Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Nguyễn Văn Bắc


NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh

Hà Nội – 2010


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Lời cảm ơn!
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng
phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành
khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện
Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ
Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời
gian thực tập và hoàn thành khóa luận.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa
Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường Đại
học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng
biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, tháng 12 năm 2010
Học viên

Nguyễn Văn Bắc



Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

: Base pairs

CNSH

: C ng nghệ sinh học

CTCLQG

: Ch

DNA

: Acit deoxyribonucleic

dNTPs

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR

: Extensively drug resit nt Kh ng thuốc mở rộng)

EMB

: Ethambutol.

HRS

:

HRSE

: Bốn lo i thuốc isoni zid rif mpicin streptomycin và ethambutol

INH

: Isoniazid

IPTG

: Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Luria - Bertani

MDR

: Multidrugs resist nt Kh ng

PAS

: Paraminosalicylic acid

PAZ

: Pyrazinamid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RMP

: Rifampicin

RNA

: Acid Ribonucleic

RRDR

: Rifampin resistance determining region Vùng quyết ịnh kh ng

ng tr nh chống l o quốc gi

lo i thuốc isoni zid rif mpicin streptomycin

thuốc

rifampicin)
Taq polymerase

: Thermus aquaticus DNA polymerase

TCYTTG

: Tổ chức Y tế Thế giới

V

: Volume thể tích

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. ỆNH LAO ........................................................................................................... 3
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC ................................................................... 3
1.3. VI KHUẨN LAO .................................................................................................. 5
1.3.1. Cấu tạo ........................................................................................................... 5
1.3.2. Cơ chế gây bệnh ............................................................................................ 8
1.3.3. Đặc điểm hệ gen ............................................................................................ 9
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO ................................................ 9
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao ....................................................................... 9
1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc .................................................................. 10
1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng ....................................................................... 12
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng .......................................................................... 15
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ....................... 16
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng ............................... 16
1.5.2. Xác định kiểu hình ...................................................................................... 18
1.5.3. Xác định kiểu gen........................................................................................ 18
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR ............................. 19
Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................. 23
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 23
2.1.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .................................................... 23
2.1.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu ......................................................... 24


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 25
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 25
2.2.2. PCR nhân đoạn gen đích ............................................................................ 26
2.2.3. Tạo dòng gen ............................................................................................... 27
2.2.4. Multiplex real-time PCR ............................................................................ 28
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 30
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ............................................... 30
3.1.1. Kết quả nhân gen katG và rpoB t DNA tách t vi khuẩn lao ............... 30
3.1.2. Kết quả tách dòng gen ................................................................................ 31
3.1.3. Kết quả phân tích trình tự gen katG ......................................................... 34
3.1.4. Kết quả phân tích trình tự gen rpoB ......................................................... 36
3.2. TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN
NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC ......................................................... 41
3.2.1. Thiết kế các primer và probe cho phản ứng multiplex real-time PCR . 41
3.2.2. Kết quả tối ƣu thành phần và chu trình phản ứng multiplex real-time
PCR phát hiện đột biến liên quan kháng thuốc ................................................. 44
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 60
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 62
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 69


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

MỞ ĐẦU
ệnh l o và vi khuẩn l o Mycobacterium tuberculosis
thế kỷ n y. Hiện n y tỷ lệ nhiễm l o

ã

ợc biết rõ từ một

ợc ớc tính là 1/3 dân số thế giới khoảng 9

triệu ng ời mắc l o mới và h n 3 triệu ng ời chết do l o mỗi năm. ệnh l o
nên nghiêm trọng h n với sự xuất hiện c c chủng l o kh ng

ng trở

thuốc Multi-Drugs

Resistant - MDR tức là thể l o với vi khuẩn kh ng ít nhất h i lo i thuốc chống l o
m nh nhất là isoni zid INH và rif mpicin RMP . Theo số liệu thống kê củ ch

ng

tr nh chống l o Quốc gi năm 2007 thế giới có khoảng 511.000 tr ờng hợp nhiễm l o
kh ng

thuốc trong ó có h n 130.000 tr ờng hợp tử vong. Do những khó khăn

trong việc iều trị những bệnh nhân m ng c c chủng l o kh ng thuốc phổ rộng và
kh ng mà việc ph t hiện sớm c c chủng l o kh ng

thuốc sẽ trở nên rất qu n trọng

trong iều trị bệnh l o.
Hiện n y nhiều n i chẩn o n vi khuẩn l o kh ng thuốc vẫn dự vào ph

ng

ph p nu i cấy vi khuẩn và làm kh ng sinh ồ là chủ yếu tuy nhiên việc ứng dụng sinh
học phân tử cũng

ng t o r những ột ph trong ph t hiện vi khuẩn l o kh ng thuốc.

