Tải bản đầy đủ

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

LÊ LAN PHƢƠNG

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Lê Lan Phƣơng

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH

CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: CH.60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội - 2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, ngƣời thầy
đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học
và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học,
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian
học tập tại Trƣờng.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị học viên và các bạn
sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
luận văn tại Phòng.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm
giúp đỡ của các cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện
K2, Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Luận văn đƣợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số KLEPT-09-02.
Hà Nội, tháng 6 năm 2012
Học viên

Lê Lan Phƣơng


MỤC LỤC
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... a
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................d

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... e
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN ...............................................................3
1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát ...........................................................3
1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan .............................................................4
1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan ..................................................................6
1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan .................................................8
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ ..........................9
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ ................................................................9
1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ .............................10
1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thƣ gan .........................................11
1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ ................................................................13
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ ..........................................................13
1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ ............................................................................13
1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch ...................................14
1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƢ GAN .................15
1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics ...........................15
1.4.2. Hệ protein gan ngƣời...............................................................................16
1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thƣ gan ......................................17
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................24
2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................24
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................24


2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................24
2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................25
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................25
2.2.1. Xử lý mẫu mô gan ...................................................................................25
2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford ....................................27
2.2.3. Điện di hai chiều .....................................................................................27
2.2.4. Western Blot............................................................................................28
2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot ......29
2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều ..............................30
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein ................................................31
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................33
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN ......................................................33
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU ......................34
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều ...................34
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều ...............36
3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS ......41
3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU ...................44
3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp ...........................44
3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều ..............................................................46
3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT ....47
3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis .................................50
3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể ...................52
3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào ..............................................................53
3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất............................................54
3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến ..............55
3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng .....................................56
KẾT LUẬN ...............................................................................................................60


KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................62
PHỤ LỤC .................................................................................................................... i
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thƣ tế bào gan ......................................... i
Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện di
hai chiều ............................................................................................................. ii
Phụ lục 3. Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần
mềm Mascot ...................................................................................................... vi
Phụ lục 4. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC
......................................................................................................................... viii


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
α1AT

Alpha-1-antitrypsin

ABC

Ammonium bicarbonate

AcCN

Acetonitrile

ACTB

Beta-actin

AFP

Alpha fetoprotein

AFB1

Aflatoxin B1

CATD

Cathepsin D

CHAPS

3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid

CHCA

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

cs

Cộng sự

Da

Dalton

DTT

Dithiothreitol

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay
(Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)

GS

Glutamine synthetase

HBV

Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HBsAg

Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm
gan B)

HCC

Hepatocellular carcinoma (Ung thƣ tế bào biểu mô gan)

HCV

Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)

HLPP

Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan ngƣời)

HPT

Haptoglobin

HUPO

Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome ngƣời)

HRP

Horse - radish peroxidase

a


HSP

Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

IAA

Iodoacetamide

IEF

Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện)

IPG

Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định)

LC-MS/MS

Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ)

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
MFAP3

Microfibrillar-associated protein 3

MHC

Mayjor Histocampatibility Complex
(Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu)

MS

Mass spectrometry (Khối phổ)

Mw

Molecular weight (Khối lƣợng phân tử)

PBS

Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate)

PCNA

Proliferating cell nuclear antigen

PDIA1

Protein disulfide-isomerase

PDIA3

Protein disulfide-isomerase A3

PMF

Peptide Mass Fingerprint (Đặc trƣng khối peptide)

PMSF

Phenylmethanesulfonyl fluoride

PVDF

Polyvinylidene fluoride

p53

Cellular tumor antigen p53

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(Điện di trên gel polyacrylamide có SDS)

SEREX

Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries
(Phân tích huyết thanh bằng thƣ viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp)

SODC

Superoxide dismutase [Cu-Zn]

b


SODM

Superoxide dismutase [Mn]

