứ tự là 15,32 (giảm 18,9%, p > 0,05), 14,04
(giảm 25,7%, p < 0,05), 14,78 ( giảm 21,8%, p > 0,05), 13,45 (giảm 28,8%, p <
0,01) và 12,19 (giảm 35,5%, p < 0,01).
21


Như vậy, cao MeOH liều 300 mg/kg có xu hướng làm giảm cả 3 thông số
nghiên cứu so với lô chứng, nhưng đều không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Cao MeOH liều 600 mg/kg có tác dụng xấp xỉ cao EtOAc liều 300 mg/kg,
nhưng kém hơn liều 600 mg/kg. Cao EtOAc liều 600 mg/kg có tác dụng mạnh
nhất, tuy xấp xỉ, nhưng vẫn kém so với diclofenac liều 5 mg/kg.
Như vậy có thể thấy kết quả nghiên cứu trên mô hình dùng chuột nhắt trắng
cũng không khác nhiều so với mô hình dùng chuột cống trắng, nhất là khi so
sánh tác dụng của các mẫu với nhau. Kết quả nghiên cứu trên mô hình rỉ dịch
màng bụng chuột nhắt trắng và chuột cống trắng cũng có mức độ và diễn biến
viêm cấp tương tự, tác dụng của các mẫu thử từ Chặc chìu tương đồng khi so
sánh với nghiên cứu trên mô hình viêm cấp chân chuột bằng carrageenan. Đây
là lần đầu tiên mô hình gây dịch rỉ màng bụng được áp dụng trên chuột nhắt
trắng để đánh giá tác dụng chống viêm của mẫu thử (thuốc) và đem lại gợi ý
rằng việc thay thế chuột cống trắng bằng chuột nhắt trắng trong mô hình gây
dịch rỉ màng bụng vẫn đáp ứng được yêu cầu khoa học.
4.1.1.3. Tác dụng trên mô hình gây viêm mạn tính bằng amiăng
Cao MeOH 300 mg/kg tuy có làm giảm khối lượng u hạt nhưng không có ý
nghĩa thống kê. Các lô khác cho tỷ lệ ức chế u hạt từ 19,7% đến 30,5% so với
lô chứng với p < 0,01. Riêng prednisolon liều 5 mg/kg ức chế u hạt rõ rệt. Điều
này một lần nữa khẳng định các thuốc chống viêm steroid là những chất ức chế
miễn dịch, có tác dụng chống tăng sinh, làm giảm sự tạo thành khối u hạt rất
mạnh trong mô hình gây viêm mạn tính.
4.1.2. Tác d ng gi m đau c a Ch c chìu
4.1.2.1. Tác dụng giảm đau trung ương trên mô hình mâm nóng
Kết quả cho thấy: Lô chuột dùng morphin liều 10 mg/kg có tác dụng kéo dài
th i gian phản ứng đau rất rõ rệt so với lô chứng; th i gian phản ứng đau của
chuột với lô sử dụng morphin cao hơn hẳn so với các lô còn lại.
Các lô chuột uống cao MeOH liều 300 mg/kg, 600 mg/kg; phân đoạn
EtOAc liều 300 mg/kg, 600 mg/kg, có th i gian phản ứng đau tại th i điểm sau
khi uống thuốc một gi , khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Như vậy, cao MeOH và EtOAc với mức liều 300 mg/kg và 600 mg/kg không
thể hiện tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương.
4.1.2.2. Tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình mâm nóng có sử dụng tác
nhân gây đau
Trong mô hình này, kết quả cho thấy th i gian phản ứng đau của chuột uống
MeOH liều 300 mg/kg, 600 mg/kg và phân đoạn EtOAc 300 mg/kg không khác
22


biệt so với chứng. Tuy nhiên, chuột uống phân đoạn EtOAc liều 600 mg/kg có
sự rút ngắn th i gian phản ứng thấp hơn so với lô chứng, tỷ lệ phần trăm ức chế
đau tương ứng là 57,61%. Chuột uống diclofenac liều 5 mg/kg có tỷ lệ phần
trăm ức chế đau là 63,34%. Kết quả này chứng tỏ, cao EtOAc liều 600 mg/kg
và diclofenac liều 5 mg/kg có khả năng giảm đau theo cơ chế ngoại vi.
4.1.2.3. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau do viêm
Kết quả thể hiện tác dụng của Chặc chìu trên mô hình Randall Selitto để
đánh giá tác dụng giảm đau trên mô viêm. Chuột uống cao MeOH liều 300
mg/kg có ngưỡng phản ứng đau tại th i điểm 3 gi sau uống thuốc và có phần
trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau tăng không khác biệt so với lô chứng.