C chế kh ng thuốc ở vi khuẩn l o là do trong qu tr nh tiến hó

có nhiều ột biến

xuất hiện trong một số gen chức năng tr ớc hết là ở gen rpoB và katG. Thời gi n chẩn
o n có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày với ộ nh y và ộ ặc hiệu c o t o iều kiện
cho kiểm so t bệnh l o dễ dàng h n. C c nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn
o n l o kh ng thuốc ã chỉ r rằng mỗi lo i kh ng thuốc là do xuất hiện c c ột biến
trên gen t

ng ứng chịu tr ch nhiệm. Chính v vậy việc x c ịnh c c tr ờng hợp nhiễm

l o kh ng thuốc th ờng i kèm với những chẩn o n ph t hiện ột biến gen ối với c c
chủng l o ph t hiện

ợc. C c chủng vi khuẩn l o kh ng isoni zid là do có liên qu n

tới ột biến t i codon 315 trên gen katG

ối với c c chủng kh ng rif mpicin do xuất

hiện các ột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm củ gen rpoB.

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Xuất ph t từ những lý do trên chúng t i tiến hành ề tài: “Nghiên cứu phát
hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng
thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và
rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.
Để

t

ợc mục tiêu củ

ề tài chúng t i tiến hành một số nội dung nghiên

cứu nh s u:
1.

X c ịnh tr nh tự gen rpoB và katG.

2.

Phân tích ặc iểm phân tử củ c c chủng vi khuẩn l o kh ng thuốc phân
lập t i Việt N m trên c sở tr nh tự nucleotide củ h i gen rpoB và katG.

3.

Tối u hó thành phần và chu tr nh bộ kit multiplex real-time PCR phát
hiện nh nh vi khuẩn l o kh ng thuốc.

2


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1. ỆNH LAO
Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm m n tính là t nh tr ng nhiễm vi
khuẩn Mycobacterium tuberculosis th ờng gặp nhất ở phổi nh ng cũng có thể ảnh
h ởng ến hệ thần kinh trung
kê x

ng l o màng não hệ b ch huyết hệ tuần hoàn l o

ng và khớp. ệnh l o gắn liền với sự ph t triển củ xã hội loài ng ời từ hàng

ngàn năm n y trên thế giới ch

b o giờ và kh ng một quốc gi nào một khu vực nào

một dân tộc nào kh ng có ng ời mắc và chết v bệnh l o. Trực khuẩn l o lần ầu tiên
ợc b c sĩ Robert Koch ã ph t hiện vào ngày 24/3/1882. Trong thời gi n này ở Mỹ
và châu Âu cứ 7 ng ời th có 1 ng ời chết v l o do vậy ph t hiện củ Robert Koch là
một b ớc ngoặt qu n trọng trong việc khống chế và lo i trừ căn bệnh này. Tr ớc ây
l o

ợc xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới

l u hành với tỷ lệ mắc bệnh kh c o

ặc biệt ở c c n ớc thuộc châu Phi và khu vực

châu Á trong ó có Việt N m.
Việt N m ứng thứ 12 trong 22 n ớc có số bệnh nhân l o c o trên toàn cầu.
Trong khu vực Tây Th i

nh D

ng Việt N m ứng thứ b s u Trung Quốc và

Philippines về số bệnh nhân l o cũng nh số bệnh nhân l o xuất hiện hằng năm. Hiện
n y nguy c nhiễm l o ở n ớc t hằng năm
phí N m là 2% ở c c tỉnh phí

ợc ớc tính là 1 5% dân số ở c c tỉnh

ắc là 1% . Trên thực tế chỉ số nguy c nhiễm l o

hàng năm có thể c o h n 1 5% nh vậy c c con số nêu trên còn có thể lớn h n. Điều
ó sẽ tăng thêm sự khó khăn ối với c ng t c phòng chống l o kh ng những trong c c
năm tới mà có thể trong thời gi n kh dài có thể ến hàng chục năm ng y cả khi ở
thiên niên kỷ mới [3, 35].
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC
ệnh l o ngày càng trở nên phức t p và có ảnh h ởng nặng nề khi xuất hiện
thêm vi khuẩn l o kh ng thuốc t o nên một d ng bệnh khó phòng chống. C c chủng

3


Luận văn thạc sĩ

lao kháng thuốc

Nguyễn Văn Bắc

ợc chi làm h i thể

ó là l o kh ng

thuốc Multi-drugs resistant

- MDR và l o kh ng thuốc phổ rộng Extensively drug resistant - XDR những chủng
vi khuẩn l o kh ng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối e dọ cho sức khỏe củ
cộng ồng. Theo ớc tính củ Tổ chức Y tế thế giới WHO trên thế giới có khoảng 42
v n ng ời mắc l o kh ng
nh D

thuốc chiếm số l ợng lớn nhất là ở khu vực Tây Th i

ng có 15 v n tr ờng hợp kế ến là khu vực Đ ng N m Á và s u ó là khu

vực Châu Phi và Đ ng Âu. Một số chủng l o vừ kh ng

thuốc vừ kh ng thuốc phổ

rộng có thể coi là lo i siêu kh ng thuốc [17]. T nh h nh l o siêu kh ng thuốc cũng
ngày càng trở nên trầm trọng do vậy từ th ng 11/2004 ến 11/2005 WHO và Trung
tâm Kiểm so t ệnh Ho Kỳ ã phân tích 17.890 mẫu ờm gửi từ 40 quốc gi trên toàn
thế giới và thấy rằng có 20% tr ờng hợp là kh ng