Mn-SOD

Manganese superoxide dismutase

Spot

Điểm protein

ST7L

Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like

TAA

Tumour Associated Antigen
(Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ)

TAP

Transporters of Antigen Peptide
(Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên)

TFA

Trifluoroacetic acid

TNM

Tumor Node Metastasis
(Kích thƣớc khối u - Hạch Lympho - Di căn)

TSA

Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô)

TSTA

Tumour Specific Transplantation Antigen
(Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ)

c


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan ...........................................7
Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) ....................12
Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu.............................................24
Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm ...........28
Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều ..........................................36
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10 ......................39
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7 ..........................39
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ
so với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL ................40
Bảng 9. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô
gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC .............................42
Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan
ung thƣ so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng ..............................................48

d


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan ....................................................3
Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan .........................................5
Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan ................................................................26
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix .30
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và
mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS .............................................33
Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều
...................................................................................................................................35
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều ..................................37
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ so với bản
gel mô bình thƣờng ...................................................................................................37
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thƣ so với
mô gan bình thƣờng của bệnh nhân HCC mã 8935 ..................................................38
Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân spot protein
C-256-B bằng trypsin ................................................................................................41
Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide
và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot ..............................................45
Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1
có độ pha loãng khác nhau ........................................................................................45
Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977 ...........47
Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau ...50
Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I ............................58

e


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

MỞ ĐẦU
Ung thƣ gan hiện là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới và
Việt Nam, đây là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có
xu hƣớng tăng lên. Theo thống kê năm 2008, ƣớc tính trên thế giới có khoảng
748.300 trƣờng hợp mắc ung thƣ gan và 695.900 ca tử vong do ung thƣ gan. Việt
Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thƣ gan cao nhất [18]. Theo
thống kê của bệnh viện K, nƣớc ta có tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát cao do
nhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41]. Do đó, việc nghiên cứu về tác
nhân gây bệnh, cơ chế và phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thƣ gan có vai
trò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thƣ này.
Hiện nay, các phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp
cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhƣ
anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan. Tuy nhiên,
các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện đƣợc bệnh vào giai đoạn
muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thƣ gan [38]. Nhu cầu đặt ra
là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thƣ gan ở
giai đoạn sớm.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm
kiếm các chỉ thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics. Phần lớn các protein có
trong huyết tƣơng đều đƣợc tổng hợp từ gan. Mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan
cũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u. Do đó, các tín hiệu
protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnh
gan, phát triển chẩn đoán phân tử [29]. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh
rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp
ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thƣ đã đƣợc
xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ [27]. Vì thế, các tự kháng thể có thể đƣợc
dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thƣ và dùng trong phân tích proteomics để nhận
dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển

1


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

dạng ác tính của tế bào. Đây là hƣớng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị
sinh học ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan”
nhằm mục đích:
-

Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình

thƣờng của bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di
hai chiều.
- Nhận dạng đƣợc một số protein khác biệt đặc trƣng giữa mô gan ung thƣ so
với mô gan bình thƣờng.
- Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan)
đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan.
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN
Ung thƣ gan là một trong các dạng bệnh lý phổ biến nhất trên thế giới và tỷ
lệ tử vong do ung thƣ gan xếp hàng thứ ba trên tổng số các trƣờng hợp tử vong do
ung thƣ. Tại Mỹ, từ năm 2004 đến 2008, tỷ lệ mắc mới ung thƣ gan mỗi năm tăng
3,6% ở nam giới và 3% ở nữ giới, xu hƣớng này đã tồn tại từ năm 1992. Các nhà
nghiên cứu dự đoán trong năm 2012 sẽ có khoảng 28.720 trƣờng hợp mắc mới ung
thƣ gan, hơn 80% trong số đó là ung thƣ tế bào biểu mô gan [8].
Ung thƣ gan gồm hai dạng là ung thƣ gan nguyên phát và ung thƣ gan thứ
phát (di căn). Ung thƣ gan nguyên phát là ung thƣ xuất phát từ các loại tế bào gan
(hình 1). Ung thƣ gan thứ phát là do các tế bào ung thƣ của các cơ quan, bộ phận
khác trong cơ thể di chuyển theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và định
khu tại đây, hình thành khối u. Ung thƣ di căn gan không mang các đặc trƣng của
ung thƣ xuất phát từ gan, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập
tới ung thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thƣ tế bào biểu mô gan
(Hepatocellular Carcinoma - HCC) thƣờng gọi là ung thƣ gan [49].

Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan [49]

1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát
Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan
nguyên phát đƣợc phân thành các loại chính nhƣ sau [42]:

3


LuËn v¨n cao häc

-

Lª Lan Ph-¬ng

Ung thƣ tế bào biểu mô gan là dạng ung thƣ biểu mô hay gặp nhất trong ung

thƣ gan. Ung thƣ bắt nguồn từ các tế bào biểu mô, đây là loại tế bào gan chủ yếu, do
đó, HCC chiếm 85 - 95% các trƣờng hợp ung thƣ gan nguyên phát [32].
-

Ung thƣ tế bào ống mật, đây là dạng ung thƣ bắt đầu ở các đƣờng mật nhỏ

trong gan. Dạng ung thƣ này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% [32]. Nguy cơ mắc dạng
ung thƣ này sẽ tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật, loét đƣờng tiêu hóa hay nhiễm
các dạng ký sinh trùng trong gan.
-

Ung thƣ biểu mô hỗn hợp, đây là dạng ung thƣ hiếm gặp, tế bào ung thƣ gồm

cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật.
-

U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở ngƣời lớn. U

nguyên bào gan xuất hiện có thể do các gene hoạt động bất thƣờng.
-

Ung thƣ tế bào mạch là loại ung thƣ rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu

trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp nhƣ vinyl chlorid hoặc các
hóa chất gây ung thƣ.
1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan
Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thƣ gan,
song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thƣ là đa nhân tố và quá trình
tiến triển thành ung thƣ rất phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc [39]. Các yếu tố nguy
cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh nhƣ nhiễm
virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; các loại hóa chất nhƣ: rƣợu, aflatoxin B1,
vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu
hụt α1 - antitrypsin [38]. Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào
gan theo các con đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và
dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ (hình 2).

4


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan [13]

Theo số liệu hồi cứu năm 2006 của Wong và cộng sự (cs) cho thấy, nhiễm
HBV mạn tính đƣợc xem nhƣ là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến HCC. Các bệnh nhân
có phản ứng dƣơng tính với kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) có
nguy cơ phát triển thành HCC cao gấp 70 lần so với ngƣời có phản ứng âm tính
HBsAg. Nhiễm HBV là một bệnh phổ biến ở các nƣớc Đông Nam Á, Trung Quốc,
Đài Loan, Hàn Quốc, Châu Phi, tại những vùng này có tới 85% - 95% bệnh nhân
HCC dƣơng tính với HBsAg. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc HBV chèn
DNA của mình vào hệ gene ngƣời bệnh sẽ làm mất tính ổn định của nhiễm sắc thể,
hoạt hóa các gene gây ung thƣ hoặc gây bất hoạt các gene ức chế khối u nhƣ TP53.
Ngoài ra, các sản phẩm protein của HBV có thể gây rối loạn chu trình tế bào, tạo
điều kiện cho sự tiến triển của các tác nhân gây ung thƣ, đồng thời hoạt hóa các yếu
tố phiên mã và promoter của các gene cần thiết cho hoạt động sống của virus [38].
Nhiễm virus viêm gan C mạn tính cũng là một yếu tố nguy cơ dẫn đến ung
thƣ gan. Ở các nƣớc phát triển nhƣ Nhật Bản, Ý, Pháp và một số nƣớc thuộc Nam
Âu, tỷ lệ bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan C chiếm đa số [14]. Các nhà

