Tải bản đầy đủ

NGHIÊN cứu KHẢ NĂNG ức CHẾ QUÁ TRÌNH SINH ACID của STREPTOCOCCUS MUTANS

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC HẢI PHÒNG

ĐỖ THỊ HƢNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH
SINH ACID CỦA STREPTOCOCCUS MUTANS
TỪ DỊCH CHIẾT LÁ SIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
KHÓA 2012 - 2016

HẢI PHÒNG – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC HẢI PHÒNG

ĐỖ THỊ HƢNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH

SINH ACID CỦA STREPTOCOCCUS MUTANS
TỪ DỊCH CHIẾT LÁ SIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
KHÓA 2012 - 2016

Hƣớng dẫn khoa học: Ts. Bạch Thị Nhƣ Quỳnh

HẢI PHÒNG – 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả, số liệu được trình bày trong khóa luận
tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực, khách quan, không sao chép từ bất cứ
một nghiên cứu nào khác.
Hải Phòng, ngày 30 tháng 5 năm 2016
Người viết

Đỗ Thị Hưng


LỜI CẢM ƠN
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Ban giám
hiệu, Phòng đào tạo đại học, các bộ môn của trường Đại học Y Dược Hải
Phòng đã dìu dắt, dạy dỗ em trong 4 năm học qua.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô khoa Kỹ thuật y học đã tận tình
dạy dỗ em suốt 4 năm học tập. Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành
đến các thầy cô Bộ môn Sinh học phân tử đã đồng hành cùng em trong quá
trình thực hiện khóa luận.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Bạch Thị Như Quỳnh người đã hướng dẫn em nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Bước đầu
làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, cô đã dạy cho em từ những
điều cơ bản nhất. Ở cô em học tập được tính chủ động trong công việc và
lòng nhiệt huyết với nghề. Sự nhiệt tình giúp đỡ của cô khiến em thêm động
lực vượt qua những khó khăn để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.
Em xin gửi lời cảm ơn đến phòng Hóa sinh thực vật - Viện công nghệ
sinh học – Viện hàn lâm và khoa học công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo
điều kiện cho em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Con muốn thể hiện lòng biết ơn tới công lao sinh thành, nuôi nấng của
cha mẹ. Cảm ơn gia đình, những người thân yêu đã luôn sát cánh bên con,
quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập.

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới những người bạn đã giúp đỡ, động
viên tôi trong học tập và trong cuộc sống.
Hải Phòng, ngày 30 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Đỗ Thị Hưng


CHỮ VIẾT TẮT
ADS

Arginine deiminase

CC

Column chromatography

DNA

Deoxyribonucleic acid

EPS

Extracellular polysacharides

EtOAc

Ethyl acetate

FDI

Federal Dental International

GTF

Glucosyltransferase

Gtf

Glucosyltransferase

HIV

Human immunodeficiency virus

MeOH

Methanol

OD

Optical Density

PCR

Polymerase chain reaction

PTS

Phosphotransferase system

TLC

Thin layer chromatography

TSA

Tryptic soy agar

UV

Ultra Violet


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococcus mutans ..................................... 3
1.1.1 Tình hình sâu răng trên thế giới và Việt Nam.......................................... 3
1.1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây sâu răng .................... 6
1.2. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng............................................................. 8
1.2.1. Sử dụng chất kháng khuẩn ...................................................................... 9
1.2.2. Sử dụng chất thay thế đường................................................................. 11
1.2.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy) ........................................... 12
1.2.4. Vacxin ................................................................................................... 13
1.3. Cây sim..................................................................................................... 14
1.3.1. Giới thiệu v cây Sim Rhodomytus tomentosa 3 ............................ 14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .............................................. 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 16
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................... 16
2.1.3. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.4. Trang thiết bị chính ............................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu tế bào ..................................................... 17
2.2.1.1. Đo sự phát triển của tế bào vi khuẩn................................................. 17
2.2.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào pH drop ........................................ 17
2.2.2. Các phương pháp tách chiết phân đoạn thực vật .................................. 18
2.2.2.1. Tách chiết phân đoạn trong các dung môi hữu cơ khác nhau ............ 18
2.2.2.2. Sắc ký lớp mỏng................................................................................. 19
2.2.2.3. Sắc ký cột nhanh hay sắc ký cột chân không QCC VCC ............... 20


2.2.2.4. Sắc ký cột silica gel ............................................................................ 20
2.2.3. Xử lý số liệu .......................................................................................... 20
Chƣơng 3: KẾT QUẢ ................................................................................... 21
3.1. Khả năng ức chế quá trình sinh acid trên S. Mutans của dịch chiết lá sim
......................................................................................................................... 21
3.2. Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu răng ..................... 22
3.2.1. Tách chiết phân đoạn trong các dung môi hữu cơ khác nhau ............... 22
3.2.3. Tinh sạch phân đoạn quan tâm sử dụng cột sắc ký silica gel ............... 26
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 31
4.1. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn S. Mutans thông qua ức chế sự sinh
acid ức chế sự giảm ph môi trường ............................................................. 32
4.2. Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu răng .................... 34
4.2.1. Tách chiết phân đoạn dịch chiết lá sim trong các dung môi hữu cơ khác
nhau ................................................................................................................. 34
4.2.2. Tinh sạch phân đoạn quan tâm bằng cột sắc ký chân không QCC và
cột sắc ký silica gel ......................................................................................... 35
KẾT LUẬN .................................................................................................... 39
KHUYẾN NGHỊ........................................................................................... 40