thuốc và 2% tr ờng hợp là kh ng

thuốc phổ rộng. Ở Việt N m theo nghiên cứu củ Ch

ng tr nh Chống l o Quốc gi

thì có 32,5% c c tr ờng hợp bệnh l o mới m ng vi khuẩn l o kh ng thuốc [1, 3].
Vi khuẩn l o kh ng thuốc là một th ch thức lớn

e dọ c ng cuộc phòng chống

l o trên toàn cầu v c c thuốc chống l o có hiệu quả hiện n y
kh ng l i nhất là kh ng

ng bị vi khuẩn l o

thuốc [10]. Thuốc chống l o có nhiều lo i t c dụng củ mỗi

thuốc trên trực khuẩn l o kh ng giống nh u. Hiện n y ng ời t chi thuốc chống l o
thành h i lo i: 1 c c thuốc chống l o chủ yếu còn gọi là c c thuốc chống l o lo i
một thuốc chống l o hàng ầu

2 c c thuốc chống l o thứ yếu còn gọi là c c thuốc

chống l o lo i h i thuốc chống l o hàng thứ h i . Trong khi c c thuốc chống l o lo i
một là những thuốc có hiệu quả nhất và cũng ít ộc tính nhất th c c thuốc chống l o
hàng thứ h i là những thuốc có t c dụng kém h n l i có ộc tính c o và gi thành rất
ắt. Ở New York chi phí iều trị bệnh nhân nh y với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong
khi ó iều trị bệnh nhân kh ng thuốc hết 250.000 USD. Hiện n y số tử vong hàng
năm do l o trên thế giới còn lớn h n số tử vong do HIV sốt rét và c c bệnh nhiệt ới
cộng l i. Tổ chức Y tế Thế giới ã nhận ịnh bệnh l o hiện n y ã qu y trở l i và trở
nên tồi tệ h n bởi sự kh ng thuốc củ vi khuẩn l o [17].

4


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Thuốc kh ng sinh ầu tiên dùng ể iều trị l o là streptomycin nh ng vài năm
sau khi kháng sinh này

ợc sử dụng th ng ời t

ã nhận thấy hiện t ợng ề kh ng l i

streptomycin củ vi khuẩn l o. S u ó c c kh ng sinh chống l o kh c tiếp tục r

ời:

para – minos lysilic isoni zid rif mpicin nh ng ều kh ng m ng l i hiệu quả s u
một thời gi n iều trị nhất ịnh [7]. Nghiên cứu t m kiếm ho d ợc mới có hiệu quả
iều trị l o

ặc biệt là l o kh ng thuốc lu n lu n

có nhiều hợp chất chống l o mới

ợc

ợc thực hiện và càng ngày càng

vào sử dụng ví dụ gần ây là linezolid

[43]. Tuy nhiên theo c chế và p lực vi khuẩn kh ng ngừng biến ổi t o nên nhiều
chủng mới h n có khả năng kh ng thuốc nh nh chóng h n [52]. Khả năng iều trị
thành c ng có thể

t 95-100% ối với những bệnh nhân mắc l o th ng th ờng trong

khi tỷ lệ thành c ng với bệnh nhân mắc l o kh ng thuốc chỉ là 20 – 30% thậm chí
còn kh ng iều trị

ợc khi mắc l o kh ng

thuốc và kh ng thuốc phổ rộng mặc dù

ã dùng kết hợp ến năm lo i kh ng sinh iều trị l o. V vậy việc ph t hiện và ngăn
chặn sự l n truyền c c chủng l o kh ng

thuốc là vấn ề qu n trọng nhất trong iều

trị l o hiện n y [7, 10, 35].
1.3. VI KHUẨN LAO
1.3.1. Cấu tạo
Trực khuẩn l o có d ng h nh que thân mảnh dẻ kh ng có nh bào kích th ớc 2
- 3 µm dày 0 3 µm kh ng cồn kh ng cid (hình 1.1). Khi

ợc nhuộm bằng ph

ng

pháp Ziehl - Neelsen trực khuẩn l o bắt màu ỏ thẫm do kh ng bị cồn và cid làm
mất màu c rbonfuchsin. Ở m i tr ờng nu i cấy có ộ cid ậm ặc nhất ịnh trực
khuẩn l o vẫn ph t triển

ợc v vậy chúng

toan (acid fast bacilli - AF

ây là

ặc

ợc gọi là trực khuẩn kh ng cồn kh ng
iểm nổi bật củ vi khuẩn thuộc chi

mycob cteri . Đặc iểm này rất qu n trọng ể ph t hiện trực khuẩn l o bằng ph

ng

ph p h nh th i học nhuộm màu trong c c mẫu bệnh phẩm. Một số giả thiết cho rằng
mức kh ng cid là do ộ dài củ c c chuỗi mycolic cid. M. tuberculosis có khả năng

