Tải bản đầy đủ

NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG mẫu HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. TS. HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI - 2015



LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và
TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
được học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá
K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ
những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015
Học viên

Vũ Anh Phương

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


MỤC LỤC

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên



DANH SÁCH HÌNH
Chương 1.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
% RSD
% RSDR
ACN
AS
ATP
BN
DAD
DQ
EPQ
GC - MS
HP
HPLC
LC - MS
LOD
LOQ
MeOH
ppm
PQ
R
ROC
RP-HPLC
SD
SIPP
TCA
tR

Vũ Anh Phương

Tên tiếng anh
% Relative standard deviation
% Reproducibility standard

Tên Tiếng việt
% Độ lệch chuẩn tương đối
% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation
Acetonitrile
Asymmetry factor
Adenosin Triphophate
Patient
diode-array detector
Diquat
Ethylparaquat
Gas chromatography - Mass

tương đối
Acetonitril
Hệ số đối xứng pic
Adenosin Triphophat
Bệnh nhân
detector mảng diode
Diquat
Ethylparaquat

spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy
Limit of Detection
Limit of Quantification
Methanol
Parts per million
Paraquat
Relative coefficient
Receiver operating characteristics
Reverse phase-HPLC
Standard deviation
Severity Index of Paraquat
Poisoning
Trichloroacetic acid
Retention time

Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Methanol
Phần triệu
Paraquat
Hệ số tương quan
Đường cong ROC
Sắc ký lỏng pha đảo
Độ lệch chuẩn
Chỉ số độ nặng của ngộ độc
Paraquat
Acid Tricloacetic
Thời gian lưu

Trường ĐHKH Tự nhiên


Tên viết tắt
UV-VIS

Vũ Anh Phương

Tên tiếng anh
Ultraviolet-Visible

Tên Tiếng việt
Tử ngoại và khả kiến

Trường ĐHKH Tự nhiên


Vũ Anh Phương

7

Trường ĐHKH Tự nhiên


ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá
thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiện
đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy
nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người. Liều tử vong của
PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm
sử dụng nhưng ở Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóa
chất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp
cứu [1]. Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo [10][19][27].
Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng
bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng
nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca. Tỉ lệ tử
vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tác
giả nước ngoài [29][32]. Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ tử
vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện Chợ
Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ
trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của
ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều
trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu
các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước
ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc
máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho
kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét
nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh
giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ
định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

Vũ Anh Phương

8

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ
máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn
đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho
việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên
cả nước gặp rất nhiều khó khăn.
Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương
pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS)... Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình
chuẩn định lượng PQ huyết tương. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu:
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người
và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.
2. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat
trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc
bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

Vũ Anh Phương

9

Trường ĐHKH Tự nhiên


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về paraquat
1.1.1. Công thức paraquat
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính
diệt cỏ nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,
được tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc
trừ cỏ từ những năm 1950 [42].
PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat
PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20 oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180 oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ
trong nước 6,5 - 7,5.
PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng dichloride tinh
thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch môi trường
acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm.
PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20 oC), ít tan trong cồn và hầu như
không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề
mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không
bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].

Vũ Anh Phương

10

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại và
hàm lượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh. Một số
tên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone,
Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm
sử dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu).
Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm
lượng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên
thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42].
Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ
ngộ độc cấp tính rất lớn.
Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là
Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước
họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước
thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat
Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat [15]

Vũ Anh Phương

11

Trường ĐHKH Tự nhiên


Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ 2+ cùng với NADPH trải qua
một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ +) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như
ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ 2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu
trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và
không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản
thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do
hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử
tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứng
với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho
tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40].
Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự
do khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào
việc thay đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase,
α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện
nay không có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn
chưa được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác
giữa PQ, NADPH và oxy. Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho
việc hình thành bệnh lý do PQ. Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong
việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da,
mắt và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là
đường tiêu hoá, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn
mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan
đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng
ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo
cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP.
Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có
liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ