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sự thay đổi v số răng sâu của một người Việt Nam theo độ tuổi .. 4
Hình 1.2. Cấu trúc răng và nguyên nhân dẫn đến sâu răng .............................. 5
Hình 1.3. Ảnh hiển vi điện tử vi khuẩn Streptococcus mutans ........................ 7
Hình 1.4. Cây sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk) ........................ 14
Hình 2.1.Máy đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức......................................... 18
Hình 3.1. Khả năng ức chế sự sinh acid của tế bào S. mutans trên biofilm của
các dịch chiết lá sim. ....................................................................................... 21
Hình 3.2. Sơ đ tách chiết phân đoạn dịch chiết lá sim .................................. 22
Hình 3.3. Thành ph n các chất trong dịch chiết các phân đoạn hexane, ethyl
acetate và methanol của lá sim ........................................................................ 22
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết lá sim lên sự sinh acid của
vi khuẩn S. mutans. ......................................................................................... 23
Hình 3.5. Sơ đ tinh sạch phân đoạn quan tâm trên cột sắc ký chân không ... 24
Hình 3.6. Cột sắc ký QCC phân đoạn lá sim trong EtO c............................. 25
Hình 3.7. Cột sắc ký silica gel phân đoạn lá sim sau khi qua cột QCC .......... 27
Hình 3.8. Sơ đ phân tách phân đoạn chiết có hoạt tính quan tâm sau khi qua
cột sắc ký silica gel ......................................................................................... 28
Hình 3.9. Ảnh hưởng của các phân đoạn tinh sạch Sa, Sb và Sc lên sự acid
của vi khuẩn S. mutans. ................................................................................... 29
Hình 3.10. Sắc ký đ phân đoạn Sb và Sc của cột sắc ký silica gel sử dụng hệ
dung môi hexane : acetone 5 : 2 .................................................................. 30
Hình 4.1. Các phân đoạn phân tách sau sắc ký chân không QCC của dịch
chiết lá sim trong EtO c. ................................................................................ 36
Hình 4.2. Cột sắc ký silica gel phân đoạn lá sim sau khi qua cột QCC .......... 36


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sự sinh acid của 12 phân đoạn
phân tách ......................................................................................................... 26
Bảng 4.1. So sánh tác dụng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh acid của
vi khuẩn S. mutans .......................................................................................... 33
Bảng 4.2. Tác dụng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh acid của S.
mutans GS-5. ................................................................................................... 34


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâu răng là một trong những bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay
và đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển. Tổ chức
Y tế thế giới đ cảnh báo v mức độ phổ biến của bệnh này chỉ sau các bệnh
tim mạch và ung thư 10 . Theo số liệu mới nhất (09/2012) của Hội Răng
Hàm Mặt Việt Nam, thực tế có tới hơn 90

dân số Việt Nam đang đối mặt

với các vấn đ v răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất
răng 11 . Đây là tỷ lệ thuộc hàng cao nhất thế giới. Ngay cả ở những nước
phát triển như Hoa Kỳ, tỷ lệ sâu răng hiện nay vẫn còn tới 84% ở lứa tuổi
thanh niên. Trong những năm qua, chi phí cho việc chăm sóc, sửa chữa răng
tại Việt Nam đ lên tới nhi u tỷ đ ng. Bệnh sâu răng là do vi khuẩn trên mảng
bám răng sử dụng carbonhydrate để lên men tạo acid, trong đó chủ yếu là
lactic. Môi trường acid s phá vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường miệng.
Khi lượng acid đủ lớn s hòa tan các chất khoáng có trong men răng dẫn đến
làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng 29 .
Streptococcus mutans được xác định là tác nhân gây sâu răng chính ở
người. S. mutans được phát hiện ở tất cả các mảng bám răng, có số lượng rất
cao ở những v ng răng sâu và là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến bệnh sâu răng
29 . Do đó, S. mutans được sử dụng như là đối tượng điển hình cho các
nghiên cứu v sâu răng.
Hàng loạt các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn bệnh sâu răng đ được
nghiên cứu và ứng dụng như: sử dụng các chất kháng khuẩn, sử dụng chất
thay thế đường; sử dụng liệu pháp thay thế; sử dụng vaccine. Trong đó, biện
pháp sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát sâu răng vẫn tỏ ra hữu hiệu hơn
cả.
Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các chất kháng khuẩn có bản chất hoá
học thường gây ra những phản ứng phụ không mong muốn như làm đổi màu