Tuy nhiên, chuột uống cao MeOH liều 600 mg/kg có tăng ngưỡng phản ứng
đau tại th i điểm 3 gi sau uống thuốc và có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản
ứng đau so với lô chứng là 49,22%. Chuột uống phân đoạn EtOAc liều 300
mg/kg và 600 mg/kg có tác dụng làm tăng ngưỡng phản ứng đau của chuột sau
uống thuốc 3 gi , phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng
lần lượt là 44,51% và 59,30%. Như vậy, cao MeOH liều 600 mg/kg và EtOAc
liều 300 mg/kg, 600 mg/kg, thể hiện tác dụng giảm đau trên mô viêm rõ rệt, cả
hai thông số trực tiếp và gián tiếp của mô hình này đều thay đổi có ý nghĩa
thống kê khi so sánh với lô chứng.
4.2. C CH TÁC D NG CH NG VIÊM C A CH C CHÌU
4.2.1. C ch ch ng viêm in vivo
4.2.1.1. Tác dụng chống viêm cấp trên chuột cắt bỏ tuyến thượng thận
Theo kết quả thực nghiệm, tác dụng chống viêm của Chặc chìu rất kém
mô hình chuột bị cắt tuyến thượng thận, nhưng mô hình còn tuyến thượng
thận thì tác dụng chống viêm rõ rệt. Như vậy, có thể Chặc chìu chứa các thành
phần có tác dụng hiệp đồng với các chất chống viêm của tuyến thượng thận.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học: phân lập được các triterpenoid trong
Chặc chìu thuộc nhóm lupan (acid betulinic), ursan (acid ursolic) và nhóm
olean (acid oleanolic), ngoài ra còn có các sterol khác là -sitosterol và
daucosterol. Các chất này tuy không có tác dụng mạnh như các thuốc steroid,
nhưng có thể là những chất đem lại tác dụng hiệp đồng trong đáp ứng viêm.
4.2.1.2. Tác dụng chống viêm thông qua hormon vỏ thượng thận
Cao MeOH liều 300 mg/kg có xu hướng làm giảm khối lượng tuyến ức
nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Cao MeOH liều 600 mg/kg và cao
EtOAc liều 300 và 600 mg/kg làm giảm khối lượng tuyến ức từ 36,7 đến 45,1%
(p<0,001). Như vậy, các cao chiết từ Chặc chìu làm thu teo tuyến ức rõ rệt và
23


có thể là các thành phần triterpenoid và phytosterol trong Chặc chìu đã đóng
góp vào tác dụng này.
4.2.2. Tác dụng đánh giá cơ chế chống viêm in vitro (trên các enzym oxy hoá)
4.2.2.1. Tác dụng chống viêm trên mô hình ức chế xanthin oxidase
Quercetin và kaempferol là những chất được chiết từ Chặc chìu có tác dụng
ức chế XO mạnh hơn cả chất chứng dương catechin (IC50 = 2,34 g/ml). Còn
allopurinol là một thuốc ức chế điển hình XO, được dùng trên lâm sàng có tác
dụng rất mạnh (IC50 = 0,23 g/ml).
Như vậy, tác dụng ức chế XO của các chất nghiên cứu theo thứ tự giảm dần
là quercetin > kaempferol > catechin > cao EtOAc > quercitrin > cao MeOH >
cao BuOH > afzelin, cao n-hexan và cao nước. Điều này cho thấy rằng các chất
quercetin, kaempferol, quercitrin là những hoạt chất cho tác dụng ức chế XO
của Chặc chìu. Điều này dẫn đến tác dụng làm giảm nguyên nhân gây bệnh gút
và giúp giải thích cho việc chặc chìu được dùng trong dân gian để chữa bệnh
thống phong (bệnh gút).
4.2.2.2. Tác dụng chống viêm trên mô hình ức chế lipoxygenase
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao n-hexan có tác dụng rất yếu (IC50 = 51,25
g/ml), rồi đến cao nước (IC50 = 33,54 g/ml) và cao BuOH (IC50 = 30,66
g/ml). Cao MeOH có tác dụng khá (IC50 = 18,60 g/ml), cao EtOAc (IC50 =
9,30 g/ml) có tác dụng mạnh, còn quercetin (IC50 = 1,66 g/ml) có tác dụng
rất mạnh. So sánh với các chất được dùng làm chứng dương, quercetin có tác
dụng tương đương catechin (IC50 = 1,65 g/ml) có thể là do hai chất có cấu trúc
tương tự nhau. Cả hai chất này có tác dụng ức chế 5-LOX tương tự với
prednisolon (IC50 = 1,64 g/ml), một thuốc điển hình của loại thuốc chống
viêm steroid. Hai chất chứng dương thuộc loại thuốc chống viêm không steroid
là aspirin (IC50 = 2,60 g/ml) và diclofenac (IC50 = 2,08 g/ml) có tác dụng ức
chế 5-LOX kém hơn quercetin. Như vậy một trong cơ chế chống viêm của các
chất trong cao chiết từ Chặc chìu là thông qua ức chế 5-LOX dẫn đến làm giảm
leucotrien - chất trung gian hóa học của quá trình viêm, leucotrien là chất gây
viêm quan trọng đặc biệt viêm có co thắt trong các bệnh lý đư ng hô hấp như
hen, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính.