Vũ Anh Phương

12

Trường ĐHKH Tự nhiên


hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận,
viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37].
Việc tiếp xúc với lượng PQ ít hơn sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ phổi tiến
triển và suy thận [33]. Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy phơi nhiễm PQ có
liên quan với hội chứng Parkinson [21][23].
Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong
huyết tương. Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thì
hầu hết tử vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ
trong máu cao hơn 2 µg/ml [7][10][22].
1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. Hấp thu
Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%). Hấp thu chủ
yếu ở ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp
thu sẽ tăng lên. PQ không gắn với protein huyết tương. Nồng độ đỉnh của PQ trong
huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu
vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc
với PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để
gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 µm) làm
cho PQ không đi sâu được xuống đường hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với
PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân.
1.1.4.2. Phân bố
Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tất cả các cơ quan chính như
phổi, thận, gan và cơ, đặc biệt là phổi, PQ sẽ bị khử thành dạng gốc tự do hoạt tính
cao [8][22]. Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg.
PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi
có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần. Sau uống 5-7 giờ, nồng độ
PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt
đến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11].

Vũ Anh Phương

13

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ qua được nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và
máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11]. Không có bào thai
nào sống sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không
nguy hiểm đến bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ
PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu
thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên
90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình
thường [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do
có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dưới dạng
không đổi [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo
thời gian. Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm
giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29]
lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng
độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN
sống có nồng độ dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24
giờ sau uống PQ. Schermann và cộng sự [35] mở rộng đường cong tiên lượng BN
này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng
độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc
tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiên
lượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống. Suzuki và cộng sự
(1991) [36] đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann
(1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lượng
chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống được đánh giá
trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ
nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng

Vũ Anh Phương

14

Trường ĐHKH Tự nhiên


đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc
biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gian
thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng.
Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tương có thể không hoàn toàn chính xác vì được
phân tích bằng một số phương pháp khác nhau và các nghiên cứu thường không
trình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa
các bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này
chưa được nghiên cứu.

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian
sau uống, và khả năng sống.
Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ số tiên lượng ngộ độc PQ
dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN
sống. Chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính
bằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ
huyết thanh (µg/ml) khi vào viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử
vong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP <50) với tử vong sớm do suy tuần hoàn
(SIPP > 50). Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định

Vũ Anh Phương

15

Trường ĐHKH Tự nhiên


lượng dùng huyết thanh không phải huyết tương. Suzuki và cộng sự (1991) đã so
sánh SIPP với đồ thị tiên lượng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau
uống PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1
trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10
trường hợp tử vong. Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận
rằng dựa trên nồng độ PQ trong 24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên
lượng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm
trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời,
có thể chiết được bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định
lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với
Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điều
kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12h và
không cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định
luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó,
phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2
phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato
K. [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và DQ.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các
thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ,
sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm
NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại như Fe 3+ và Al3+, có
thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%
trước khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết

Vũ Anh Phương

16

Trường ĐHKH Tự nhiên


được với TBPE trong dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ-TBPE có
quang phổ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603
nm & DQ ở bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M. Giới hạn phát
hiện 4,77.10-7 M.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH 4 đã được ứng dụng để định lượng
PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫu
thực phẩm và các mẫu trong môi trường.
Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại
bước sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ
trong huyết tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật
Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước
sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất. Huyết tương sạch và các dung
dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v).
Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét
bước sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý mẫu như trên, dịch trong phần trên
được chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trước khi đo, 400
μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích
Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và
đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bước
sóng Δλ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán theo công thức
Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao,
từ lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và
Almeida R. M. [5] cùng sử dụng phương pháp GC-MS để định lượng PQ. Trong cả
hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion
monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,
khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu

Vũ Anh Phương

17

Trường ĐHKH Tự nhiên


phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m 0,18 mm, độ
dày màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là 280,
280, 200oC. Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu được
đưa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là 70 oC
trong 1 phút và tăng đến 295 oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC được duy trì
trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng PQ &
EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và 95,00 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là 0,01
µg/ml đối với cả máu và nước tiểu. Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích
các mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GCMS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972)
với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1
µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ
phận ghép nối giữa GC và MS) là 270 oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt
độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến
270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion được chọn cho các
hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220
(EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 được dùng để định lượng PQ & EPQ.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P. đều định lượng PQ trong mẫu sinh
học bằng sắc ký lỏng - ion hóa tia điện - khối phổ [28] [41].
ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 μl với cột
ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30 oC. Còn Proenca P. sử
dùng hệ thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 ×
2,1 mm × 5 µm). Nhiệt độ cột duy trì 35 oC. Bơm mẫu 10 µl. Detector mảng

Vũ Anh Phương

18

Trường ĐHKH Tự nhiên


photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm.
Độ hấp thụ UV được đo ở 258 nm.
Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile.
Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH
3,7 bằng acid formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc
độ dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20%
trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng
thời gian chạy là 3 phút. Thì tác giả Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và
đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc
độ 300 µl/phút.
Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ và
chuẩn nội nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY
BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ưu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm
dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250
mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h
ở 350oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là
4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản
phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản
phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy
khối phổ tứ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120 oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N 2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng
ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan)
0,1s. Đường chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu
(y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nước
tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và

Vũ Anh Phương

19

Trường ĐHKH Tự nhiên


nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định
lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu.
Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu
với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong
dịch sinh học [7][17][26].
Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm bơm model 126 và
tiêm mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. Bước sóng hoạt động là 230 nm.
Cột phân tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5
µm) với cột bảo vệ 100 RP-select B (4 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 µm). Pha
động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong nước (dung dịch A) và dung
dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung dịch B), tốc độ dòng 1 ml/phút.
Chạy pha động chế độ gradient, dung dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15
phút. Sau khi chạy xong, chạy lại điều kiện ban đầu trong 5 phút trước khi
chuyển sang chạy mẫu mới. Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp trong máu
và nước tiểu lần lượt là 63 và 32 µg/l.
Paixão P. [26] định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được
làm đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn. Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu
model 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS. Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar
C18 (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn
được rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm.
Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong
900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile
nồng độ 10% (v/v). Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút.
Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong
huyết tương và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối

Vũ Anh Phương

20

Trường ĐHKH Tự nhiên


với huyết tương, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1%
đối với huyết tương, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần
lượt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng
phương pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm
mẫu (20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK
C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung
dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và
sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5
ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn
với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4
ml/phút. Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể
nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng
detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là
50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.
Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
cặp ion đã được Brunetto M.R. thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2
bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model
64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100
hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy các
hạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18
(25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột
phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2
nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bước sóng 258 nm với
flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu.

Các pha động:

Vũ Anh Phương

21

Trường ĐHKH Tự nhiên


-

Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM
và acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc
màng 0,45 µm. Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanol

-

nồng độ 3% (v/v).
Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mM
trong acid orthophosphoric 0,05 M. Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA.

Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu
âm trước khi sử dụng. Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền
(Noise) với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9].
Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
để xác định PQ trong huyết thanh người. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết
thanh đã được kết tủa protein lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile và
dichlormethane, thu được 50 ml dung dịch. Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung
dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh
pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256
nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 40 mg/l (r = 0,9999). Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lệch chuẩn (RSD)
của các mẫu chứng nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%,
độ lệch chuẩn giữa các lô 0,705% - 2,796%, và độ thu hồi của phương pháp xử lý
mẫu 96,79 % - 100,07%, và độ thu hồi phương pháp là 91,66% - 108,49%. Phương
pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thể
được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
* Ngoài ra, một vài phương pháp khác cũng đã được nghiên cứu để định
lượng PQ trong máu như: miễn dịch phóng xạ [14], điện di mao quản [38]…
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định
lượng đó là phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh
học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để
thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41].