2

răng, tạo chủng kháng chất kháng khuẩn ...như trong trường hợp của fluor hay
chlorhexidine 33 . Vì thế, việc tìm kiếm và sử dụng những chất kháng khuẩn
tự nhiên, đặc biệt là các chất có ngu n gốc thực vật đang rất được quan tâm
và chúng có thể là những chất thay thế nhi u triển vọng [6], [7], [28].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu v chất kháng khuẩn sâu răng tự nhiên c ng đ
được quan tâm. Nghiên cứu của Nguy n Quang Huy và cộng sự 5 cho thấy
dịch chiết từ vỏ Sao đen Hopea odorata Roxb , lá Sắn thuy n (Syzygium
polyanthum Wight Walp đ u có tác dụng ức chế quá trình sinh acid, diệt
khuẩn hay kìm h m hoạt độ các enzyme F-ATPase, PTS của chủng S. mutans
GS-5 và S. mutans H2 phân lập từ người Việt Nam [5].
Trong những năm g n đây, nhóm nghiên cứu của Voravuthikunchai và
cộng sự 30 , 31 , 32 đ phát hiện thấy dịch chiết lá sim Rhodomyrtus
tomentosa

iton Hassk có khả năng ức chế sự sinh trưởng của hàng loạt

các vi khuẩn trong đó có S. mutans. Những số liệu nghiên cứu ban đ u này
gợi ý rằng dịch chiết lá sim có chứa chất kháng khuẩn sâu răng mới và triển
vọng.
Xuất phát từ những t n tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, c ng như để
góp ph n khai thác ngu n nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta, chúng
tôi thực hiện đ tài: “Nghiên cứu khả năng ức chế quá trình sinh acid của
vi khuẩn streptococcus mutans từ dịch chiết lá sim (Rhodomyrtus
tomentosa (Aiton) Hassk”. với 2 mục tiêu chính:
- Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn S. mutans thông qua khả năng ức chế sự
sinh axit của dịch chiết lá sim.
- Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu răng.


3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococcus mutans
1.1.1 Tình hình sâu răng trên thế giới và Việt Nam
Sâu răng là một bệnh gây phá hủy cấu trúc răng. Nếu không được chữa
trị kịp thời s dẫn đến đau răng, mất răng, nhi m tr ng và các bệnh v răng
miệng nguy hiểm khác.
Bệnh sâu răng có lịch sử phát triển từ rất lâu, những bằng chứng khảo cổ học
cho thấy bệnh này bắt đ u xuất hiện từ thời kỳ trung cổ. Sâu răng phát triển
c ng với sự thay đổi v đi u kiện sinh hoạt và chế độ ăn uống của con người
và ngày nay, đ trở thành một trong những bệnh phổ biến nhất trên toàn thế
giới [4]. Theo thống kê, 90

trẻ em trên toàn thế giới và h u hết những người

trưởng thành đ u đ từng có những vấn đ v răng miệng. Sâu răng phổ biến
nhất ở những nước châu Á và châu Mỹ La Tinh, các nước châu Phi là nơi có
tỷ lệ người mắc bệnh này thấp nhất [5].
Ở Hoa Kỳ, sâu răng là một bệnh kinh niên và thường gặp nhất ở trẻ em.
Mức độ phổ biến của bệnh cao gấp 5 l n so với bệnh hen suy n, vốn c ng là
một bệnh được cả thế giới rất quan tâm bởi tính phổ biến và nguy hiểm của
nó. G n 20% trẻ em từ 2 đến 4 tuổi có xuất hiện những lỗ hổng ở chân răng
6 . Đây c ng là nguyên nhân cơ bản gây nên sự mất răng ở trẻ em. Không
chỉ ở trẻ em, sâu răng còn là một bệnh phổ biến ở tất cả các lứa tuổi. Theo
thống kê của tạp chí sức khỏe răng miệng WebMD (2008) [7, 8], 80% thanh
thiếu niên ở độ tuổi 17 đ xuất hiện những lỗ nhỏ li ti trên b mặt răng.
Khoảng 2/3 những người trưởng thành từ 35-44 tuổi mất ít nhất một răng và
có nhi u lỗ hổng trên răng. Ở những người trên 75 tuổi, có 50
một hoặc nhi u răng bị sâu ở chân răng.