5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thể hiện tất cả c c c chế cần thiết ể tổng hợp c c vit min mino cid và c c enzyme
cof ctor thiết yếu củ tế bào. Mycob cteri có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gr m
d

ng nh ng chúng kh ng

ợc xếp vào lo i vi khuẩn Gr m d

ng do c c phân tử gắn

với thành tế bào là lipid chứ kh ng phải protein h y polys cch ride. Do ó chúng
kh ng giữ l i tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gr m [2, 5, 37, 38].
Trực khuẩn l o rất hiếu khí ph t triển tốt nhất ở 37oC và d ới p suất củ O2 là
100 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi d ới x

ng òn th ờng h y mắc l o nhất v có p

suất O2 từ 120 – 130 mmHg khi ứng rồi ến thân x

ng và ầu x

ng v p suất O 2

ở ây là 100 mmHg. L ch g n d dày thực quản ít mắc l o h n v p suất O2 thấp.
Trực khuẩn l o sinh sản rất chậm cứ 20 giờ mới có một lần phân chi tế bào
trong iều kiện phòng thí nghiệm th cứ 12 ến 24 giờ M. tuberculosis phân chi một
lần trên m i tr ờng nu i cấy giàu dinh d ỡng Loewenstein [46]. Tốc ộ ph t triển
chậm có thể là do tính thẩm thấu củ thành tế bào h n chế trong việc hấp thụ chất dinh
d ỡng và liên qu n ến tốc ộ tổng hợp ribosome H nh 1.2).

Hình 1.1. Hình dạng của tế bào M.
tuberculosis
(http://www.diseasedetectives.org/mi
crobe_gallery/tuberculosis)

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn lao phát
triển trong môi trƣờng nuôi cấy.
(http://abcnews.go.com/Health/Germs
/story?id=3079114&page=1)

6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Trực khuẩn l o có cấu t o rất phức t p hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có

ợc.

D ới kính hiển vi iện tử trực khuẩn l o có cấu t o chính nh s u (hình 1.3):
- Lớp trong cùng có cấu trúc màng có thành phần chủ yếu là c c phospholipid
gồm 2 nhóm: nhóm

n ớc h ớng vào bên trong nhóm kỵ n ớc qu y r ngoài. Cấu

trúc này t o nên màng sinh học có t c dụng giúp trực khuẩn iều hò sự thẩm thấu củ
vỏ ngoài trực khuẩn màng còn chứ c c protein chức năng kh c nh c c protein truyền
tín hiệu ến bộ m y tr o ổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất c c enzyme liên
qu n ến qu tr nh tr o ổi chất và sinh năng l ợng c c chất m ng làm trung gi n cho
qu tr nh vận chuyển c c chất dinh d ỡng và c c ion. C c enzyme xuyên màng và tổng
hợp màng t o thành v ch ngăn trong phân chi tế bào tập hợp và tiết một số enzyme
ngo i bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].
- Lớp tiếp theo là peptidogluc n liên kết với

ờng r binose và c c phân tử

mycolic cid t o nên một bộ khung ịnh h nh cho vi khuẩn ảm bảo cho vi khuẩn có
ộ cứng nhất ịnh. Thành tế bào củ mycobacteria là cấu trúc phức t p nhất

ợc biết

ở prok ryote có một số thành phần hó học và liên kết chéo bất th ờng mức ộ liên
kết giữ peptidogluc n ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn
E. coli là 20 - 30% [38]
- Lớp ngoài
phức t p

ợc t o nên bởi sự liên kết giữ c c mycolic cid và c c chất

ây là lớp t o nên ộc tính củ vi khuẩn l o và có cấu trúc phức t p làm

tăng khả năng chống thấm n ớc củ thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn t i
lâu với m i tr ờng bên ngoài chống khả năng bị hủy diệt bởi

i thực bào và c c tế

bào miễn dịch [38].
- Lớp vỏ ngoài cùng có v i trò rất qu n trọng có cấu trúc peptidoglyolipid.
Nó ảm bảo cho sự tồn t i củ trực khuẩn làm cho trực khuẩn bền vững với hiện
t ợng thực bào giúp bảo vệ khỏi p suất thẩm thấu nên khi vào c thể trực khuẩn
khó bi tiêu diệt.

7


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.3. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis
(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm)

1.3.2. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn l o có thể xâm nhập vào c thể qu nhiều con
th ờng là
tổn th

ờng h hấp hoặc có thể qu

ờng tiêu hó d kết m c mắt. S u khi gây

ng tiên ph t vi khuẩn l o có thể theo

ến gây tổn th

ờng kh c nh u:

ờng b ch huyết hoặc

ờng m u ể

ng thứ ph t ở c c c qu n kh c: Phổi thận màng não x

nh ng th ờng bị h n cả là ỉnh phổi n i có p suất oxy là 120 mmHg v

ng h ch
ây là iều

kiện ho t ộng tốt cho vi khuẩn l o. Độc lực củ vi khuẩn l o có liên qu n ến “Cord
factor” treh lose - 6 6’- dimycol te là chất gây ức chế ho t ộng củ tế bào b ch cầu
gây nên những u h t m n tính [7].
Khi vi khuẩn l o xâm nhập vào c thể trong c thể xuất hiện
qu trung gi n tế bào. Lúc này

p ứng miễn dịch

i thực bào c c tế bào lympho T lympho

nguyên bào sợi kết tập l i t o c c u h t với c c tế bào lympho vây qu nh

và c c

i thực bào.