Vũ Anh Phương

22

Trường ĐHKH Tự nhiên


Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử
[20]. Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằng NaOH. Cột được
hoạt hóa bằng 5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột.
3 ml nước cất được bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu.
Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho qua
cột để rửa giải PQ & DQ. Với dịch thu được thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M.
Mẫu này được mang đi đo quang [20].
Chang-bin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 ml
methanol và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa
với 2 ml nước khử khoáng. Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải
được bay hơi ở nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl
methanol và bơm 1 µl vào hệ thống GC-MS.
Zhaohong Wang [41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH
7) và dung dịch chuẩn nội 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột
Waters Oasis WCX 3 ml được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử
khoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7). Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột
với 3 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml nước khử khoáng và 3 ml methanol.
Sấy khô chân không cột trong 10 phút. Chất phân tích được rửa giải bằng 2 ml dung
dịch acid formic 2% trong acetonitrile 80%. Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khí
nitrogen ở 45oC. Hòa tan cắn bằng 50 μl pha động (dung dịch acetonitrile và
ammonium formate 250 mM tỉ lệ 1:1).
Proenca P [28] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml máu hoặc 1 ml nước tiểu thêm
50 µl chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile. Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong
10 phút. Cột chiết pha rắn (Oasis, 3 cc) được rửa với lần lượt 1 ml methanol và 1 ml
nước khử khoáng. Đưa mẫu qua cột chiết pha rắn. Rửa cột với 1 ml đệm phosphate
pH 7,1 ml nước khử khoáng và 1 ml methanol. Sau khi làm khô 10 phút trong chân
không, rửa giải cột với 1,5 ml acetonitrile/water/TFA (84:14:2, v/v/v). Dịch rửa giải
được bay hơi đến cắn dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC. Cắn được hòa tan trong 100 µl
methanol và bơm 10 µl vào hệ thống LC-ESI-MS.

Vũ Anh Phương

23

Trường ĐHKH Tự nhiên


Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26].
Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein
trong mẫu huyết tương [7][17][24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy có
thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị xét nghiệm.
Phương pháp này được Rai M.K. và cộng sự áp dụng để định lượng PQ trong
máu, nước tiểu và sữa mẹ. Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acid
trichloracetic 1% vào để loại sự ảnh hưởng của các ion kim loại và loại protein. Ly
tâm 1850 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong ở trên đem đo quang [30].
Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml
được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1). Lắc xoáy, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24].
Arys K [7] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn
nội và thêm nước vừa đủ 4 ml. Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làm
sạch đầu tiên của các mẫu máu, gan, thận. Thêm 1,5 ml dung dịch acid
trichloroacetic 25%, lắc 10 phút, ly tâm 400 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi chuyển
dịch trong ở trên sang ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dưới được hòa tan lại
bằng 2,5 ml dung dịch

acid trichloroacetic 5%, lắc 10 phút, ly tâm 1100

vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong lại, chuyển sang ống silan hóa. Tuy
nhiên ở một số trường hợp đã được chứng minh cần thêm bước ly tâm nữa (2200
vòng/phút trong 10 phút) để thu được phần dịch sạch hoàn toàn. Đối với nước
tiểu và dịch dạ dày, bước loại protein có thể bỏ qua và làm ngay bước tiếp theo
là khử PQ bằng natri borohydride. Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH lớn hơn
10 bằng 1 ml NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ dày) hoặc 1 ml NaOH 5M
(đối với các mẫu khác). Sau đó, thêm 250 mg bột NaBH 4 và lắc ở 60oC trong 25
phút. Sau khi làm mát ở nhiệt độ phòng, chiết dung dịch với 8 m l diethyl ether
bằng máy trong 15 phút. Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển
lớp hữu cơ phía trên sang ống silan hóa hình nón. Bay hơi dịch chiết đến khô
bằng dòng khí nitrogen. Cắn được hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A :
dung dịch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µl vào hệ thống HPLC.

Vũ Anh Phương

24

Trường ĐHKH Tự nhiên


Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17] chỉ cần lấy 200 µl huyết
thanh trộn với 20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc
xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi
ở trên bơm vào máy.
Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong
mẫu huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC. Trong đó mẫu
huyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ
HPLC cột tách C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm
photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH).

Vũ Anh Phương

25

Trường ĐHKH Tự nhiên


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×