số người có


4

Việt Nam được xếp vào nhóm các nước có tỷ lệ trẻ em mắc các bệnh v
răng miệng cao nhất thế giới. Kết quả đi u tra sức khỏe răng miệng toàn quốc
[7] do Viện Răng Hàm Mặt Hà Nội và Đại học delaide Ôxtrâylia tiến hành
g n đây đ cho thấy trên 90

dân số Việt Nam bị sâu răng và mắc các bệnh

v răng, đặc biệt tập trung ở lứa tuổi từ 35-44 (Hình 1). Tỷ lệ sâu răng sữa ở
trẻ em từ 6-8 tuổi là 85 , trung bình mỗi trẻ có 6 chiếc răng sâu. Tỷ lệ này
tăng d n theo lứa tuổi, cụ thể là cứ 3 trẻ từ 15-17 tuổi thì có 2 trẻ bị sâu răng
vĩnh vi n. Đặc biệt, từ 45 tuổi trở đi có trên 90

người bị sâu răng và trung

bình cứ một người có trên 8 chiếc răng bị sâu.
%

Tuổi
Hình 1.1. Sự thay đổi về số răng sâu của một ngƣời Việt Nam theo độ
tuổi
Đứng trước tình hình đó, ngay từ năm 1908, liên đoàn Nha khoa Quốc
tế FDI đ rất quan tâm đến vấn đ dự phòng sâu răng, tuyên bố ủng hộ
nguyên tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh, và từ đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm
các biện pháp để phòng chống căn bệnh này. Các khuyến cáo v dự phòng sâu
răng c ng liên tục được đưa ra nhằm duy trì thành tựu ở các nước công
nghiệp phát triển và ngăn chặn sự gia tăng bệnh răng miệng ở các nước đang
phát triển.


5

1.1.2 Cơ chế gây sâu răng
Bệnh sâu răng là tổn thương tiêu huỷ tổ chức cứng của răng bao g m
men răng và ngà răng là tổ chức không có tế bào , tạo nên lỗ hổng trên thân
răng. Sâu răng có thể ở b mặt thân răng hoặc cổ răng, tổn thương sâu trên
thân răng bắt đ u từ men răng, còn tổn thương trên cổ răng bắt đ u từ men
răng hoặc ngà cổ răng. Bệnh không tự khỏi. Sâu răng là bệnh rất phổ biến, có
thể gặp ở mọi lứa tuổi.

Hình 1.2. Cấu trúc răng và nguyên nhân dẫn đến sâu răng
Quá trình này được bắt đ u từ sự hình thành mảng bám răng dental
plaque) ở cổ răng và k răng, là một lưới polymer sinh học bao g m protein
của nước bọt, đường, thức ăn thừa và nhi u loài vi khuẩn khác nhau 9 . Vi
khuẩn dính bám trên b mặt răng tạo thành nhi u lớp, c ng với thức ăn thừa
chúng tạo ra môi trường cho các vi sinh vật kỵ khí sinh sống 9 . Các vi
khuẩn này chuyển hóa đường có trong thức ăn được giữ lại trong xoang
miệng tạo thành các acid hữu cơ và chủ yếu là acid lactic. cid tạo thành làm
giảm pH trong mảng bám răng, gây nên sự phân hủy khoáng ở men răng.
Chất khoáng bị phân hủy khuếch tán ra khỏi răng, cuối c ng hình thành các lỗ


6

hổng trên răng. Tuy nhiên, các lỗ hổng này có thể được lấp đ y trở lại bởi quá
trình “tái khoáng hóa” remineralization . Đó là sự khuếch tán trở lại vào răng
của canxi, photphat và floride, tạo thành lớp vỏ bọc mới phủ lên ph n tinh thể
còn lại của răng trong v ng thương tổn. Lớp tinh thể khoáng mới tạo thành có
khả năng chống chịu tốt hơn trong môi trường acid 11 . Quá trình phân hủy
khoáng và tái tạo khoáng di n ra song song trong một thời gian dài. Tuy
nhiên, nếu để quá trình phân hủy khoáng di n ra nhanh hơn quá trình tái tạo
khoáng s làm hỏng men răng và dẫn đến bệnh sâu răng.
Như vậy, sâu răng là kết quả của một quá trình tương tác giữa nhi u
yếu tố trong đó, vi khuẩn được coi là tác nhân chủ đạo tạo nên sự vận động
của quá trình này. Các vi khuẩn sinh acid trong mảng bám răng đ ng thời là
các vi khuẩn chịu acid, đi u này có nghĩa là chúng có thể t n tại và sinh
trưởng tốt hơn trong môi trường có pH thấp. Trong các mảng bám răng thông
thường, vi khuẩn sinh acid chỉ chiếm 1%, thậm chí ít hơn trong tổng số qu n
thể vi sinh vật. Khi bệnh bắt đ u phát triển, môi trường trong mảng bám răng
trở nên acid hơn và các vi khuẩn ưa acid s sống sót và sinh sản, lấn át các vi
khuẩn lành tính khác. Sự gia tăng nhanh chóng v số lượng các vi khuẩn sinh
acid s tạo nên một lượng lớn các acid hữu cơ, làm hòa tan nhanh chóng các
chất khoáng của men răng 12 .

cid do vi khuẩn sinh ra còn tấn công cả

ph n lợi gây nên một số bệnh như viêm nướu răng gingivitis hay viêm
quanh răng periodontal diseases .
1.1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây sâu răng
Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành acid lactic t n tại
trong khoang miệng được xem là nguyên nhân gây sâu răng. Chúng chủ yếu
thuộc 3 nhóm: Streptococcus, Lactobacillus và Actinomyces. Trong đó,
S.mutans được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi khuẩn này


7

luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có số lượng
rất cao ở những v ng răng bị sâu.
Vi khuẩn Streptococcus mutans
S. mutans l n đ u tiên được Clark mô tả vào năm 1924 sau khi phân lập
được nó từ v ng răng bị tổn thương Hình 1.3 . Tuy vậy, phải đến thập niên
60, vi khuẩn này mới được chú ý đến nhi u khi các nhà khoa học bắt đ u tập
trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm.