Chức năng củ c c u h t kh ng chỉ ngăn cản sự l n tỏ củ tế bào M. tuberculosis mà
còn t o m i tr ờng t i chỗ cho c c tế bào củ hệ miễn dịch tr o ổi th ng tin [23]. Bên
trong c c u h t tế bào lympho T tiết r c c cytokine nh γ interferon ho t hó

8

i


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt h n. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp c c
tế bào bị nhiễm. Nh ng iều qu n trọng là vi khuẩn kh ng bị u h t lo i trừ hoàn toàn
mà trở nên bất ho t t o d ng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” l tent tuberculosis [18].
1.3.3. Đặc điểm hệ gen
Toàn bộ hệ gen củ vi khuẩn l o M. tuberculosis chủng H37Rv

ợc giải tr nh

tự phân tích và c ng bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp với ặc tính là chứ nhiều
gu nine và cystosine G + C khoảng 65 % . Trên 90% tr nh tự

ợc dự o n là có mã

hó cho protein và chỉ có 6 gen giả pseudogene - gen không mang thông tin di
truyền mã hó cho protein [28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen củ một số vi khuẩn thuộc chi
Mycobacterium tr ớc hết là củ vi khuẩn l o M. tuberculosis và vi khuẩn phong
(M. leprae) có tầm qu n trọng ặc biệt trong nghiên cứu ặc iểm sinh học phân tử
hỗ trợ dịch tễ học di truyền học và nghiên cứu kh ng thuốc số liệu ã
t i một số trung tâm và có thể sử dụng một số ch

ợc l u giữ

ng tr nh ể truy cập kh m ph và

sử dụng [11, 53].
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao
Thuốc chống l o có nhiều lo i và t c dụng củ chúng lên trực khuẩn l o cũng
kh ng giống nh u. Hiện n y ng ời t chi thuốc chống l o làm h i lo i: 1 C c thuốc
chống l o chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu ó là: isoni zid INH rif mpicin RMP
ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin SM . Đây là những thuốc kh ng
l o hiệu quả và cũng ít ộc tính nhất. 2 C c thuốc chống l o thứ yếu: là những thuốc
chống l o có t c dụng kém h n và có ộc tính c o kh ng
iều trị l o nh ng l i

ợc dùng trong ph c ồ

ợc dùng trong c c tr ờng hợp iều trị thất b i do vi khuẩn l o

kh ng l i c c lo i thuốc chống l o lo i một. C c thuốc này gồm có: ethion mide
prothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin,
thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…

9


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

C c thuốc isoni zid cycloserine k n mycin có t c dụng ức chế tổng v ch tế
bào. C c thuốc streptomycin k n mycin c preomycin có t c dụng ức chế tổng hợp
protein. C c thuốc rif mpicin và eth mbutol có t c dụng ức chế sự tổng hợp nucleic
cid. Thuốc p r minos licylic cid có t c dụng chống chuyển hó [7, 35, 37, 38].
1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc
Vi khuẩn l o kh ng thuốc là khi chúng kh ng chịu sự t c ộng củ c c lo i kh ng
sinh dùng iều trị chúng. Th ờng nói tới vi khuẩn l o kh ng thuốc là nói tới những
tr ờng hợp vi khuẩn l o kh ng với một trong những thuốc chống l o dòng thứ nhất:
isoni zid rif mpicin pyr zin mide eth mbutol hoặc streptomycin [7, 35]
Tính kh ng thuốc b o gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính:
-

Thuốc hoặc c c gen ích bị làm biến ổi trong c c chủng kh ng thuốc do ó
c c thuốc kh ng còn t c dụng nữ trong việc tiêu diệt vi khuẩn.

-

Sản phẩm củ gen mà ho t tính củ nó bị ức chế bởi thuốc

ợc vi khuẩn

sản xuất thừ r do ó l ợng thuốc mà bệnh nhân uống vào kh ng ủ ể ức
chế hoàn toàn vi khuẩn l o.
-

Những th y ổi xảy r ở mức ộ phân tử và c chế xâm nhập củ thuốc vào
bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng ộ thuốc bên trong tế bào kh ng

t

tới nồng ộ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh.
Hiện t ợng kh ng thuốc củ vi khuẩn l o có thể xảy r tr ớc khi xâm nhập tiên
ph t hoặc s u khi nhập vào c thể ng ời bệnh thứ ph t . Vi khuẩn l o kh ng thuốc tiên
ph t là hiện t ợng lây nhiễm bởi một chủng ã kh ng thuốc mà vi khuẩn này ã có sự ề
kh ng tự nhiên. V vậy bệnh nhân mắc l o do sự lây nhiễm này ng y từ ầu vi khuẩn
l o xâm nhập vào c thể ã có sự ề kh ng với thuốc
kh ng thuốc thứ ph t xảy r

ng sử dụng. Còn hiện t ợng

ối với c c chủng vi khuẩn l o ở bệnh nhân nào ó dùng

10


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thuốc chống l o kh ng úng quy ịnh kh ng úng liều l ợng thời gi n sử dụng thuốc
do ó ã chọn lọc vi khuẩn l o kh ng thuốc [1, 38].
C c chủng vi l o kh ng thuốc
thuốc MDR – T