5


Luận văn cao học

Lê Lan Ph-ơng

nghiờn cu ó phỏt hin ra rng protein lừi ca HCV cú th tỏc ng ti quỏ trỡnh
sinh trng t bo bng cỏch kỡm hóm hot ng phiờn mó ca promoter p53 [38].
ng nhim HCV v HBV lm tng nguy c mc ung th gan t 2 n 6 ln so vi
nhim c lp mt loi virus.
Aflatoxin l nhng cht gõy ung th cú c tớnh cao c hỡnh thnh khi
thc phm v nc b nhim nm Aspergillus flavus v Aspergillus parasiticus.
cỏc nc ang phỏt trin thuc Chõu Phi hay mt s ni Chõu , ngi dõn n
cỏc thc phm nhim aflatoxin thỡ nguy c mc ung th gan cng tng. Aflatoxin cú
th trc tip lm tn thng gene TP53 gõy bt hot protein p53. ng nhim
aflatoxin B1 (AFB1) v HBVs gõy ra bin i p53 gc serine 249. HBV lm hot
húa cỏc cytochrome P450 gõy bt hot quỏ trỡnh trao i AFB1 to ra cht gõy t
bin l AFB1-8,9-epoxide v cỏc hp cht cha oxy cú kh nng hot ng húa hc
mnh lm t bo mn cm vi AFB1 [14].
Ngoi ra, cỏc yu t khỏc nh tui, gii tớnh v chng tc cng gúp phn lm
tng nguy c b ung th gan. Nam gii cú nguy c b ung th gan cao hn n gii
t hai n ba ln. Mt s nghiờn cu v ni tit ó ch ra rng, th th hormone gii
tớnh cú biu hin thay i trong khi u HCC [29]. Kt qu iu tra dõn s M cho
thy nhng ngi gc Chõu cú t l ung th cao nht, ngi M da en cng cú
t l mc ung th cao hn so vi ngi da trng.
Ti Vit Nam, theo s liu thng kờ ti bnh vin Vit c trong nm 2008,
s bnh nhõn nam mc u gan cao gp 3 ln so vi bnh nhõn n; s bnh nhõn b u
gan cú phn ng dng tớnh vi HBsAg chim 65,9% tng s bnh nhõn u gan;
bnh nhõn u gan trong tui t 20 n 60 tui chim 73,88%, bnh nhõn u gan
thuc nhúm tui di 20 v trờn 60 tui ch chim 26,12% [ti liu cha cụng b].
1.1.3. Cỏc giai on ca ung th gan
Cn c theo Tiờu chun phõn k lõm sng Quc t bnh ung th (nm 1993),
thụng qua cỏc chn oỏn lõm sng, s dng k thut hỡnh nh xỏc nh kớch c
khi u nguyờn phỏt v tỡnh trng b xõm ln cỏc mch mỏu, cỏc giai on ca ung

6


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

thƣ gan đƣợc mô tả ở bảng 1 [45, 32]. Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thƣớc u,
hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thƣ gan còn đƣợc phân
loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I, II, IIIA/B/C và giai đoạn IV [32].
Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan [32]
Phân loại TNM

T

N

T1 - Có 1 khối u không xâm
lấn đến mạch máu xung quanh.
N0 - Không có hạch di căn.
M0 - Không có sự di căn tới
vùng xa.

Giai đoạn

Giai đoạn I
T1, N0, M0

T2 - Một khối u đã xâm lấn
mạch máu hoặc nhiều khối u
trên một lá gan, đƣờng kính u
không quá 5cm.

Giai đoạn II
T2, N0, M0

T3 - Có nhiều khối u đƣờng
kính lớn hơn 5cm hoặc một
khối u xâm lấn đến tĩnh mạch

Giai đoạn IIIA
T3, N0, M0

cửa hoặc phân nhánh chính của
tĩnh mạch cửa gan.