4.2.2.3. Tác dụng chống viêm trên mô hình ức chế cyclooxygenase
Nhìn chung, thứ tự tác dụng của các mẫu cao chiết và cao phân đoạn nghiên
cứu trên COX-1 và COX-2 không khác nhau nhiều, các cao nước và BuOH vẫn
là những mẫu có tác dụng kém nhất, cao MeOH có tác dụng rõ rệt hơn, cao
EtOAc có tác dụng ức chế mạn. Điều này cũng phù hợp với kết quả thử các tác
24


dụng ức chế các enzym XO và 5-LOX đã trình bày trên. Kết quả này cho thấy
rằng nhiều khả năng các chất có tác dụng ức chế các enzym này nằm trong
phân đoạn EtOAc, và các nghiên cứu về thành phần hóa học đã chứng minh
điều này. Các flavonoid thuộc nhóm flavon như quercetin và kaempferol đều
được phân lập từ phân đoạn EtOAc, và đây là hai hợp chất có hàm lượng cao
trong Chặc chìu.
So sánh giữa chất phân lập được từ Chặc chìu là quercetin với một
flavonoid là catechin và một thuốc chống viêm không steroid là diclofenac trên
COX-1, thấy quercetin tác dụng kém hai chất kia. Nhưng tác dụng trên COX-1
của quercetin lại tương đương với hai chất này, gợi ý dùng quercetin cho tác
dụng tốt hơn vì ức chế “enzym giữ nhà” kém hơn, như vậy sẽ gây ra ít tác dụng
không mong muốn hơn; còn trên COX-2 là enzym thúc đẩy quá trình viêm thì
quercetin lại có tác dụng ức chế mạnh hơn, tức là ức chế viêm mạnh hơn. Kết
quả này chứng minh rằng quercetin là hoạt chất có tác dụng ức chế COX-1 và
COX-2 của Chặc chìu. Tuy tác dụng của quercetin đối với COX-2 rất mạnh so
với các chất đối chứng dương, nhưng tác dụng ức chế của cả Chặc chìu và
quercetin lại không có tính chọn lọc khi cũng cho tác dụng mạnh trên cả COX1.
Từ các kết quả thu được trên các mô hình thử tác dụng ức chế các enxym in
vitro, có thể kết luận Chặc chìu có tác dụng chống viêm cấp thông qua việc ức
chế các enzym XO, 5-LOX, và COX-2.
4.2.3. Tác d ng ch ng viêm c a Ch c chìu trên mô hình t bào
4.2.3.1. Tác dụng ức chế sự tạo thành Nitric oxid (NO)
Kết quả cho thấy, khi tế bào không được ủ với LPS, hàm lượng NO sinh ra
rất ít; còn khi có chất kích thích viêm cấp là kháng nguyên LPS, hàm lượng NO
trong tế bào đạt 10,8 M. Cao EtOAc nồng độ 10 g/ml làm giảm hàm lượng
NO còn 7,8 M. Đặc biệt, nồng độ 50 g/ml hàm lượng NO xuống chỉ còn
1,7 M. Cao MeOH nồng độ 10 g/ml cho hàm lượng NO là 9,2 M; Nồng độ
50 g/ml cho hàm lượng NO là 4,8 M. Cao BuOH 10 g/ml gần như không
có ảnh hư ng đến hàm lượng NO và nồng độ 50 g/ml hàm lượng NO vẫn
mức 8,7 M, chứng tỏ cao BuOH có tác dụng ức chế sự sản sinh NO rất yếu.
Tóm lại, Chặc chìu có tác dụng ức chế sự sản sinh ra NO và phân đoạn
EtOAc có tác dụng ức chế sự tạo thành NO mạnh nhất, tức là đã có tác dụng ức
chế tế bào bị kích thích (viêm) gây ra b i LPS. Điều này chứng tỏ các thành
phần trong phân đoạn EtOAc đóng góp phần quan trọng, thậm chí quyết định
đến tác dụng chống viêm cấp của mẫu Chặc chìu.
25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×