ợc chi làm h i lo i: 1 C c chủng l o kh ng

: Là tr ờng hợp khi c c chủng vi khuẩn l o kh ng ồng thời h i

thuốc chống l o m nh nhất hiện n y là isoni zid và rif mpicin. 2 C c chủng l o
kh ng thuốc phổ rộng XDR – T
kh ng

: Là tr ờng hợp khi vi khuẩn l o ã ở t nh tr ng

thuốc và có thêm tính kh ng một trong b

lo i thuốc chống l o là

capreomycin, kanamycin, amikacin [49].
Ngày n y khi nghiên cứu về sinh học phân tử ng ời t
kh ng l i nhiều lo i kh ng sinh có liên qu n ến c c gen t
tả c c c chế phân tử củ hiện t ợng kh ng
isoniazid

ã x c ịnh

ợc c chế

ng ứng. Trong hình 1.4 mô

thuốc ở vi khuẩn l o. Trong ó kháng

ợc cho là liên qu n ến c c gen: KatG, inhA, aphC và kasA. Kháng

streptomycin có thể là do ột biến ở gen rpsL. Kháng pyrazinamid có thể liên qu n ến
gen pncA. Kh ng quinolone có thể liên qu n tới gen gyrA. Kháng rifampicin

ợc x c

ịnh là liên qu n ến ột biến ở vùng gần lõi củ gen rpoB gen mã hó tiểu phần β củ
RNA polymerase [7, 25]. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu c chế
kh ng

thuốc tức là tr ờng hợp vi khuẩn l o kh ng ồng thời h i thuốc chống l o

m nh nhất hiện n y là isoniazid và rifampicin
các ột biến trên gen rpoB với katG.

11

iều ó ồng nghĩ với việc nghiên cứu


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.4. Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao
(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis).

1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng
Rifampicin tên kho học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl]
(hình 1.5A). Rif mpicin là dẫn xuất b n tổng hợp từ rif mpicin

một kh ng sinh

ợc chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có ho t tính diệt khuẩn
m nh tiệt khuẩn thuốc diệt vi khuẩn l o trong và ngoài tế bào. Rif mpicin kh ng có
hiện t ợng kh ng thuốc chéo với c c lo i thuốc chữ l o kh c. Nồng ộ ức chế tối
thiểu minimum inhibitory concentration - MIC

ối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in

vitro . Đây là thuốc ức chế RNA polymer se m nh nhất [29, 48].

12


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

A

B

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

C chế t c ộng củ rif mpicin liên qu n ến khả năng ức chế ho t ộng
củ RNA polymer se. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu
vị kh c nh u α β β’ ω



ợc mã hó t

n

ng ứng bởi c c gen rpoA rpo

rpoC, rpoD [7, 20].
Khi rifampicin gắn với tiểu

n vị β củ RNA polymer se rpo

làm ức chế

c c ho t ộng s o chép t o r c c mRNA củ vi khuẩn l o và do ó làm ng ng trệ c c
ho t ộng sống củ vi khuẩn l o. Đây là c chế c chế t c dụng củ RMP ối với vi
khuẩn lao (hình 1.6).

Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]

13


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Gen rpoB có kích th ớc 3519 bp mã hó cho tiểu phần β củ RNA polymer se
Tuberculosis 2007 . Những ột biến kh ng kh ng sinh rif mpicin th ờng xảy r trên
o n gen rpoB nhất là o n nằm gần trung tâm củ gen dài 81 bp

ợc giới h n từ bộ

b 507 ến 533 ng ời t gọi ây là vùng “nóng” – “hot-spot region” hình 1.7 . Đột
biến ở bộ b thứ 526 516 531 cho kết quả ề kh ng với rif mpicin c o; ột biến ở bộ
ba 510, 515 và 512 th cho khả năng kh ng rif mpicin ở mức ộ thấp h n [47]. Đo n
nucleotide củ vùng nóng gồm:
507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC
CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533
Mỗi nucleotide trên o n này có thể bị th y thế ho n ổi vị trí mất i thêm vào
ể t o r c c ột biến

ợc thể hiện trên hình 1.7 nh s u: [41].

Hình 1.7. Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng”
của gen rpoB [41]

- Khi xảy r

ột biến gần vùng lõi củ gen rpoB sẽ làm th y ổi cấu trúc tiểu

phần β củ RNA polymer se mà nó mã hó nên làm cho khả năng kết hợp củ RMP
với tiểu phần này giảm i. Kết quả là t c dụng củ rifampicin ối với vi khuẩn l o giảm

14


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

hoặc mất i. Nh vậy ột biến trên vùng gen này củ rpoB ã làm cho vi khuẩn l o trở
nên kh ng thuốc với rif mpicin.
- 90 - 95 % c c chủng M. tuberculosis kháng rifampicin

ợc x c ịnh là do c c

ột biến trên vùng gen nóng 81 bp này củ rpoB. Nh vậy còn 5 - 10 % c c chủng vi
khuẩn l o kh ng có ột biến trên vùng này củ gen rpoB. Điều này cho thấy cần phải x c
ịnh thêm những ột biến kh c trên gen này hoặc những gen kh c có liên qu n ể x c ịnh
chính x c và toàn bộ c chế kh ng rifampicin củ vi khuẩn lao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng
Isoni zid có tên kho học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc
chống l o