Giai đoạn IIIB

T4 - Một hoặc nhiều khối u
xâm lấn trực tiếp tới các cơ
quan khác hoặc làm thủng phúc
mạc tạng.
N1 - Có hạch bạch huyết di căn

T4, N0, M0
Giai đoạn IIIC
T bất kỳ
N1, M0
Giai đoạn IV
T bất kỳ
N bất kỳ
M1

M1 - Có di căn tới vùng xa

7


Luận văn cao học

Lê Lan Ph-ơng

1.1.4. Cỏc phng phỏp chn oỏn ung th gan
Gan c cu to ch yu bi cỏc t bo biu mụ gan, loi t bo ny cú kh
nng tỏi sinh mnh nh phõn bo liờn tc, do ú, ung th gan phỏt trin rt nhanh,
kớch thc gan cú th tng gp ụi sau 4 thỏng. Cỏc triu chng ca HCC thng
bc l khi bnh ó nghiờm trng v khi u ó ln, vỡ vy, vic phỏt hin HCC vo
giai on mun gõy khú khn trong vic iu tr, õy chớnh l lý do dn n t l t
vong do HCC rt cao, chim khong 70% cỏc trng hp t vong do ung th trờn
ton th gii [14].
Hin nay, phỏt hin HCC ch yu da vo vic xột nghim mỏu nh
lng alpha fetoprotein (AFP) trong huyt thanh. AFP l mt glycoprotein cú khi
lng 70kDa, c tng hp gan v tỳi noón hong ca thai, sau ú c tit vo
huyt thanh tun th 13 ca thai k. Sau khi sinh, nng AFP trong huyt thanh
gim v ngi bỡnh thng khe mnh ch cũn 3 - 5ng/ml, rt khú phỏt hin
c ngi trng thnh. AFP cú th c dựng sng lc ngi cú nguy c b
ung th gan cao [39]. Tuy vy, AFP trong mỏu khụng c trng cho ung th gan vỡ
nng AFP cú th cng tng trong mt s trng hp khỏc: thai nghộn bỡnh
thng, viờm gan giai on phc hi, viờm gan mn tớnh, ung th t bo mm nh
ung th tinh hon hay mc mt s dng ung th khỏc nh ung th d dy, ung th
ng mt [5]. Xột nghim AFP cng khụng nhy bi cú khong 15% - 30% bnh
nhõn ung th gan m hm lng AFP vn khụng tng [39], nht l i vi cỏc khi
u gan nh hn 3cm.
Hm lng AFP cao cú th ngh n ung th gan nhng khụng th l yu t
quyt nh chc chn. Vỡ th, chn oỏn ung th gan cn kt hp xột nghim nh
lng AFP v chn oỏn hỡnh nh bng siờu õm, chp ct lp vi tớnh hay chp cng
hng t cú th thy c hỡnh dng, kớch thc v kt cu ca khi u, nhng
chn oỏn chớnh xỏc u lnh tớnh hay ỏc tớnh thỡ nht thit phi sinh thit gan. Tuy
nhiờn, sinh thit gan gõy nguy c chy mỏu cao, dũ dch mt, vt bm mỏu v nhim
khun cú th xy ra, ng thi tng nguy c bin u lnh tớnh chuyn dng thnh ỏc

8


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

tính và thúc đẩy di căn [50]. Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan [26].
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ
Chỉ thị sinh học là các phân tử đƣợc tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ
thể hoặc trong mô đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý.
Chỉ thị sinh học có thể đƣợc dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác
đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định [46].
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ
Ngày nay, chỉ thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhất để
phát hiện sớm ung thƣ, xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lƣợng và theo
dõi điều trị ung thƣ nhằm kéo dài thời gian sống, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân
ung thƣ. Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thƣ, có
nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng
trƣởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thƣ là những chất do các tế bào hoặc
mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng
của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị
ung thƣ dạng tế bào bao gồm: các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể
hormone và thụ thể yếu tố tăng trƣởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của
tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm: các chất đƣợc phát hiện ở những
nồng độ không bình thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu, các loại dịch của
cơ thể [3].
Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chỉ thị ung thƣ có thể đƣợc phân loại
và đánh giá theo các tiêu chí sau [3]:
-

Đặc hiệu cao: chỉ thị ung thƣ không tìm thấy ở đối tƣợng khỏe mạnh hoặc u
lành tính.