Hình 1.3. Ảnh hiển vi điện tử vi khuẩn Streptococcus mutans
(độ phóng đại 6500x)
S. mutans là vi khuẩn Gram (+), kỵ khí, t n tại ở dạng liên c u khuẩn.
Chính nhờ đặc điểm hô hấp kỵ khí nên quá trình chuyển hóa các loại đường
s đi theo con đường yếm khí tạo ra sản phẩm là acid lactic. Nhi u nghiên cứu
khác nhau đ chỉ ra đây chính là nguyên nhân hàng đ u dẫn đến bệnh sâu
răng.
Ngoài ra, S. mutans còn có khả năng t n tại trong đi u kiện pH rất thấp nhờ
các cơ chế thích nghi khác nhau:
-

Hoạt động của các bơm proton: đặc biệt là bơm F-ATPase nhằm bơm

proton ra ngoài duy trì pH nội sinh pHi luôn cao hơn so với pH môi trường.
F-ATPase của S.mutans được phát hiện là có sự thay đổi trong cấu trúc để
thích nghi hoạt động tốt ở pH thấp Sturr và Marquis, 1992 .


8

-

Các loài vi khuẩn xoang miệng Streptococcus có khả năng sinh NH3

thông qua các enzyme urease hay arginine deiminase

DS . Các enzyme này

có thể chuyển hóa l n lượt urea và arginine thành CO2 và NH3. Các phân tử
NH3 tạo thành s kết hợp với các proton có trong tế bào chất hay được vận
chuyển qua màng tế bào và kết hợp với các proton ở môi trường bên ngoài
hình thành NH4+, nhờ đó làm tăng pH của môi trường nội và ngoại bào 13 .
-

S. mutans có thể sản xuất các polysarcharide ngoại bào extracellular

polysacharides có tính chất keo dính, cho phép các vi khuẩn gắn kết được với
nhau để hình thành các liên kết bắc c u và phát triển mảng bám răng. Đ ng
thời, vi khuẩn này c ng có thể sản xuất các polysarcharide nội bào
(intracellular polysacharides). Hợp chất này được huy động để lên men tạo
acid lactic khi không có đường từ bên ngoài đưa vào 14, 15 .
-

Ngoài ra, S. mutans còn có một số cơ chế thích nghi acid khác như:

tăng cường tổng hợp các enzym sữa chữa DNA bị tổn thương do acid Haln
và tập thể, 1999 hay thay đổi thành ph n lipid của màng tế bào để làm giảm
khả năng thẩm thấu proton Quivey và tập thể, 2000).
Chính nhờ những đặc điểm này mà S. mutans có khả năng t n tại, phát triển
và sinh acid mạnh khi pH môi trường giảm xuống dưới 4 và trở thành nguyên
nhân chính dẫn đến bệnh sâu răng ở người.
1.2. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng
Việc loại bỏ bằng cơ học có thể ngăn chặn hoàn toàn sự tạo mảng bám
răng 26 . Đi u này s có hiệu quả hơn nếu kết hợp với việc giảm bớt thói
quen ăn các sản phẩm có đường. Tuy vậy, việc thay đổi thói quen ăn uống và
duy trì vệ sinh răng miệng tốt rất khó thực hiện. Vì vậy hàng loạt các biện
pháp khác nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đ được nghiên cứu và ứng dụng.


9

1.2.1. Sử dụng chất kháng khuẩn
Sử dụng chất kháng khuẩn để chống lại các vi khuẩn gây sâu răng được
coi là một biện pháp hiệu quả và có nhi u triển vọng. Trong những năm qua,
nhi u chất kháng khuẩn như bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh d u
v.v... đ được sử dụng một cách hiệu quả trong các sản phẩm nước súc miệng
để kiểm soát sự tạo thành của mảng bám răng 26 . Các chất này, khi hấp phụ
vào mảng bám răng, s xâm nhập d n vào bên trong, tiếp xúc với vi khuẩn
gây bệnh, ức chế quá trình sinh trưởng, trao đổi chất và làm giảm khả năng
gắn kết của chúng với b mặt răng. Do đó, chúng ngăn được ngừa sự tạo
mảng bám răng, hạn chế sự liên kết bắc c u và xâm nhập của các vi khuẩn
khác.
Các chất kháng khuẩn thường có đặc tính ngăn ngừa sự gắn kết, sự xâm
nhi m của vi khuẩn hay tác động lên các quá trình trao đổi chất của chúng.
Các chất này đ ng thời c ng không tác động lớn đến các quá trình sinh học,
không làm tổn thương lớp màng nhày ở miệng và ít độc. Vì thế, có thể nói sử
dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu
răng.
Trong số các chất kháng khuẩn đ được sử dụng, fluor tỏ ra là một chất có
hiệu quả cao và đ được sử dụng một cách rộng r i. Đây là một chất có cơ chế
tác động hai mặt. Một mặt chất này có tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng
mạnh, mặt khác nó lại giúp tái tạo lại men răng và vì vậy, có tác dụng làm b n
răng 26 . Chlohexidine gluconate c ng là một chất kháng khuẩn đ được sử
dụng khá phổ biến để đi u trị các trường hợp bị sâu răng nghiêm trọng hoặc
khi đ sử dụng các chất kháng khuẩn tự nhiên mà không có kết quả.
Chlohexidine gluconate có tác dụng ức chế hiệu quả sự phát triển của vi
khuẩn S. mutans trong mảng bám răng. Tuy nhiên, chất này lại dường như
không có tác dụng hoặc tác dụng rất yếu đối với các loài Lactobacillus [9].