ặc hiệu c o có t c dụng chống l i M. tuberculosis và c c lo i

Mycobacterium kh ng iển h nh kh c nh M. bovis, M. kansasii. Isoni zid diệt khuẩn
phụ thuộc vào nồng ộ thuốc ở vị trí tổn th

ng và mức ộ nh y cảm củ vi khuẩn. C

chế t c dụng củ isoni zid có liên qu n tới sự h nh thành phức hệ cyl isonicotinicNADH và nh

ã tr nh bày ở trên chúng ức chế sự tổng hợp cid mycolic cần cho

thành tế bào vi khuẩn l o.
Gen katG có kích th ớc 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase. Enzyme này
ho t hó INH bằng c ch kết hợp cyl isonicotinic với NADH ể t o thành phức hệ cyl
isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreduct se mã hó bởi
gen InhA theo ó làm ngăn cản sự h nh thành c chất enoyl-AcpM và ho t ộng tổng
hợp cid béo. Qu tr nh này làm ức chế sự tổng hợp cid mycolic cần cho thành tế bào
vi khuẩn l o.

15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.8. Cơ chế kháng INH ở vi khuẩn lao
(http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureId=2CCA)

C chế phân tử củ tính kh ng INH chủ yếu có liên qu n tới ột biến thêm
o n/mất o n hoặc c c ột biến nhầm nghĩ /v nghĩ

trong ó chủ yếu diễn r t i

codon 315 (Ser  Thr củ gen katG mã hóa catalase peroxidase [26]. Nếu có sự biến
d ng h y ột biến ở b se thứ 2 t i codon 315 củ gen katG AGC biến ổi thành ACC
h y ACA sẽ dẫn ến làm giảm hoặc mất hoàn toàn ho t tính củ c t l se peroxid se
do ó M. tuberculosis sẽ trở thành kh ng thuốc INH (hình 1.8) [14]. Do ó ph t hiện sự
th y ổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một ph

ng ph p sàng lọc

nh nh và chính x c cho việc ph t hiện c c chủng M. tuberculosis kháng isoniazid.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng
*) Đặc điểm lâm sàng
Nh n chung c c dấu hiệu lâm sàng củ bệnh l o có vi khuẩn kh ng thuốc kh ng
kh c nhiều với bệnh l o mà vi khuẩn nh y cảm với thuốc.

16


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Tr ờng hợp nhiễm vi khuẩn l o kh ng thuốc tiên ph t có thể có triệu chứng cấp
tính h n sốt c o h n.
Đối với kh ng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân l o m n tính,
ợc iều trị ít nhất 2 lần. Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số
bệnh nhân l o kh ng

thuốc. Hầu hết bệnh l o kh ng

thuốc bệnh tiến triển h y

gặp dò phế quản – màng phổi mà iều trị gặp nhiều khó khăn [7].
*) Xét nghiệm lâm sàng
- Phản ứng Tuberculin: th ờng th phản ứng d ở những bệnh nhân kh ng thuốc tiên
ph t có mức ộ m nh h n so với những bệnh nhân có vi khuẩn nh y cảm với thuốc.
Đối với kh ng thuốc mắc phải

ặc biệt là kh ng

thuốc ở bệnh nhân ồng nhiễm

HIV + th tỷ lệ phản ứng này âm tính kh c o.
- H nh ảnh X Qu ng: khi chụp phổi thẳng kết quả cho thấy h nh ảnh về bệnh l o
phổi giữ tr ờng hợp l o kh ng thuốc tiên ph t với tr ờng hợp nh y cảm với
thuốc kh ng có sự kh c biệt. Nh ng những tr ờng hợp kh ng thuốc mắc phải th
gặp nhiều là thể x h ng diện tích phổi tổn th

ng nhiều h n và có nhiều h ng

kích th ớc củ h ng lớn h n.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ Về h nh thể: c c vi khuẩn b nh th ờng có cấu t o thành tế bào 3 lớp nh ng ở
vi khuẩn kh ng thuốc thành tế bào có cấu t p 4 lớp vi khuẩn có thêm một lớp
peptidoglycolipid ở ngoài cùng . Vi khuẩn kh ng với rif mpicin có thành tế
bào cũng dày h n hẳn so với vi khuẩn nh y với thuốc. Khuẩn l c củ vi
khuẩn kh ng thuốc có thể kh ng iển h nh khi nu i cấy mọc cằn cỗi [7]
+ Về số l ợng vi khuẩn khi soi kính và nu i cấy: những bệnh nhân kh ng thuốc
thứ ph t có số l ợng vi khuẩn khi soi kính c o h n nhiều so với bệnh nhân
th ng th ờng. Kh ng có sự kh c nh u nhiều giữ bệnh nhân kh ng thuốc tiên
ph t và bệnh nhân th ng th ờng. Khi nu i cấy trên m i tr ờng ặc số khuẩn
l c mọc ở bệnh nhân kh ng thuốc mắc phải là c o h n và thời gi n mọc