-

Độ nhạy cao: chỉ thị ung thƣ dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tế
bào ung thƣ xuất hiện.

9


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

-

Đặc hiệu cơ quan: chỉ xuất hiện ở cơ quan bị ung thƣ.

-

Xuất hiện tƣơng quan với giai đoạn ung thƣ và kích thƣớc khối u.

-

Tƣơng quan với tiên lƣợng về thời gian sống.

-

Có giá trị dự báo.
Đối với ung thƣ gan, chỉ thị ung thƣ đƣợc ứng dụng theo hai hƣớng chính

sau [29]:
-

Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định đƣợc ung thƣ khi kích thƣớc

khối u còn nhỏ (< 3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu quả.
-

Xác nhận chẩn đoán ung thƣ ở những bệnh nhân có khối u lớn đã đƣợc phát

hiện nhờ chụp X quang.
1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ
Hiện nay, có ba cách tiếp cận đang đƣợc áp dụng rộng rãi để nghiên cứu các
chỉ thị sinh học phục vụ cho việc chẩn đoán phân tử, phát hiện sớm ung thƣ [17].
-

Sử dụng các kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gene lạ có liên

quan đến các loại ung thƣ riêng biệt. Tuy nhiên, kết quả của các nghiên cứu này mới
chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ không thể biết đƣợc nguy cơ thực
sự của bệnh.
-

Phƣơng pháp proteomics xác định đƣợc hầu hết các protein có triển vọng trở

thành các protein chỉ thị ung thƣ. Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác
đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lƣợng bệnh, dự đoán đƣợc các ảnh
hƣởng của việc điều trị và giúp phát triển lĩnh vực y học cá nhân. Hạn chế của
phƣơng pháp này là một số protein chỉ thị ung thƣ chỉ đƣợc tìm thấy ở trong mô ung
thƣ mà không có mặt trong máu.
-

Sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng

nguyên ung thƣ. Song do có hiện tƣợng phản ứng chéo trong phản ứng miễn dịch,
do đó, kết quả của phƣơng pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu.