10

Các chất kháng khuẩn như flour và chlohexidine tuy có hiệu quả kháng khuẩn
cao song lại gây nên các phản ứng phụ. Ví dụ: chlohexidine làm đổi màu
răng, gây dị ứng lớp màng nh y ở miệng, trong khi đó flour lại gây ra hiện
tượng bệnh nhi m flour (fluorisis) khi sử dụng lâu dài các sản phẩm vệ sinh
răng miệng có chứa chất này 19 . Đi u này đ khiến các nhà khoa học phải
tiếp tục tìm kiếm các hợp chất mới để thay thế các hợp chất truy n thống hay
sử dụng chúng với n ng độ thấp hơn ở dạng tổ hợp với nhi u chất kháng
khuẩn khác để làm giảm các tác dụng phụ mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng
cao. Hàng loạt các chất kháng khuẩn mới, bao g m cả các chất tổng hợp và tự
nhiên, đ được nghiên cứu và thử nghiệm như các acid yếu, acid béo,
trichlosan, muối kim loại và cả những chất có ngu n gốc từ thực vật [6], [7],
[8], [15], [21]. Việc sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát mảng bám răng
đ được thực hiện trong nhi u năm qua, chủ yếu là những chất chống tạo
mảng bám 26 . Sử dụng nước súc miệng là cách rất có hiệu quả để đưa các
chất kháng khuẩn như là các bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh d u...
tiếp xúc với các vi khuẩn trong mảng bám răng 26 . Khi hấp phụ vào mảng
bám răng, các chất này s xâm nhập d n vào bên trong mảng bám, ức chế sự
phát triển hoặc quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, làm giảm sự gắn kết của
vi khuẩn với b mặt răng vì vậy ngăn ngừa sự tạo mảng bám, hạn chế quá
trình tích tụ hay liên kết bắc c u vì vậy ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn.
Các đặc tính quan trọng nhất của chất kháng khuẩn là ngăn ngừa sự gắn
kết, sự xâm nhi m của vi khuẩn và tác động đến quá trình trao đổi chất của
chúng. Các chất kháng khuẩn thường không tác động lớn đến các quá trình
sinh học, không làm tổn thương lớp màng nhày ở miệng và ít độc. Vì thế có
thể nói sử dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để
kiểm soát sâu răng. Có 6 nhóm chất kháng khuẩn chính là:


11

-

Cation: các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng

của màng, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn.
-

Anion: các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng của

màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong quá trình đường phân và sử
dụng glucose.
-

Các tác nhân không phải ion: các ion không tích điện có khả năng ức

chế các enzyme trên màng tế bào, dẫn đến làm giảm sử dụng glucose.
-

Enzyme: một số enzyme có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi

khuẩn hay làm tăng hoạt tính lysozyme.
-

Các đường đa (polyol): có khả năng làm thay đổi quá trình đường phân

hoá của vi khuẩn.
-

Các chất khác: bao g m các dịch chiết thực vật, các tác nhân tạo phức

càng cua, các acid béo, các tác nhân gây tổn thương oxi hoá oxidativedamaging agents) [28], [26]. Cơ chế tác động của các chất này rất phức tạp và
vẫn còn đang được nghiên cứu. Trong các chất này thì các dịch chiết thực vật
là đối tượng ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học và
doanh nghiệp.
1.2.2. Sử dụng chất thay thế đƣờng
Do thói quen sử dụng đường trong cuộc sống hàng ngày nên vi khuẩn
trên mảng bám răng có đi u kiện lên men, sinh acid và kết quả là làm mòn
men răng, gây sâu răng. Vì vậy, người ta đ nghĩ đến việc sử dụng những chất
làm ngọt mà vi khuẩn không thể tiêu thụ được để thay thế đường. Những chất
này không gây ra sự sinh acid nên không gây sâu răng.
Các loại đường nhân tạo này có khả năng kháng khuẩn nhất định thông
qua việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Các đường như manitol, sorbitol
không ngọt như sucrose nên được d ng trong công nghiệp chế biến thực
phẩm. Các đường này không bị vi khuẩn tiêu thụ. Tuy nhiên, việc sử dụng