17


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

nh nh h n so với kh ng thuốc tiên ph t và ở những bệnh nhân này số khuẩn
l c l i c o h n ở bệnh nhân th ng th ờng [7].
+ Về ặc iểm kh ng sinh ồ: kh ng thuốc tiên ph t th ờng kh ng h y kh ng
với nồng ộ thấp kh ng thuốc mắc phải th ờng kh ng với nồng ộ c o h n.
Kh ng thuốc tiên ph t h y gặp với một thuốc kh ng thuốc thứ ph t th ờng tỷ
lệ kh ng cùng lúc với nhiều thuốc c o h n [7].
Nh vậy kh ng thể dự vào lâm sàng h y thời gi n iều trị hiệu quả ể chẩn
o n bệnh nhân l o kh ng thuốc

ợc. C c xét nghiệm cận lâm sàng kh c chỉ có gi trị

gợi ý. Chẩn o n bệnh l o kh ng thuốc hiện n y vẫn phải lấy kết quả kh ng sinh ồ
làm tiêu chuẩn.
1.5.2. Xác định kiểu hình
Gồm c c ph

ng ph p s u: Ph

ng ph p x c ịnh t

ng qu n ph

ng ph p

x c ịnh tỷ lệ kh ng ph

ng ph p o màu ph

ng ph p khử nitr te và nhiều ph

pháp khác [13]. C c ph

ng ph p này ều x c ịnh khả năng ph t triển củ vi khuẩn

l o trong m i tr ờng nu i cấy có kh ng sinh từ ó
thuốc củ chủng vi khuẩn l o

ng

r kết luận về khả năng kh ng

ng nghiên cứu [12]. Nh ợc iểm củ c c ph

ng ph p

này là vi khuẩn l o mọc chậm trên m i tr ờng Lowenstein-Jensen th ờng mất 4-6
tuần. Sử dụng hệ thống m i tr ờng lỏng

ợc cải tiến nh MGIT

ATEC cũng mất 2

tuần. Điều này làm cho c ng t c iều trị và kiểm so t t nh h nh bệnh l o cũng nh bệnh
l o kh ng thuốc còn khó khăn.
1.5.3. Xác định kiểu gen
Hiện n y có nhiều ph

ng ph p x c ịnh kiểu gen

ợc ứng dụng ể chẩn o n

vi khuẩn l o kh ng thuốc [1, 4] giải tr nh tự gen [6], l i trên ph rắn [36], Real – time
PCR [14]
C c ph

ng ph p chẩn o n x c ịnh kiểu gen dự trên c sở ph t hiện ột biến

ở c c gen có liên qu n tới tính kh ng thuốc t

18

ng ứng [51] sử dụng c c kỹ thuật c o


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

òi hỏi thiết bị hiện

i tốn kém và cần nhân lực có tr nh ộ chuyên sâu nh ng thời

gi n chẩn o n bằng ph

ng ph p này nh nh h n có ộ nh y và ộ ặc hiệu c o.

Để x c ịnh ột biến trên gen có liên qu n tới kh ng thuốc gen rpoB và katG)
hiện n y giải tr nh tự gen vẫn là ph

ng ph p x c ịnh c bản chính x c nhất và thời

gi n cho kết quả từ 3 - 5 ngày. S u khi giải tr nh tự o n gen vừ

ợc t ch dòng từ

chủng l o nghiên cứu t sẽ so s nh trật tự sắp xếp c c nucleotide ở mẫu thí nghiệm với
trật tự nucleotide chuẩn ể biết

ợc c c vị trí s i lệch [22, 16].

Việc x c ịnh các ột biến có liên quan kh ng thuốc rif mpicin và isoniazid
bằng kỹ thuật giải tr nh tự cho biết chính x c vị trí ột biến cũ và mới trên gen cần
nghiên cứu m ng l i hiểu biết sâu sắc về sự
ở bệnh nhân l o kh ng thuốc

nh gi

d ng củ cấu trúc quần thể vi khuẩn l o

ợc tỷ lệ ột biến liên qu n kh ng thuốc trên

c c chủng l o phân lập từ c c vùng ị lý kh c nh u. Qu

ó làm tiền ề xây dựng một

số bộ kit real-time PCR nhằm ph t hiện nh nh vi khuẩn l o kh ng rifampicin và
isoni zid t i Việt N m.
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch

i DNA ích hiển thị

ợc

ng y s u mỗi chu kỳ nhiệt củ phản ứng do ặc iểm này nên với re l-time PCR ng ời
làm thí nghiệm kh ng cần thiết phải làm tiếp c c b ớc thí nghiệm ể ọc và phân tích
kết quả ể x c ịnh có sản phẩm khuếch
phản ứng khuếch

i cũng

i ích h y kh ng v kết quả cuối cùng củ

ợc hiển thị ng y s u khi hoàn tất phản ứng khuếch

i.

Nh vậy nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA ích trong ống
nghiệm thành hàng tỷ bản s o dự vào c c chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch
ống phản ứng

ợc hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch

nghiệm có thể thấy

i xảy r

i trong

ể ng ời làm thí

ợc.

Chìa khó củ kỹ thuật re l-time PCR chính là hó chất và thuốc thử có trong
phản ứng trong ó chất huỳnh qu ng

ợc thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố ầu

19


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×