10


Luận văn cao học

Lê Lan Ph-ơng

S kt hp cỏc phng phỏp trờn s lm tng tin cy cho cỏc ch th phõn
t, tng tớnh chớnh xỏc khi chn oỏn bnh. K thut proteomics õy cú vai trũ rt
quan trng, b sung cho k thut genomics v dũ tỡm khỏng th nhn dng khỏng
nguyờn khi u. K thut ny ó c ỏp dng rng rói nghiờn cu ch th phõn t
ca nhiu dng ung th khỏc nhau [17]. S phỏt trin ca cỏc k thut genomics,
proteomics giỳp chỳng ta m rng hiu bit v bn cht sinh hc ca ung th; ngy
cng phỏt hin v s dng c nhiu phõn t ch th vi nhy v tớnh c hiu
cao trong chn oỏn lõm sng.
1.2.3. Cỏc loi ch th sinh hc i vi ung th gan
i vi nghiờn cu ung th gan, cỏc phng phỏp trờn u ó c ỏp dng
tỡm ra cỏc ch th phõn t, bao gm c DNA v protein, c bit l cỏc khỏng th
c hiu. Mt trong nhng hng nghiờn cu quan trng nht l phõn tớch tỡm ra
cỏc ch th phõn t nhn dng kiu hỡnh ỏc tớnh ca t bo. Cỏc phõn t ch th
ny bao gm: cỏc phõn t tham gia vo quỏ trỡnh tng sinh t bo, gõy bin i
DNA; gene TP53; cỏc protein khỏc tham gia iu khin chu trỡnh t bo; cỏc gene
gõy ung th v cỏc th th ca chỳng; cỏc yu t liờn quan n s cht theo chng
trỡnh ca t bo v s hot ng ca telomerase. Mt hng nghiờn cu khỏc l tỡm
ra cỏc ch th phõn t liờn quan n quỏ trỡnh xõm ln v di cn ca ung th, cỏc ch
th phõn t loi ny gm cỏc phõn t bỏm dớnh (Adhesion), cỏc enzyme thy phõn
protein lm gim cht gian bo, cỏc yu t sinh trng tham gia vo s hỡnh thnh
mch giỳp khi u phỏ v v bc, di cn n cỏc v trớ khỏc trong c th...[31].
Cho n nay, ngoi AFP ó c xỏc nh cú giỏ tr, cú nhiu ch th sinh
hc khỏc ó c nghiờn cu chn oỏn HCC. Trong mt nghiờn cu tng quan
v ch th ung th gan, tỏc gi Hong Vn Sn (2011) ó lit kờ mt s ch th ung
th gan ang c nghiờn cu (bng 2). a s cỏc ch th mi ny vn ang c
nghiờn cu lõm sng, trong ú, ch th huyt thanh AFP-L3, des-gamma-carboxyprothrombin (DCP), glypican-3 (GPC-3) cú nhiu ha hn [5].

11


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) [5]
Loại

Chỉ thị trong
huyết thanh

Chỉ thị ở mô

STT

Tên chỉ thị sinh học

Năm công bố

1

AFP gắn LCA

1991

2

AFP gắn Lectin L3

1993

3

AFP gắn concanavalin

1995

4

DCP

1997

5

Methyl hóa gene P16

1999

6

Telomerase

2000

7

Transforming Growth Factor β1

2002

8

AFP monosialyl

2002

9

Insulin-like growth Factor II

2003

10

Glutamate carboxypeptidase

2003

11

NH2 Fragment GPC-3

2004

12

Telomerase reverse transcriptase mARN

2007

13

Interleukin-6

2009

14

Glypican-3

2009

15

Heat shock protein 70

2009

16

Glutamin synthetase

2009

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã công bố
nhiều chỉ thị ung thƣ nhằm phát hiện sớm, sàng lọc, chẩn đoán chính xác và theo
dõi điều trị HCC. Đa số các chỉ thị mới này hiện vẫn đang đƣợc nghiên cứu trên lâm
sàng. Do đó, hƣớng nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thƣ gan vẫn đang đƣợc triển
khai và tiếp tục phát triển. Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hƣớng
nghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein
này kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung
thƣ tiềm năng.

12


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ
Khi nghiên cứu ung thƣ thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự
kiểm soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thƣ. Mặc
dù, một số ung thƣ có thể lẩn tránh khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch bằng
nhiều cơ chế nhƣ dung nạp, kháng thể phong bế, gây suy giảm miễn dịch, nhƣng
phần lớn ung thƣ có đáp ứng miễn dịch [7].
Các tế bào ung thƣ có thể bị phân hủy bởi các tế bào tham gia đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu, gồm: đại thực bào, tế bào giết tự nhiên và bạch cầu ƣa axít.
Đáp ứng miễn dịch loại này không cần có kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu.
Trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống ung thƣ, vai trò của đáp ứng miễn dịch
dịch thể không rõ bằng đáp ứng miễn dịch tế bào, song các nghiên cứu cũng chứng
minh đƣợc sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thƣ. Nhiều nghiên cứu
ung thƣ ở động vật thực nghiệm đã chứng minh vai trò của tế bào T độc (Tc) trong
phân hủy tế bào khối u khi đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tế bào. Quá trình này đòi hỏi
phải hoạt hóa tế bào TCD8+ bởi các tế bào trình diện kháng nguyên có mang MHC
lớp I và các cytokin tƣơng ứng (Interleukin-2, Interleukin-4) [7].
1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ
Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng thành tế bào ung thƣ, quá trình này làm
xuất hiện các protein mà tế bào bình thƣờng không có hoặc có rất ít. Các protein
này là các kháng nguyên ung thƣ và “lạ” đối với cơ thể và trở thành đích của các tế
bào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Dƣới đây là một vài
loại kháng nguyên ung thƣ [7]:
-

Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ (Tumour specific transplantation

antigen - TSTA), kháng nguyên này đƣợc phát hiện khi ghép các mảnh ung thƣ. Khi
đó, TSTA sẽ kích thích cơ thể nhận sinh đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ ghép.
Đặc điểm TSTA của ung thƣ do hóa chất hoặc tia xạ là tính đặc hiệu kháng nguyên
phụ thuộc vào mô ung thƣ, chứ không phụ thuộc vào hóa chất gây ung thƣ. Ngƣợc

13


LuËn v¨n cao häc

Lª Lan Ph-¬ng

lại, TSTA của ung thƣ do virus gây ra có tính đặc hiệu phụ thuộc vào chủng virus,
không phụ thuộc vào mô ung thƣ. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống
TSTA chỉ mới đƣợc xác định trong thực nghiệm ghép ung thƣ.
-

Kháng nguyên đặc hiệu mô (Tissue specific antigen - TSA) là kháng nguyên

có trên bề mặt các tế bào bình thƣờng và có đặc tính riêng cho từng loại tổ chức.
Ung thƣ xuất hiện từ mô nào thƣờng biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu ở mô đó.
TSA không kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, song nó có thể sử dụng
làm đích cho miễn dịch điều trị và làm chỉ thị tìm nguồn gốc xuất phát mô ung thƣ.
-

Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ (Tumour associated antigen - TAA) là

kháng nguyên phát hiện đƣợc trong các loại ung thƣ mà không có hoặc có rất ít
trong tế bào mô bình thƣờng. Ở ngƣời, kháng nguyên này đƣợc xác định bằng các
kháng thể đơn dòng [7].
TAA là các peptide hay protein đặc hiệu khối u, chúng có thể biểu hiện tăng
hoặc giảm bất thƣờng, bị đột biến hay cuộn gấp sai gây ra đáp ứng miễn dịch ung
thƣ. Vì vậy, nghiên cứu nhằm tìm ra các chỉ thị ung thƣ là các TAA giúp chẩn đoán
sớm ung thƣ có vai trò quan trọng. Nhiều chỉ thị sinh học là các TAA đã đƣợc xác
định, nhƣ kháng nguyên ung thƣ phôi thai (Carcino embryonic antigen - CEA) đặc
trƣng cho ung thƣ ruột kết, protein AFP đặc trƣng cho ung thƣ gan, CA19-9 cho
ung thƣ dạ dày - ruột và CA-125 cho ung thƣ buồng trứng [34].
1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch
Hiện nay, các nghiên cứu xác định chỉ thị sinh học ung thƣ đang đƣợc tiến
hành theo hai hƣớng: hƣớng thứ nhất là xác định tự kháng thể trong huyết thanh của
bệnh nhân ung thƣ bắt nguồn từ những kháng nguyên ung thƣ. Hƣớng thứ hai là xác
định sớm ung thƣ dựa vào việc phát hiện ra các kháng nguyên liên quan đến khối u.
Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thƣ, trong khối
u xuất hiện các protein biểu hiện bất thƣờng, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã,
đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thƣ. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh các TAA gây ra đáp ứng miễn dịch sinh ra các kháng thể kháng TAA trong

14


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×