12

thường xuyên các loại đường này s dẫn đến sự hình thành các chủng vi
khuẩn có khả năng đ ng hoá chúng, đặc biệt là các loài S. mutans. Cơ chế tác
động của xylitol lên vi khuẩn S. mutans c ng đ được tìm hiểu. Khi xylitol đi
vào tế bào S. mutans s can thiệp vào quá trình lên men đường của vi khuẩn
bằng cách tiêu thụ PEP và N D+ trong quá trình phosphoryl hoá, đ ng thời
ức chế cạnh tranh với enzyme phosphofructokinase nhờ chất trao đổi trung
gian xylitol-5-phosphate 26 . Chính đi u này làm giảm quá trình tạo acid của
tế bào, giảm mật độ S. mutans nên giảm sâu răng ở những người sử dụng
xylitol. Nhìn chung, việc sử dụng các chất thay thế đường có tác dụng khá
hiệu quả vì chúng làm mất đi hay hạn chế tối đa cơ hội phát triển của các vi
khuẩn có khả năng sinh và chịu acid.
1.2.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy)
Việc sử dụng các vi khuẩn đối kháng để kiểm soát sâu răng đ được sử
dụng từ nhi u năm nay 26 . Lợi ích của liệu pháp này là có tác dụng bảo vệ
răng lâu dài và ít tốn kém. Tuy nhiên, liệu pháp này chưa được thử nghiệm
nhi u ở người vì tính an toàn của các chủng vi khuẩn đối với người sử dụng
chưa được nghiên cứu kỹ. Liệu pháp này có hai hướng chính là:
-

Hướng tiền nhiễm: Cấy vào mảng bám răng những vi khuẩn có lợi hay

không gây hại trước khi các chủng không mong muốn xâm nhập và định cư
trên mảng bám. Những vi khuẩn ti n nhi m s loại bỏ những tác nhân gây
bệnh không mong muốn. Các chủng đột biến của Streptococci đ bị làm mất
khả năng tạo glucosyltransferase (Gtf), hoặc polysaccharide nội bào, hoặc
không có lactate dehydrogenase là những đối tượng thường được sử dụng
trong liệu pháp này.
-

Hướng thay thế các cơ thể tiền nhiễm có mặt trong mảng bám răng:

Cách này có ưu điểm là không phải xử lý loại bỏ những chủng không mong
muốn trước khi gây nhi m mới. Ví dụ S. salivarius thay thế cho S. mutans


13

trên mảng bám răng của chuột đ làm giảm tỉ lệ sâu răng vì nó thay thế chủng
S. mutans có khả năng sinh acid mạnh.
1.2.4. Vacxin
Các nghiên cứu cho thấy có thể tạo được các đáp ứng mi n dịch chống
lại vi khuẩn sâu răng. Vì các đột biến của Streptococci là tác nhân chính gây
sâu răng nên người ta nghĩ đến khả năng tạo ra các vacxin bằng việc sử dụng
chính các vi khuẩn này vacxin hay các phân tử của các vi khuẩn này subunit vacxin để gây mi n dịch 26 . Trên thực tế, hướng nghiên cứu này đ
xuất hiện ở Anh từ hơn 20 năm trước đây. Mặc d đ thu được một số kết quả
khả quan như làm giảm mật độ tế bào Streptococci, giảm tỉ lệ sâu răng, nhưng
lại xuất hiện các phản ứng phụ c ng như xuất hiện các tổn thương mô.
Các nhà nghiên cứu Mỹ lại sử dụng S. sobrinus trên mảng bám răng
chuột để tạo vacxin. Các vacxin sản xuất theo hướng này nhằm mục đích ức
chế enzyme Gtf, nhờ đó làm giảm khả năng tạo mảng bám răng. Hướng
nghiên cứu này tỏ ra rất có hiệu quả ở chuột nhưng lại không có hiệu quả ở
các loài linh trưởng. Vì vậy người ta nghi ngờ khả năng ứng dụng của nó cho
người [26].


14

1.3. Cây sim
1.3.1. Giới thiệu về cây Sim (Rhodomytus tomentosa 3
Cây sim còn có tên là H ng sim,
Đào kim phượng, Dương lê, Co nim
Thái , Mác nim

Tày , Piếu ním

(Dao), Trợ quân lương thuộc họ
Myrtaceae. Đây là cây bụi cao khoảng
1 - 3m, thân non màu vàng nâu, có
nhi u lông mịn, thân già màu nâu đen
có các đường nứt chạy dài, tiết diện
tròn. Lá đơn, mọc đối. Không có lá
kèm. Cụm hoa mọc riêng lẻ hay 2 - 3
hoa ở ngọn cành ngắn. Phiến lá hình

Hình 1.4. Cây sim
(Rhodomyrtus

tomentosa

(Aiton)

Hassk)

xoan, gốc nhọn, đ u
tròn, dài 5 - 7cm, rộng 3-4cm, bìa phiến nguyên hơi cong xuống phía dưới, lá
già màu xanh lục đậm, nhẵn bóng, mặt dưới màu vàng xanh có nhi u lông
mịn, lá non có lông cả hai mặt. Quả mọng hình trứng ngược mang đài t n tại
ở đỉnh, màu xanh sát cuống, phía trên màu đỏ nâu nhi u lông mịn, có m i
thơm, đường kính 1,2 - 1,5 cm, chứa nhi u hạt. Hạt hình thang, màu nâu.
Cây mọc tự nhiên và phổ biến ở v ng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu
Á, bao g m Indonesia, Philipin, Ấn độ, Camphuchia, Lào, Việt Nam và một
số các tỉnh phía nam Trung Quốc. Ở Việt Nam sim là loài cây quen thuộc ở
khắp các v ng trung du và núi thấp. Cây đặc biệt ưa sáng và có khả nặng chịu
hạn tốt, thường mọc dải rác hay tập trung trên các đ i cây bụi hay đ ng cỏ.
Búp và lá sim non d ng để chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ. Lá còn là
thuốc c m máu, chữa vết thương chảy máu. Quả sim chín ăn được, d ng chế
rượu, chữa thiếu máu lúc có mang, suy nhược khi mới ốm dậy, lòi dom,

tai,


15

di tinh, phụ nữ băng huyết. R sim chữa tử cung xuất huyết cơ năng, đau
xương, lưng gối yếu mỏi, viêm thấp khớp.
1.3.2. Thành phần hóa học và dƣợc chất
Các hợp chất thứ cấp từ thực vật là sản phẩm của quá trình trao đổi chất

-

được sinh ra từ thực vật. Tác dụng sinh học của các hợp chất này rất đa dạng
và phong phú: tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng khuẩn, chống viêm và
thậm chí ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, HIV Park và tập thể,
2006)
-

Cây Sim Rhodomyrtus tomentosa) từ lâu đ được xem là cây thảo

dược có lợi ích từ gốc đến ngọn. Lá Sim chứa chất Rhodomyrtone đ được
chứng minh có vai trò như một chất kháng sinh.
-

Theo nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu Sản phẩm tự nhiên, Khoa

Y học truy n thống, Khoa khoa học, Đại học Prince of Songkla, Hat Yai,
Songkhla 90112, Thái Lan 2009 thì lá của cây Sim Rhodomyrtus tomentosa
iton Hassk. được nghiên cứu để chiết xuất tạo ra Rhodomyrtone - chất
kháng và chống nhi m tr ng.
-

Maarten van Dijl, Oliver Kayser:” Phytomedicine” 2009 , tập 16, vấn

đ 6, trang 645 - 651, giới thiệu chất Rhodomyrtone là một thuốc kháng
khuẩn tự nhiên từ cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.)
-

Surasak Limsuwan, Anne Hesseling-Meinders, Supayan Piyawan

Voravuthikunchai, Jan Maarten van Dijl, Oliver Kayse: “Phytomedicine”
(2011), tập 18, vấn đ 11, trang 934 940, giới thiệu tác dụng kháng sinh và
chống nhi m tr ng của Rhodomyrtone từ cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa
(Aiton) Hassk.) trên vi khuẩn Streptococcus pyogenes.


16

Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy:
-

Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS-5 được lấy từ bộ sưu tập

giống của phòng thí nghiệm của GS. Robert E. Marquis, Khoa Vi sinh và
Mi n dịch học, Trường Đại học Rochester, Hoa Kỳ. Chủng S. mutans được
giữ và cấy chuyển hàng tu n trên môi trường tryptic soy agar (TSA) của h ng
Difco (Hoa Kỳ). Tế bào được nuôi cấy tĩnh ở 37oC trong môi trường chứa
tryptone 3%, dịch chiết nấm men 0,5

và glucose 1

TYG .

Nguyên liệu thực vật
-

Lá sim được thu ở Quảng Ninh và được GS.TS. Phan Kế Lộc giúp định

tên khoa học là Rhodomyrtus tomentosa. Nguyên liệu được sấy khô trong tủ
ấm ở 45oC, sau đó được tán thành bột mịn.
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
-

Thời gian nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2016.

-

Địa điểm nghiên cứu: Labo sinh học phân tử Viện Hàn lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam và Labo Sinh học phân tử Trường Đại học Y Dược
Hải Phòng.
2.1.3. Hóa chất
-

Các thành ph n môi trường được sử dụng trong việc nuôi cấy vi sinh

vật bao g m tryptone, dịch chiết nấm men, cao thịt bò, peptone (Difco, Mỹ).
-

Bản silica gel tráng sẵn 60 F254 25, tấm nhôm 20 x 20 cm của h ng

Merk Đức).
-

Silica gel (Grade 7734, 63-200 m 70-230 mesh và Grade 7746,

0.040-0.063 nm, 230-400 mesh mua từ h ng Merck Đức).


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×